Study of fabomotizole belonging to p-glycoprotein substrates

I. V. Chernykh; Черных И. В.; A. V. Shchulkin; Щулькин А. В.; E. N. Yakusheva; Якушева Е. Н.; M. V. Gatsanoga; Гацанога М. В.; N. v Popova; Попова Н. М.

doi:10.23888/PAVLOVJ20174538-550

Изучение принадлежности фабомотизола к субстратам гликопротеина-p

Авторы: Черных И.В.¹, Щулькин А.В.¹, Якушева Е.Н.¹, Гацанога М.В.¹, Попова Н.М.¹
Учреждения:
1. Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова
Выпуск: Том 25, № 4 (2017)
Страницы: 538-550
Раздел: Фармакология, клиническая фармакология
Статья получена: 20.01.2018
Статья одобрена: 20.01.2018
Статья опубликована: 28.12.2017
URL: https://journals.eco-vector.com/pavlovj/article/view/7730
DOI: https://doi.org/10.23888/PAVLOVJ20174538-550
ID: 7730

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Гликопротеин-P (Pgp) – это мембранный эффлюксный белок-транспортер, к субстратам которого относится большое число лекарственных веществ. Ряд препаратов изменяет активность транспортера, что при полипрагмазии может служить причиной межлекарственных взаимодействий. Фабомотизол (афобазол) – это отечественный анксиолитик с нейропротекторной активностью, применяемый по широкому спектру показаний и, исходя из химической структуры, являющийся потенциальным субстратом Pgp.

Цель. Изучить принадлежность фабомотизола к числу субстратов Pgp.

Материалы и методы. Работа выполнена на 12 кроликах-самцах породы Шиншилла. Принадлежность фабомотизола к субстратам Pgp оценивали путем сравнения фармакокинетических параметров тестируемого вещества на фоне курсового введения известных индуктора и ингибитора белка-транспортера − рифампицина и верапамила соответственно. Животным однократно внутрижелудочно вводили фабомотизол в дозе 3,8 мг/кг и забирали кровь из ушной вены через 5, 10, 15, 20, 30, 60, 90, 120 и 240 мин с последующим анализом его фармакокинетики методом ВЭЖХ. Параметры фармакокинетики фабомотизола рассчитывали модельно-независимым методом вручную. Затем животные были разделены на 2 группы по 6 кроликов в каждой: 1-я группа получала верапамил в дозе 20 мг/кг 3 раза в день, вторая – рифампицин в дозе 20 мг/кг массы 14-дневным курсом. После введения модуляторов Pgp у животных повторно анализировалась фармакокинетика фабомотизола после его однократного применения.

Результаты. Было выявлено, что только коэффициент абсорбции фабомотизола на фоне рифампицина достоверно снижался в 1,27 раза по сравнению с параметром интактных животных (90%-й ДИ 0,66-0,94; p=0,04322). Однако это изменение не имело клинической значимости, т.к. 90%-й доверительный интервал значительно перекрывал диапазон 0,80-1,25. Остальные фармакокинетические параметры фабомотизола достоверно в обеих сериях не изменялись, таким образом фабомотизол не является субстратом Pgp. Выявленное незначительное участие Pgp в фармакокинетике фабомотизола свидетельствует о том, что препарат можно назначать совместно с лекарственными веществами-модуляторами активности транспортера без корректировки его дозы.

Выводы. В эксперименте in vivo на кроликах породы Шиншилла установлено, что фабомотизол не является субстратом белка-транспортера гликопротеина-P.

Ключевые слова

гликопротеин-P, фабомотизол, фармакокинетика, рифампицин, верапамил, субстрат

Полный текст

Гликопротеин-P (Pgp) − мембранный белок-транспортер, который использует энергию АТФ для эффлюкса из клеток различных по химической структуре эндо- и ксенобиотиков, среди которых большое число современных лекарственных средств. Активность транспортера изменяется под действием внешних и внутренних факторов, в том числе на фоне приема некоторых лекарственных веществ. Таким образом, транспортеру отводится значительная роль в развитии межлекарственных взаимодействий [1].

Фабомотизол (афобазол) – это оригинальный отечественный селективный анкиолитик с нейропротекторной активностью, широким спектром показаний к применению и безрецептурным отпуском из аптек [2]. По химической структуре фабомотизол является производным бензимидазола, содержащим в молекуле третичные атомы азота и водородные связи. Комплекс исследований показал, что субстраты Pgp – преимущественно липофильные ароматические соединения с молекулярной массой в диапазоне 300-500 Да, включающие водородные связи в молекуле, аминогруппу или атом азота, протонированный при физиологических значениях pH [3-5]. Подобные свойства характерны для фабомотизола (рис. 1), что позволяет предполагать его принадлежность к числу субстратов данного белка-транспортера.

Рис. 1. Химическая структура фабомотизола с указанием характеристических групп

В научной литературе исследований по оценке принадлежности фабомотизола к числу субстратов, индукторов и ингибиторов Pgp не обнаружено.

В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы явилась оценка принадлежности фабомотизола к субстратам Pgp для прогнозирования возможных межлекарственных взаимодействий и осуществления эффективной и безопасной фармакотерапии.

Материалы и методы

Работа выполнена на 12 половозрелых кроликах-самцах породы Шиншилла средней массой 3500-4300 г в соответствии с правилами лабораторной практики (Приказ Министерства здравоохранения РФ от 1 апреля 2016 г. №199н. «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики») [6].

Анализ принадлежности фабомотизола к субстратам Pgp проводили путем сравнения фармакокинетических параметров тестируемого вещества на фоне курсового введения известных индуктора и ингибитора белка-транспортера − рифампицина и верапамила соответственно. В случае участия Pgp в фармакокинетике тестируемого средства можно ожидать возрастания его концентрации в плазме крови после приема верапамила и обратные изменения после введения рифампицина [7].

Животным однократно внутрижелудочно вводили фабомотизол (таблетки Афобазол, 10 мг, ОАО «Фармстандарт-Лек-средства», Россия) в дозе 3,8 мг/кг [8, 9] в форме суспензии на воде очищенной. Далее забирали образцы крови из ушной вены через 5, 10, 15, 20, 30, 60, 90, 120 и 240 мин в объеме 5 мл с последующим анализом его фармакокинетики методом ВЭЖХ.

Определение концентрации тестируемого вещества в плазме крови выполняли методом абсолютной калибровки по площади пиков. Калибровочные растворы готовили добавлением к интактной плазме крови кроликов рассчитанного объема раствора стандарта фабомотизола, предоставленного разработчиками препарата, с концентрацией 10 мкг/мл. Матричный раствор (1 мг/мл) готовили на метаноле и хранили при температуре 4°С.

Исследование выполнялось в изократическом режиме. В качестве подвижной фазы применялась смесь ацетонитрил-вода-метанол-кислота уксусная ледяная-триэтиламин в соотношении 100-240-100-0,3-0,25 с pH 6,10. Время удерживания фабомотизола составило 10,00±0,11 мин. Пределы определения и детектирования – соответственно 3,4 и 7,8 нг/мл.

Калибровочную зависимость площади хроматографического пика от концентрации фабомотизола определяли в диапазоне концентраций 50-1000 нг/мл по 6 точкам, для каждой точки выполняли по 5 измерений. В указанном диапазоне концентраций зависимость «концентрация фабомотизола – площадь пика» носила линейный характер. Коэффициент корреляции Пирсона составил 0,99935. Уравнение регрессии имело вид: y=1,9994*x+10,536, где за x – площадь пика, y – концентрация фабомотизола.

Для экстракции целевого вещества из плазмы крови и приготовления подвижной фазы применяли следующие реактивы: ацетонитрил «для ВЭЖХ» (Merck, Германия), метанол «для ВЭЖХ» (Merck, Германия) кислота уксусная ледяная ХЧ (Экос-1, Россия), триэтиламин «для ВЭЖХ» (Lab-Skan, Польша).

Экстракция фабомотизола из плазмы крови осуществлялась эфиром диэтиловым (1,5 мл плазмы и 6 мл экстрагента) путем встряхивания на приборе Shaker при 400 об./мин в течение 10 мин, центрифугирования при 3500 об./мин в течение 10 мин и упаривания супернатанта при 40°С. Коэффициент экстракции составил 87%.

Для расчета метрологических характеристик и основных валидационных параметров разработанной методики применялись программы «Statistiсa 7.0» и «Microsoft Excel», а также руководство «Guidance for Industry. Bioanalytical Method Validation» (2013).

Фармакокинетические параметры фабомотизола рассчитывали модельно-независимым методом вручную.

После анализа фармакокинетики фабомотизола в норме животные были разделены на 2 группы по 6 кроликов в каждой: 1-я группа получала ингибитор Pgp – верапамил (таблетки, покрытые оболочкой, 80 мг, Валента Фармацевтика ОАО, Россия) в дозе 20 мг/кг 3 раза в день 14-дневным курсом [10] в форме суспензии на воде очищенной, вторая – индуктор транспортера – рифампицин (капсулы Рифампицин, 150 мг, ОАО «Фармасинтез», Россия) аналогичным курсом в дозе 20 мг/кг массы [11] в форме суспензии на крахмальном клейстере. После применения модуляторов Pgp животным повторно вводили фабомотизол и анализировали его фармакокинетику. Следует отметить, что последнее введение верапамила осуществлялось утром – перед введением фабомотизола, а рифампицина – вечером предыдущего дня.

Полученные результаты обрабатывали с помощью программы «StatSoft Statistica 7.0». Наличие достоверных различий между значениями Тmax фабомотизола оценивали с помощью критерия Вилкоксона, а полученные результаты представлены в виде медианы, нижнего и верхнего квартилей (Med, lq, uq). Статистическую значимость различий между фармакокинетическими параметрами, за исключением Тmax, оценивали исходя из представления о лог-нормальном распределении данных. Сравнение изучаемых фармакокинетических параметров проводили с применением дисперсионного анализа повторных измерений (ANOVA) после их логарифмирования. Статистически значимыми принимали различия при значении р<0,05. Дополнительно рассчитывали двухсторонний 90%-й доверительный интервал. Согласно рекомендациям U.S. Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research значимыми считаются различия между фармакокинетическими параметрами, если двухсторонний 90%-й доверительный интервал их отношения находится вне диапазона 0,8-1,25 (80-125%). Полученные результаты представлены в таблицах в виде среднего геометрического и его 95%-го доверительного интервала.

Результаты и их обсуждение

14-дневное введение кроликам-самцам ингибитора и индуктора Pgp – верапамила и рифампицина соответственно не приводило к изменениям фармакокинетических параметров фабомотизола, что отражено в таблицах 1 и 2.

Таблица 1. Фармакокинетические параметры фабомотизола до и после курсового введения рифампицина

Изучаемые параметры	Исходные значения, n=6	Рифампицин 14 дней, n=6	p
Сmax, нг/мл	381,81 (203,00; 718,11)	235,26 (158,13; 350,01)	0,1738
Тmax, мин	5,0 (5,0; 10,0)	5,0 (5,0; 5,0)	1,0000
T½, мин	88,26 (27,49; 283,38)	72,32 (47,35; 110,44)	0,59620
AUC0-t, (нг/мл)×ч	11568,47 (6037,34; 22166,98)	9005,91 (5979,30; 13564,52)	0,3352
AUC0-∞, (нг/мл)×ч	15768,75 (10440,89; 23815,35)	10625,97 (7556,48;14942,30)	0,1064
Cl, л/мин	0,24 (0,16; 0,36)	0,36 (0,25; 0,50)	0,1064
Cmax/AUC0-t, 1/мин	0,033 (0,027; 0,040)	0,026 (0,019; 0,035)*	0,04322
MRT, мин	127,35 (39,66; 408,92)	104,35 (68,33; 159,36)	0,59620
Kel, 1/мин	0,008 (0,002; 0,025)	0,010 (0,006; 0,015)	0,59620
Vd, 1/мин	30,69 (8,66; 108,72)	37,32 (18,76; 74,21)	0,6671

Примечание (таблицы 1 и 2): * – достоверные отличия от показателей интактных животных. Данные представлены в виде среднего геометрического и его 95%-го доверительного интервала. Значения Tmax представлены в виде медианы, нижнего и верхнего квартилей.

Таблица 2. Фармакокинетические параметры фабомотизола до и после курсового введения верапамила

Изучаемые параметры	Исходные значения n=6	Верапамил 14 дней, n=6	p
Сmax, нг/мл	413,02 (345,39; 493,90)	291,10 (168,23; 503,70)	0,11680
Тmax, мин	5,0 (5,0; 5,0)	10,0 (5,0; 17,5)	0,4795
T½, мин	62,59 (20,53; 190,85)	82,14 (26,53; 254,34)	0,5951
AUC0-t, (нг/мл)×мин	11067,60 (8638,72; 14179,41)	9741,60 (4929,07; 19252,89)	0,5242
AUC0-∞, (нг/мл)×мин	12539,24 (11246,22; 13980,92)	13313,00 (7139,04; 24826,31)	0,7449
Cl, л/мин	0,30 (0,27; 0,34)	0,29 (0,15; 0,53)	0,7449
Cmax/AUC0-t, 1/ч	0,037 (0,026; 0,053)	0,030 (0,020; 0,044)	0,2636
MRT, мин	90,32 (29,62; 275,40)	118,52 (38,28; 367,01)	0,5951
Kel, 1/мин	0,011 (0,004; 0,034)	0,008 (0,003; 0,026)	0,5951
Vd, 1/мин	27,37 (8,31; 90,21)	33,83 (7,80; 146,71)	0,7092

Усредненные фармакокинетические кривые фабомотизола интактных животных и кроликов после курсового введения ингибитора и индуктора Pgp представлены соответственно на рисунках 2 и 3.

Рис. 2. Усредненные фармакокинетические кривые фабомотизола в условиях нормы и на фоне 14-дневного введения верапамила

Рис. 3. Усредненные фармакокинетические кривые фабомотизола в условиях нормы и на фоне 14-дневного введения рифампицина

Из приведенных данных видно, что лишь коэффициент абсорбции фабомотизола (Cmax/AUC0-t) в серии применения рифампицина достоверно снижался в 1,27 раза по сравнению с аналогичным параметром интактных животных (90%-й ДИ 0,66–0,94; p=0,04322). Однако это изменение не имело клинической значимости, т.к. 90%-й доверительный интервал значительно перекрывал диапазон 0,80–1,25, отмеченный рекомендациями FDA. Слабовыраженная тенденция к снижению площади под фармакокинетической кривой (AUC0-∞) и аналогичное возрастание общего клиренса фабомотизола в данной серии, вероятно, связано с индукцией микросомальных ферментов печени под действием рифампицина и интенсификацией метаболизма тестируемого препарата [9].

В нашем исследовании не было обнаружено значимого изменения фармакокинетических параметров фабомотизола на фоне введения животным модуляторов активности Pgp. Однако на культурах клеток с множественной лекарственной устойчивостью показано, что ряд производных бензимидазола проникают в них в значительно меньшей степени, чем в нормальные клетки, что свидетельствует об их возможной принадлежности к субстратам Pgp [12]. Таким образом, фабомотизол не относится к числу субстратов Pgp, или роль транспортера в его всасывании, распределении и экскреции не является ключевой, хотя его химическая структура имеет признаки субстратной специфичность в отношении транспортера.

Выявленное нами незначительное участие Pgp в фармакокинетике фабомотизола свидетельствует о том, что препарат можно назначать совместно с лекарственными веществами-модуляторами активности транспортера без корректировки его дозы. Кроме того, проникновение фабомотизола через гематоэнцефалический барьер, где активно функционирует данный транспортер, будет достаточным для достижения минимальной терапевтической концентрации в ткани мозга, даже несмотря на его индукцию в условиях дефицита кислорода [6, 10]. Это подтверждается результатами многочисленных исследований эффективности фабомотиазола в качестве анксиолитика и нейропротектора [13, 14].

Вывод

В эксперименте in vivo на кроликах породы Шиншилла установлено, что фабомотизол не является субстратом белка-транспортера гликопротеина-P.

Конфликт интересов отсутствует.

Работа поддержана грантом РФФИ 16-44-620292 р_а.

Об авторах