Применение энтеросорбента на основе монтмориллонита при острой диарее (экспериментальное исследование)

Полный текст

Одним из самых распространенных заболеваний, имеющих водное или пищевое происхождение, является диарея. По данным ВОЗ, диарея является одной из ведущих причин смертности в мире. Несмотря на то, что смертность от диареи в последние годы сократилась, в 2015 году в мире от диарейных заболеваний погибло 1,39 млн человек, большинство из которых дети. Ежегодно регистрируется более 1,7 млрд случаев диареи в мире [1, 2].

В качестве адъювантной терапии острых диарей, в том числе и у детей, используется метод энтеросорбции [3, 4]. Особый интерес в этом отношении представляет минеральное сырье, в частности монтмориллонит. Монтмориллонит относится к слоистым минералам из группы смектита. Диоктаэдрический смектит, имеющий сходную с монтмориллонитом структуру, пользуется повышенным спросом у населения России [5]. Минералы смектитовой группы обладают противодиарейным и цитомукопротекторым эффектами, имеют высокую сорбционную активность в отношении токсинов бактерий при пероральном применении [6-11].

В настоящий момент на российском фармацевтическом рынке нет минерального энтеросорбента на основе отечественного сырья [12]. Разработка лекарственных препаратов на основе отечественных субстанций является актуальной задачей для здравоохранения и фармацевтической промышленности и согласуется со «Стратегией Фарма-2020» [13].

Цель исследования – провести доклиническое изучение противодиарейной активности энтеросорбента на основе монтмориллонита под лабораторным шифром Crim_04 на модели серотонин-индуцированной диареи.

Материалы и методы

Работа была выполнена на базе ФГАОУ «Белгородский государственный университет» в лаборатории доклинических исследований. Все этапы исследования были выполнены с соблюдением «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» [Directive 2010/63/EU].

Объект исследования

Объектом исследования явился опытный образец энтеросорбента под лабораторным шифром Crim_04 на основе монтмориллонита крымского месторождения, предоставленный ООО «Крымфармамед». Опытный образец энтеросорбента Crim_04 представляет собой порошок от желтоватого- или серовато-белого цвета до серовато- или коричневато-жёлтого цвета с запахом ванилина. Массовая доля монтмориллонита составляет 62,4%, серебра – 0,15%. Размер наиболее часто встречающихся частиц в суспензии составляет 7,08 мкм.

Препараты сравнения: энтеросорбент «Смекта» (Beaufuor Ipsen Industrie», Франция) и препарат лоперамид («Janssen-Cilag», Франция).

Лабораторные животные, экспериментальные группы

Исследования проведены на 140 лабораторных мышах обоего пола массой 25±2г. Животные были получены из вивария ФГАОУ «Белгородский государственный университет».

Диарею вызывали внутрибрюшинным введением серотонина гидрохлорида (5-гидрокситриптамин – 5-ГТ) (H9523, Sigma-Aldrich, США) в дозе 0,32 мг/кг (n=20 животных) [14]. Серотонина гидрохлорид применялся через 30 минут после внутрижелудочного введения энтеросорбентов и лоперамида. В группе интактных животных внутрибрюшинно применялся 0,9% раствора натрия хлорида 10 мл/кг (n=20 животных).

В экспериментальных группах животным внутрижелудочно однократно вводили водные суспензии энтеросорбентов Crim_04 в дозах 880 мг/кг, 1660 мг/кг, 3320 мг/кг и препарата «Смекта» в дозе 1660 мг/кг, лоперамида в эффективной дозе 10 мкг/кг, полученных с учетом пересчета доз со средней терапевтической суточной дозы для человека. В контрольной группе животные получали эквиобъемное количество 0,9% раствора натрия хлорида.

После моделирования патологии мыши по одной располагались на белом листе бумаги для оценки времени наступления диареи и подсчета количества дефекаций в течении 4 часов. Бумажное покрытие менялось каждый час. Для подсчета выраженности ингибирования (ВИ) диареи использовали следующую формулу:

ВИ(%)=[(Дк-Ди)/Дк]×100%,

где Дк – количество влажных и жидких дефекаций в контрольной группе, Ди – количество влажных и жидких дефекаций в исследуемых группах. Подсчет коэффициента выраженности диареи (КВД) осуществляли с помощью балльной шкалы оценки консистенции каловых масс: 1 балл – нормальные экскременты, 2 – полужидкие, влажные дефекации, 3 балла – жидкие дефекации. Показатель рассчитывался по формуле:

КВД=(N×1+S×2+L×3)/ΔD,

где N – количество нормальных экскрементов, S – количество полужидких экскрементов, L – количество жидких экскрементов, ΔD – общее количество дефекаций за время наблюдения. Стрессовые дефекации в начале эксперимента при подсчете общего количества каловых выходов в процессе эксперимента не учитывались.

По истечении 4 часов наблюдения животные под эфирным наркозом выводились из эксперимента.

Морфологическое исследование

Для гистологического исследования у животных забирали участки ткани тонкого кишечника. При этом участки тканей фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина, с последующей заливкой в парафин. Из полученных блоков готовили срезы толщиной 5-7 мкм. Окраску проводили гематоксилин-эозином. Микроскопическое исследование проводили на микроскопе «Микмед-6» (ЛОМО, Санкт-Петербург), анализ изображений осуществлялся с помощью программы «Микро-анализ Pro» (ООО «ЛОМО-Микросистемы», Санкт-Петербург).

Статистический анализ

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакетов программ Microsoft Excel 2010 и STATISTIKA 6.0 для Windows. Средние значения изучаемых показателей представлены в виде (М±m), где М – среднее арифметическое, а m – стандартная ошибка среднего. Для анализа различий показателей между группами использовали t-критерий Стьюдента. Достоверным считали различие сравниваемых показателей при p<0,05.

Результаты и их обсуждение

Было установлено, что внутрибрюшинное введение серотонина гидрохлорида в дозе 0,32 мг/кг в течении 15 минут вызывало диарею у 100% животных с выраженным увеличением количества дефекаций со значительным преобладаем водянистых каловых масс в сравнении с интактными животными (рис. 1).

 

Рис. 1. Дозозависимое влияние энтеросорбента под шифром Crim_04 на время наступления диареи (А, минуты), количество дефекаций (Б, число), консистенцию каловых масс (В, усл. ед.) при серотонин-индуцированной диарее у мышей.

Примечание: + – при p<0,05 в сравнении с группой интактных животных; * – при p<0,05 в сравнении с контрольной группой; а – p<0,05 в сравнении группой Crim_04 в дозе 880 мг/кг; b – p<0,05 в сравнении группой Crim_04 в дозе 1660 мг/кг; # – p<0,05 в сравнении с группой лоперамида

 

Как видно из рисунке 1 А применение энтеросорбента под шифром Crim_04 значительно задерживало наступление диареи. При этом диарея наступала более чем в 5,5 раза позже, чем в контрольной группе. Этот эффект был наиболее выражен при применении энтеросорбента в дозе 3320 мг/кг.

Применение энтеросорбента под шифром Crim_04 снижало количество дефекаций у мышей при моделировании серотонин-индуцированной диареи. При этом было установлено, что применение энтеросорбента Crim_04 в дозе 3320 мг/кг вызывало ингибирование развития диареи на 52,1%, что выражается в уменьшении количества влажных и жидких дефекаций по сравнению с контрольной группой. Этот результат достоверно выше, нежели в группах где энтеросорбент применялся в дозах 880 мг/кг и 1660 мг/кг (26,7% и 35,9% соответственно). Для «Смекты» и лоперамида этот показатель составил 34,8% и 73,8% соответственно (рис. 1 Б).

При внутрижелудочном введении энтеросорбента под шифром Crim_04 наблюдалось уменьшение содержания жидкости в каловых массах, дефекации были преимущественно влажные. Наиболее этот эффект выражен в группах животных, получавших энтеросорбент Crim_04 в дозе 3320 мг/кг (рис. 1 В).

Показатели энтеросорбента под шифром Crim_04 в средней терапевтической дозе 1660 мг/кг достоверно не отличались от эффекта диоктаэдрического смектита в такой же дозе. Вместе с тем, энтеросорбент под шифром Crim_04 и препарат «Смекта» значительно уступали лоперамиду по времени наступления диареи, общему количеству дефекаций и содержанию жидкости в каловых массах.

Морфологическое исследование

У животных контрольной группы макроскопически слизистая кишечника набухшая, отечная, розово-серого цвета, отдельными участками гиперемирована. Поверхность слизистой оболочки покрыта слегка мутной, полужидкой слизью, которая хорошо смывается водой.

Микроскопически слизистая отечна. Определяется укорочение и деформирование ворсинок. На концах некоторых ворсинок наблюдается слущивание эпителия с обнажением собственной пластинки сли-зистой. Определяется выраженная гипертрофия крипт. Кровеносные сосуды сли-зистой и подслизистого слоя полнокровны. Мышечная и серозная оболочки кишеч-ника без изменений. В просвете кишки большое количество слизи (рис. 2 Б). Эти изменения не были характерны для интактных животных (рис. 2 А).

 

Рис. 2. Гистологическая структура тонкой кишки у мышей (микрофото ×100): А – интактные животные; Б – контрольная группа; В – энтеросорбент Crim_04 в дозе 1660 мг/кг; Г – энтеросорбент Crim_04 в дозе 3320 мг/кг; Д – энтеросорбент «Смекта» 1660 мг/кг; Е – лоперамид 10 мкг/кг. Окр. гематоксилином и эозином

 

В группах животных, получавших энтеросорбент под лабораторным шифром Crim_04 в дозах 3320 мг/кг, патологические изменения тонкой кишки заключались в незначительном отеке слизистой оболочки. Участков гиперемии слизистой не наблюдалось. Явления слущивания эпителия были минимальны, участков обнажения собственной пластинки слизистой оболочки не наблюдалось. Кровенаполнение сосудов слизистой оболочки и подслизистого слоя было умеренным. Мышечный слой и серозная оболочка без патологических изменений (рис. 2 Г).

В контрольной группе с моделированием серотонин-индуцированной диареи выявлены уменьшение высоты ворсинок в 1,4 раза, увеличение ширины ворсинок у основания в 1,4 раза и глубины крипт в 1,2 раза по сравнению с интактными животными. Применение энтеросорбента под шифром Crim_04 в дозе 3320 мг/кг значительно улучшало гистологическую картину тонкой кишки, приближая морфометрические показатели к уровню интактных животных (рис. 3).

 

Рис. 3. Влияние энтеросорбента под шифром Crim_04 на отношение длины ворсинок к ширине ворсинок и длины ворсинок к глубине крипт в тонкой кишке мышей при моделировании серотонин-индуцированной диареи (усл. ед.).

Примечание: * – при p<0,05 в сравнении с группой интактных животных; ** – при p<0,05 в сравнении с контрольной группой; а – p<0,05 в сравнении с группой Crim_04 в дозе 880 мг/кг

 

 Серотонин является важной сигнальной молекулой, регулирующей секрецию кишечного эпителия, моторику стенок желудочно-кишечного тракта [15, 16]. Механизм слабительного действия серотонина заключен, по-видимому, в стимуляции им 5-HT3-рецепторов. Это приводит к повышению моторики желудочно-кишечного тракта, повышению кишечной секреции, как следствие накоплению в просвете кишки повышенного количества жидкости и её ускоренной эвакуации естественным путем [14, 17]. При моделировании серотонин-индуцированной диареи отмечалось раннее начало развития диареи у мышей (12,8±1,2 минут), резкое увеличение количества дефекаций и содержания в каловых массах жидкости (19,5±0,5 и 2,47±0,02 соответственно по сравнению с группой интактных животных – 7,9±0,04 и 1,0±0,0 соответственно).

Противодиарейный эффект энтеросорбента под шифром Crim_04 носил дозозависимый характер. Наибольшую активность энтеросорбент под шифром Crim_04 показывал в дозе 3320 мг/кг, что проявлялось увеличением времени наступления диареи, уменьшением общего количества дефекаций с уменьшением содержания жидкости в каловых массах на модели экспериментальной диареи. Этот эффект, по-видимому, связан с сорбцией излишне секретированной жидкости в просвете кишки, повышением плотности каловых масс и, как следствие, с уменьшением скорости продвижения каловых масс по кишечнику [18].

Вывод

Энтеросорбент на основе монтмориллонита под лабораторным шифром Crim_04 обладает дозозависимой противодиарейной активностью при моделировании серотонининдуцированной диареи.

Конфликт интересов отсутствует.

Исследование выполнено в ходе 1 этапа государственного контракта № 14.N08.11.0109 от 19.09.2016.

Об авторах

А. Н. Тишин

БУЗ ОО Орловская областная клиническая больница

Автор, ответственный за переписку.
Email: antoshatishin@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-8286-8967
SPIN-код: 3250-6576

терапевт

Россия, 302028, г. Орел, бульвар Победы, 10

М. В. Покровский

ФГАОУ ВО Белгородский государственный национальный исследовательский университет

Email: antoshatishin@yandex.ru
SPIN-код: 9201-3580

д.м.н., профессор, зав. кафедрой фармакологии

Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85

О. М. Тишина

ФКУЗ «Медико-санитарная часть УМВД России по Орловской области»

Email: antoshatishin@yandex.ru
SPIN-код: 7492-3519

терапевт

Россия, 302028, г. Орёл, ул. Салтыкова-Щедрина, 37

Л. Н. Сернов

ФГАОУ ВО Белгородский государственный национальный исследовательский университет

Email: antoshatishin@yandex.ru
SPIN-код: 5241-1276

д.м.н., профессор

Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85

А. А. Степченко

ГБОУ ВПО Курский государственный медицинский университет

Email: antoshatishin@yandex.ru
SPIN-код: 5747-3948

д.м.н., доцент

Россия, 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3

Список литературы

Дополнительные файлы