Распределение NADPH-диафораза позитивных структур обонятельной луковицы крыс в онтогенезе

Полный текст

 Изучение нейронов, содержащих нитроксидсинтазу, началось более 40 лет назад, когда гистохимически в тканях головного мозга были обнаружены клетки с высокой активностью NADPH-диафоразы (NADPH-d). Активность диафоразы в клетках определяется по восстановлению нитросинего тетразолия в диформазан и служит показателем наличия NO-синтазы [1]. Однако, возможны и ложноположительные результаты в связи с наличием нескольких изоформ данного фермента [2, 3]. Наибольшая активность фермента обнаруживается в нейронах мозжечка и в астроглии. Более низкий уровень активности наблюдается в гипоталамусе, среднем мозге, стриатуме, корковых представительствах, гиппокампе и продолговатом мозге [2, 4]. Нитроксидсинтазы (NOS) представляют собой семейство ферментов, катализирующих производство оксида азота (NO) из L-аргинина. В настоящее время описаны три изоферментные формы NOS: нейрональная (n-NOS, или NOS-1), индуцибельная цитокинами (i-NOS, или NOS-2) и эндотелиальная (e-NOS, или NOS-3) [2, 4].

Доказано, что NO является важной клеточной сигнальной молекулой, широко представлен в структурах нервной системы и может функционировать как ретроградный нейротрансмиттер. Функции NO чрезвычайно разнообразны: контролирует осцилляторную активность нейронов, является медиатором ноцицепции, термочувствительности, обоняния, модулирует сосудистый тонус и церебральный кровоток, участвует в ангиогенезе и развитии нервной системы [3], играет центральную роль в процессах долгосрочной потенциации и, соответственно, обучения и памяти [5]. Источником NO в центральной и периферической нервной системе являются неадренергические нехолинергические нервы и глутаматные нейроны, а также эндотелиоциты сосудов, клетки микроглии и астроциты. Установлено участие этого вещества в регуляции нейрогенеза, в том числе и в зрелом организме, путем запуска апоптоза избыточных прогениторных клеток (элиминация «ненужного» множества) [6]. Известно, что гистохимическим маркером нитроксидэргических нейронов является NADPH-d, которая метаболически связана с нейрональной NO-синтазой. Выявление NO-синтазы и NADPH-d в клетках пролиферативных зон головного мозга подтверждает роль оксида азота как модулятора и регулятора пролиферативных процессов в центральной нервной системе (ЦНС) [4].

Обонятельные луковицы (ОЛ) являются многофункциональными образованиями, в том числе и местом миграции нейробластов из субгранулярной зоны гиппокампа и субвентрикулярной зоны латеральных желудочков по ростральному миграционному потоку. Достигнув середины обонятельной луковицы, цепочки нейробластов распадаются, клетки начинают радиальную миграцию и достигают наружных клеточных слоев, где происходит их окончательная дифференцировка. Мигрирующие нейробласты расходятся в радиальном направлении во все слои ОЛ, формируя множественные синаптические контакты, интегрируясь в локальную нейронную сеть [5]. Известно, что нейроны, находящиеся на разных стадиях нейрогенеза, способны синтезировать множество различных специфических белков, сигнальных молекул, газомедиаторов, выявление которых свидетельствует о нейрональной дифференцировке потомков прогениторных клеток [7, 8]. В настоящее время данные о влиянии нитроксидэргических соединений на течение и активность нейрогенеза неоднозначны, отсутствуют детальные данные о распределении NADPH-d позитивных структур в различных слоях обонятельных луковиц крыс, что затрудняет оценку направленности компенсаторно-приспособительных реакций при экспериментальных воздействиях на ЦНС.

Цель исследования – установить особенности распределения NADPH-d позитивных структур в обонятельных луковицах крыс разного возраста.

Материалы и методы

Исследование проведено на 22 белых крысах самцах линии Wistar. Возраст исследуемых крыс выбирался в соответствии с возрастной периодизацией онтогенеза белой крысы, предложенной И.П. Западнюком с соавт. (1974) на основании физиологических особенностей животных, интенсивности их роста, поведенческих реакций, изменения характера питания, массы, функциональной зрелости системы крысы. Все этапы исследования были выполнены с соблюдением «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» (Directive 2010/63/EU).

Объект исследования – обонятельные луковицы новорождённых крыс – 1-3 суток, подсосного периода – 7, 14, 21 суток, инфантильного – 30 суток, ювенильного – 60 и зрелого – 180 суток. Забор материала осуществляли после предварительной транскардиальной перфузии 10% забуференным формалином с последующей фиксацией в течение 24 часов при температуре 4°С, промывки и хранения в течение суток в 30% растворе сахарозы. Исследование проведено на криостатных парасагиттальных серийных срезах правой и левой обонятельных луковиц толщиной 20 мкм. Для идентификации нитроксидэргических структур использовали гистохимическое маркирование NADPH-d. Активность NADPH-диафоразы определяли методом Хоупа (Hope, Vincеnt; 1989) [1]. Срезы инкубировали в среде, содержащей 0,5 мМ NADPH (Sigma, США), 0,5 мМ нитросинего тетразолиевого (Sigma, США), и 0,3% Тритона X-100 в 0,15 М Трис-HCL-буфере (рН-8,0) при 37°С в течение 60 мин, после чего срезы промывали в дистиллированной воде, обезвоживали и заключали в бальзам. Микроскопировали при помощи светового микроскопа Optica DM-20 (Италия, 2015) со встроенной камерой. На каждом стандартном срезе определяли количество позитивных нейронов. Стандартным считали парасагиттальный срез максимальной площади, проходящий через центральную зону ОЛ. Измеряли площадь NADPH-диафораза позитивных клеток по 100 в каждом случае, площадь гломерул, количество позитивных нейронов, окружающих гломерулу. По плотности распределения формазана в цитоплазме нейронов обонятельных луковиц выделяли три вида нервных клеток: нейроны с высокой, средней и низкой степенью активности NADPH-d. Анализ и обработку полученных изображений проводили с помощью программы ImageJ. Статистическую обработку данных проводили методом вариационной статистики с использованием пакетов Microsoft Excel 2010 и Statistica 10. Средние значения изучаемых показателей представлены в виде (М±m), где М – среднее арифметическое, а m – стандартная ошибка среднего. Для анализа различий показателей между группами использовали t-критерий Стьюдента. Статистически значимым считали различие сравниваемых показателей при p<0,05.

Результаты и их обсуждение

Использование парасагиттальных срезов, проходящих через длинник луковицы, позволило изучить распределение позитивных клеток во всех шести цитоархитектонических слоях, располагающихся в следующем порядке: слой обонятельного нерва, гломерулярный слой (клубочков), наружный плексиформный слой, слой митральных клеток, внутренний плексиформный слой, гранулярный слой (клеток зерен). В центре луковицы располагается окончание рострального миграционного потока – субэпендимальный слой, который плавно переходит в гранулярный слой (центральную зону луковицы).

По данным R. Spessert, S. Reuss, по морфологии в обонятельной луковице встречаются 5 типов нервных клеток: короткоаксонные клетки поверхностные и глубокие, митральные клетки, перигломерулярные клетки и гранулярные (клетки-зерна) [9]. Поверхностные короткоаксонные нейроны (ПКАН) располагаются в перигломерулярной области и в наружном плексиформном слое. Глубокие короткоаксонные нейроны (ГКАН) залегают в гранулярном слое вблизи его перехода в субэпендимальный слой. Митральные клетки в ОЛ располагаются поясом, формируя слой. Перигломерулярные клетки локализуются в гломерулярном слое, образуют ассоциации с клубочками, гранулярные нейроны – самая многочисленная субпопуляция одноименного слоя.

У половозрелых животных активность NADPH-d выявлялась в телах нейронов. Ядра нейронов не окрашивались. Во многих случаях NADPH-d-позитивные аксоны и дендриты были видны на большом протяжении, достигали соседних нейронов. При удалении NADPH из инкубационной среды окрашивания не наблюдалось. Внутри клубочкового слоя интенсивность окрашивания значительно различалась. Наиболее ярко окрашивались клубочки, расположенные дорзально.

Активность NADPH-d выявлена в поверхностных и глубоких короткоаксонных, перигломерулярных и части гранулярных нейронов. Митральные клетки всегда негативны. Аналогичное распределение активности фермента у половозрелых крыс описывали B. Samama, C. Crespo [10, 11]. Данных о возрастных особенностях распределения конечного продукта реакции на диафоразу в литературе не обнаружено, но при оценке полученных данных нами выявлены различия топографии и плотности распределения конечного продукта. Рассмотрим их по слоям и по возрастам.

 

 

Рис. 1. NADPH-d – позитивные клетки гранулярного слоя ОЛ 14 суточных животных. А – гранулярные клетки с низкой позитивностью. Б – субпопуляция гранулярных клеток со средней позитивностью фермента. Гистохимическое окрашивание по методу Hope, Vincеnt (1989). Ув. об. 100 (А), 40 (Б)

 

В гранулярном и субэпендимальном слоях ОЛ у 1 суточных животных единственными NADPH-d позитивными нейронами являются глубокие короткоаксонные нейроны Гольджи (ГКАН) количеством 8,7±0,85 штук на стандартном срезе. Это крупные мультиполярные нейроны с высокой плотностью распределения продукта реакции, формазан плотно заполняет цитоплазму клеток, отчетливо маркируя отростки нейронов на значительном протяжении. Средняя площадь этих нейронов составляет 126,2±13,64 мкм². Максимальное их скопление определяется в области перехода дистальной части рострального миграционного потока в субэпендимальный слой ОЛ (рис. 2Б).

У семисуточных крысят в гранулярном и субэпендимальном слоях ОЛ число ГКАН на стандартном срезе увеличивается до 12,7±0,50 штук (p<0,05), а также увеличивается средняя площадь их сечения до 170,4±18,30 мкм² (p<0,05).

У 14 суточных животных в гранулярном слое выявлялись нейроны с низкой и средней активностью фермента, отличающиеся крупным ядром, тонким ободком цитоплазмы, с двумя длинными позитивными отростками, направленными радиально (рис.1А, 1Б). Остальные нейроны гранулярного слоя являются ферментонегативными. ГКАН субэпендимального слоя проявляют самую высокую активность фермента, количество их увеличивается по сравнению с новорожденными в 2 раза, достигая 16,7±0,68 штук на стандартном срезе. Средняя площадь нейронов этой субпопуляции составляла 325,7±16,40 мкм² (рис. 2А, 2Б). Отростки, как правило, ветвятся, в некоторых местах оплетают сосуд, формируют выраженный нейропиль (рис. 2В).

В сроки от 14 до 21 суток количество ГКАН снижается до 12,1±0,60 (р<0,05).

В возрастных группах от 21 суток до 180 суток в гранулярном слое количество позитивных ГКАН на стандартном срезе достоверно не изменяется, активность фермента в цитоплазме остается высокой. Клетки со средней и низкой активностью фермента не выявляются.

Митральные клетки во всех исследуемых возрастных группах животных не обладали нитроксидэргической позитивностью. Активность NADPH-d в слое обонятельного нерва высокая и не зависит от возраста животных.

В области перехода гломерулярного слоя в наружный плексиформный слой выявляются крупные, одиночные биполярные с высокой активностью NADPH-d нейроны (поверхностные короткоаксонные нейроны Блэйнса, ПКАН). Данные клетки, ориентированы параллельно ряду митральных клеток. Количество этих нейронов на стандартном срезе не превышает 1-2 штуки, площадь колеблется от 160 до 210 мкм² независимо от возраста (рис. 2Г).

 

Рис. 2. NADPH-d – позитивные клетки субэпиндемального слоя ОЛ 14 суточных животных. А, Б, В – субпопуляция ГКАН Гольджи с высокой позитивностью фермента и выраженным нейропилем. Г – Одиночные диафораза-позитивные ПКАН Блэйнса. Гистохимическое окрашивание по методу Hope, Vincеnt (1989). Ув. об. 10 (А), 100 (Б), 40 (В, Г)

 

В гломерулярном слое ОЛ крысы в первом полугодии жизни также отмечаются выраженные возрастные особенности распределения фермента. Слой гломерул у новорожденных животных развит слабо и представлен расположенными в один ряд в основном на дорзальной поверхности и верхушке ОЛ сверхпозитивными овальными клубочками (рис. 3А). Площадь клубочков составляет 1107,9±117,96 мкм². Перигломерулярные нейроны позитивностью к NADPH-d не обладают.

У семисуточных крысят клубочки выстроены в ряд по периметру луковицы, вокруг них лежат позитивные перигломерулярные нейроны. Они представляют собой мелкие округлой формы клетки, большинство которых обладает средней позитивностью NADPH-d, неравномерно окружают гломерулы по 4-8 штук каждую. Средняя площадь перигломерулярных нейронов составляет 42,9±5,33 мкм². Нейропиль этих нейронов негативен (рис. 3Б).

У животных двухнедельного возраста площадь клубочков увеличивается в 3 раза (2998,1±513,13мкм²). Клубочки располагаются вплотную друг к другу, группируясь по 3-4 образования. Максимальной ферментопозитивностью обладают гломерулы, расположенные дорзально и на верхушке ОЛ. Гломерулы на вентральной поверхности проявляют среднюю и низкую активность. Каждую единичную гломерулу окружают 5-16 клеток, обладающих позитивным перикарионом с единственным отростком, направленным к гломеруле (рис. 3В, 3Г). Средняя площадь их сечения возрастает до 51,9±2,86 мкм².

У животных 21 суток средняя площадь гломерул максимальна и составляет 4225,5±314,80 мкм². Количество и морфология перигломерулярных клеток не изменяется (рис. 3Д, 3Е). Средняя площадь этих нейронов составляет 65,1±4,43 мкм².

 

Рис. 3. Распределение NADPH-d позитивных структур в гломерулярном слое ОЛ животных разного возраста. А – гломерулы (клубочки) со средней позитивностью фермента (1 сут.). Б – гломерулы со средней позитивностью фермента с одиночными NADPH-d-позитивными перигломерулярными клетками и сосудами (7 сут.). В – гломерулы с высокой позитивностью фермента дорзальной поверхности ОЛ (14 сут.). Г – гломерулы с низкой позитивностью фермента с ассоциацией перигломерулярных клеток вентральной поверхности ОЛ. (14 сут.). Д – гломерулы с высокой позитивностью фермента дорзальной поверхности ОЛ (21 сут.). Е – гломерулы с низкой позитивностью фермента с ассоциацией перигломерулярных клеток вентральной поверхности ОЛ. (21 сут.). Гистохимическое окрашивание по методу Hope, Vincеnt (1989). Ув. об. 10

 

У одномесячных и шестимесячных животных морфология клубочков по сравнению с 21-суточными практически не меняется, размеры клубочков достигают максимума на 30 сутки (3724,4±316,15 мкм²), а к 180 суткам постепенно снижаются до 2504,2±133,23 мкм². Площадь и количество перигломерулярных позитивных клеток в эти сроки наблюдения сохраняются на достигнутых значениях.

Во всех возрастных группах центральные части гломерул обладают позитивностью к NADPH-d, клубочки дорзальной поверхности и верхушки ОЛ сверхпозитивны, а на вентральной поверхности обладают средней и низкой позитивностью, причем распределение диафоразы зависит не от возраста, а от локализации гломерулы: высокой активностью отличаются гломерулы дорзальной поверхности ОЛ, а низкой и средней активностью гломерулы вентральной поверхности. Это может служить дополнительным доказательством функциональных различий между клубочками обонятельной луковицы, что отмечено в работах R. Spessert и E. Layes [9]. Позитивность клубочков возможно связана с активностью диафоразы первичных обонятельных сенсорных аксонов, входящих в клубочки [12].

Т.о., NADPH-d выявляется в трех разнородных субпопуляциях нейронов ОЛ, и возрастные изменения их количества и активности этого фермента, аналогичного активности NO-синтазы [4, 13], имеют специфические и общие черты.

ГКАН выявляются уже с рождения, обладают высокой активностью, их количество на стандартном срезе увеличивается на протяжении 21 суток в 2 раза и, начиная с этого возраста, не изменяется. За время наблюдения площадь нейронов этой популяции увеличивается почти в 2 раза. Локализация этих клеток в устье рострального миграционного потока, т.е. в области максимального скопления нейрональных предшественников, указывает на их роль в регуляции клеточного состава ОЛ, а участие NO в регуляции апоптоза нейронов описано в работах H.G. Kuhn и C. Crespo [6, 11]. Сходная возрастная динамика активности NADPH-d описана в некоторых ядрах гипоталамуса в работах Д.К. Обухова, В.И. Дунай, L. Villani [4, 14, 15], выполненных на рыбах, свинках и крысах.

ПКАН, расположенные в области перехода гломерулярного слоя в наружный плексиформный слой являются очень малочисленными, обладают высокой активностью и не увеличиваются в размерах на протяжении 180 суток наблюдения. Учитывая параллельное поверхности направление отростков этих клеток, можно считать их субпопуляцией ассоциативных тормозящих нейронов, т.к. многие авторы описывают в этой зоне ГАМК-позитивные нейроны [8, 11]. Также можно предположить, что короткоаксонные нейроны являются одиночными активными клетками, которые участвуют в регуляции кровотока в микроциркуляторном русле через газомедиаторную NO-систему.

Перигломерулярные нейроны характеризуются низким или средним уровнем активности фермента. Причем на протяжении наблюдения активность в них постепенно нарастает от нулевой у новорожденных до средней у 14 суточных крысят. Размеры и количество перигломерулярных нейронов достигают дефинитивного уровня уже к 21 суткам и более достоверно не изменяются. Такое раннее созревание субпопуляции происходит параллельно снижению активности нейрогенеза, выявленному в предыдущих работах по показателю активности его маркеров [13].

Выводы

1. В результате исследования установлено, что в обонятельной луковице крыс изученных возрастных групп, от новорождённого возраста до 180 суток, позитивность к NADPH-d проявляют только поверхностные и глубокие короткоаксонные нейроны, локализованные в субэпендимальном, наружном плексиформном слое, и перигломерулярные нейроны.
2. Каждая из субпопуляций обладает собственной динамикой становления активности изученного фермента.
3. Возрастные преобразования позитивных субпопуляций нейронов свидетельствуют об активном участии NO в процессах постнатальной дифференцировки, роста и развития обонятельной луковицы.

Конфликт интересов отсутствует.

Об авторах

В. Е. Варенцов

Ярославский государственный медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: carabidolog@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4724-9466
SPIN-код: 8232-7696

ассистент кафедры анатомии человека

Россия, 150000, Ярославль, ул. Революционная, 5

Т. А. Румянцева

Ярославский государственный медицинский университет

Email: carabidolog@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8035-4065
SPIN-код: 7086-0780

д.м.н., профессор, заведующий кафедрой анатомии человека

Россия, 150000, Ярославль, ул. Революционная, 5

Т. С. Мясищева

Ярославский государственный медицинский университет

Email: carabidolog@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1731-2716
SPIN-код: 8232-7696

студентка 5 курса лечебного факультета

Россия, 150000, Ярославль, ул. Революционная, 5

Список литературы

Дополнительные файлы