Возможные пути фармакологической коррекции ишемических повреждений печени с помощью агониста периферических имидазолиновых рецепторов с7070

Полный текст

Ишемия является как пусковым моментом, так и этапом патогенеза многих патологических состояний [1]. Как при сахарном диабете, так и при метаболическом синдроме в виде коморбидного состояния развивается жировая дистрофия печени, переходящая далее в некроз печени [2]. Препараты терапии метаболического синдрома и сахарного диабета не оказывают достаточного протекторного влияния на поражённую печень. В этой связи несомненный интерес представляет изучение возможности дополнительной фармакологической коррекции стандартной терапии бигуанидами [3].

В связи с этим изучение плейотропных гепатопротекторных свойств агониста периферических имидазолиновых рецепторов C7070 видится интересным с прикладной точки зрения.

Материалы и методы

Исследование гепатотропной противоишемической активности проводилось с использованием методики, описанной Д.А. Лопатиным [4]. Эксперимент проводился на 70 крысах обоего пола, разделённых на 7 групп: интактная группа, ложнооперированные животные (вскрытие брюшной стенки без лигирования печёночных сосудов); животные с моделированной ишемией/реперфузией, не получающие терапию каким-либо препаратом; животные с моделированной ишемией / реперфузией, получающие терапию препаратом метформин (50 мг/кг); животные с моделированной ишемией/реперфузией, получающие терапию препаратом моксонидин (1 мкг/кг); животные с моделированной ишемией / реперфузией, получающие терапию препаратом С7070 (10 мг/кг); животные с моделированной ишемией / реперфузией, получающие терапию препаратом С7070 (10 мг/кг) с одновременным введением антагониста периферических имидазолиновых рецепторов BU224 (BU224 hydrochlori-desolid, Sigma-Aldrich, Switzerland).

Все указанные дозировки соответствовали минимальной терапевтической дозе выбранного препарата с пересчётом на крыс, согласно общеупотребительным формулам. Дозировка С7070 была выбрана исходя из минимальной терапевтической дозировки ближайшего аналога – Диакамфа (Украина).

Перед наложением модели животным однократно вводились препараты и физиологический раствор per os. Животных наркотизировали путём внутрибрюшинного введения раствора хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг. Наркотизированному животному выполнялась срединная лапаротомия по белой линии живота. Тупым способом выделялась большая печёночная связка, в которой проходят основные сосуды, кровоснабжающие печень. Указанная связка пережималась атравматичным зажимом на 15 минут. После этого, содержимое брюшной полости укладывалось на место, а операционная рана послойно ушивалась. Животным в течение 3 суток вводились исследуемые препараты и физиологический раствор per os.

По окончании 3 суток после эксперимента животных подвергали эвтаназиипосредством передозировки ингаляционного эфирного наркоза (диэтиловый эфир) с последующим забором крови из сердца для биохимических исследований и выделением всей печени для проведения морфологического анализа.

Смертности животных во время эксперимента не отмечалось.

Для оценки функции печени были выбраны биохимические маркёры повреждения гепатоцитов: аланинаминотрансфераза (АЛТ) и аспартатаминотрансфераза (АСТ), в крови, взятой внутрисердечно у подопытных крыс непосредственно перед эвтаназией (по окончании 3 суток эксперимента) [5]. Биохимические параметры оценивались на биохимическом анализаторе Olympus AU 640. Указанные параметры определяли с использованием наборов реактивов Olympus: «ASТ/GOT (ASPARTATE AMINOTRANSFERASE)», «ALТ/GPT (ALANINE AMINOTRANSFE-RASE)» соответственно.

Для оценки структурных изменений были сделаны гистологические срезы препаратов печени экспериментальных крыс с их последующей морфологической оценкой [6]. Морфологическая оценка структурных повреждений печени производилась на базе ОБУЗ «Областное патологоанатомическое бюро» комитета здравоохранения Курской области согласно внутренним стандартам бюро. Препараты окрашивались стандартной смесью гемотоксилина и эозина с последующей цифровой микроскопией и планиметрическим расчётом обнаруженных площадей с помощью компьютерного ПО Adobe Photoshop CC (2015.2).

Для статистического анализа полученных данных применялось попарное сравнение групп с использованием T-критерия Стъюдента (для параметрических множеств) и U-критерия Манна-Уитни (для непараметрических множеств). Предварительно, были посчитаны средняя (M) и ошибка средней (m). Все расчёты проводились с использованием компьютерного ПО Statistica 10.0. Все различия, полученные в ходе сравнения параметров, полученных у разных групп животных, а также все изменения принимались статистически значимыми при p<0,05.

Результаты и их обсуждение

Моделирование 15-ти минутной ишемии печени с последующей реперфузией приводило к увеличению уровней АЛТ и АСТ на 3-и сутки эксперимента, соответственно, в 5 раз (табл. 1). Показатели ложнооперированных животных достоверно не отличались от интактных. Одновременно, морфометрические измерения площадей зоны ишемических повреждений и некроза составили 0,387±0,014 и 0,207±0,021 мм² соответственно (табл. 2).

 

Таблица 1. Влияние агонистов имидазолиновых рецепторов на уровень печеночных трансаминаз (АЛТ, АСТ) при моделировании ишемии / реперфузии печени (M±m, n=10)

Группа животных	АЛТ(Ед/мл)	АСТ(Ед/мл)
Интактные	102,89±8,82	284,14±19,36
Ложнооперированные	110,27±21,96*	289,80±16,29*
Ишемия/реперфузия (И/Р)	526,90±17,97**	1045,16±80,02**
И/Р+С7070 (10 мг/кг)	143,27±16,931	395,85±33,311
И/Р+Моксонидин (1 мкг/кг)	289,86±15,271	687,71±28,371
И/Р+Метформин (50 мг/кг)	332,56±22,051	825,49±22,461
И/Р+С7070 (10 мг/кг)+BU224 (10 мг/кг)	300,45±19,441	798,59±21,341

Примечание: *–p>0,05 в сравнении с группой интактных животных; **– p<0,05 в сравнении с группой ложнооперированных; ¹ – p<0,05 в сравнении с группой ишемии/реперфузии

 

Таблица 2. Влияние агонистов имидазолиновых рецепторов на площадь зоны ишемических повреждений печени и площадь зоны некроза печёночной ткани при моделировании ишемии / реперфузии печени (M±m, n=10)

Группы животных	Площадь зоны ишемических повреждений, мм2	Площадь зоны некроза, мм2
Интактные	н/д	н/д
Ложнооперированные	н/д	н/д
Ишемия/реперфузия (И/Р)	0,387±0,014	0,207±0,021
И/Р+С7070 (10 мг/кг)	0,058±0,029*	0,046±0,013*
И/Р+Моксонидин (1 мкг/кг)	0,090±0,025*	0,075±0,015*
И/Р+Метформин (50 мг/кг)	0,238±0,052*	0,125±0,020*
И/Р+С7070 (10 мг/кг)+BU224 (10 мг/кг)	0,159±0,031*	0,104±0,008*

Примечание: *-p<0,05 в сравнении с группой ишемии/реперфузии

 

Применение исследуемых препаратов статистически значимо снижает уровень ферментов в крови подопытных животных. Наибольшей активностью из представленных препаратов обладал С7070 (10 мг/кг), где уровень АЛТ и АСТ составил, соответственно 143,27±16,93 и 395,85±33,31 (табл. 1). Параллельно, С7070 значительно и достоверно снижал площадь ишемических повреждений и некроза до значений 0,058±0,029 и 0,046±0,013. Вместе с этим, моксонидин и метформин также снижали биохимические маркеры и показатели морфометрии, но уступали С7070 (табл. 1-2).

Для удобства оценки, целесообразно сравнить степень снижения уровня печёночных трансаминаз у разных групп животных. С этой целью возможно применение простой математической формулы:

 $K_{АЛТ}=100-\frac{АЛТ(эксп.)}{АЛТ(к-ль)}*100\%$,

где АЛТ (эксп.) – уровень АЛТ в крови животных экспериментальных групп, АЛТ (к-ль) – уровень АЛТ в крови животных контрольной группы.

Та же формула применима и для исследования уровня АСТ:

${К}_{АСТ}=100-\frac{АСТ(эксп.)}{АСТ(к-ль)}*100\%$,

где АСТ (эксп.) – уровень АСТ в крови животных экспериментальных групп, АСТ (к-ль) – уровень АСТ в крови животных контрольной группы.

Используя описанную выше формулу, получаем следующие данные функциональной протекции препаратов (табл. 3).

 

Таблица 3. Гепатопротекторная активность С7070, моксонидина и метформина при моделировании ишемии/реперфузии печени по данным биохимических исследований (М±m; n=10)

Коэффициент гепатопротекторной активности, Ед.	С7070 (10 мг/кг)	Моксонидин (1 мкг/кг)	Метформин (50 мг/кг)
КАЛТ	72,81±1,71*	44,99±1,23	36,88±1,02
КАСТ	62,13±1,34*	34,20±1,21	21,02±1,49

Примечание: * – р<0,05 в сравнении с коэффициентами, полученными при терапии моксонидином и метоформином

 

Исходя из приведённых данных, становится понятным, что агонист периферических имидазолиновых рецепторов (IR₂) С7070 обладает наибольшей противоишемической активностью среди изученных в рамках данной работы препаратов.

Для полной оценки противоишемической активности препаратов оценки аминотрансфераз недостаточно. Для оценки гепатопротекторной активности препаратов был выведен коэффициент, характеризующий степень защиты печёночной ткани от повреждений, полученных в результате ишемии и последующей реперфузии печени. Данный коэффициент учитывает, как зоны ишемического повреждения, так и зоны некроза.

Коэффициент высчитывался по формуле: 

$К=100\%-(\frac{Ми(преп.)+Мн(преп.)}{Ми(к-ль.)+Мн(к-ль)}*100\%)$,

где Ми(преп.) – средняя площадь ишемических повреждений печени у крыс экспериментальных групп, Мн(преп.) – средняя площадь некроза печени у крыс экспериментальных групп, Ми(к-ль) – средняя площадь ишемических повреждений печени у крыс контрольной группы, Мн(к-ль) – средняя площадь некроза печени у крыс контрольной группы.

Таким образом, мы получаем данные противоишемической и гепатопротекторной активности исследуемых препаратов (табл. 4).

 

Таблица 4. Гепатопротекторная активность С7070, моксонидина и метформина при моделировании ишемии/реперфузии печени по данным морфометрических исследований (М±m; n=10)

№ п/п	Группа животных	Коэффициент гепатопротекторной активности, Ед.
1.	И/Р+С7070 (10 мг/кг)	82,61±3,22*
2.	И/Р+моксонидин (1 мкг/кг)	72,33±1,04
3.	И/Р+метформин (50 мг/кг)	38,96±5,69

Примечание: * – р<0,05 в сравнении с пп. 2 и 3.

 

Таким образом, среди всех изученных в рамках данного исследования препаратов, агонист периферических имидазолиновых рецепторов С7070 обладает наивысшей гепатопротекторной активностью в условиях ишемии/реперфузии печени.

Полученные данные можно объяснить различием в механизмах действия препаратов. Основным в механизме действия метформина является уменьшение продукции глюкозы печенью, что, по данным многочисленных исследований, коррелирует со снижением уровня гликемии. Метформин играет роль в улучшении периферических эффектов инсулина, снижении глюконеогенеза и окислении свободных жирных кислот в печени, повышении активности анаэробного пути метаболиза глюкозы с образованием лактата, подавлении липолиза. В ряде исследований, проводимых in vivo и in vitro выявлено активирующее влияние метформина на клеточный фермент АМФ-киназу, которая играет роль в переносе глюкозы через мембрану посредством GLUT4 и окислении свободных жирных кислот. Вероятно, улучшение гликемического профиля на фоне терапии данным препаратом также связано с подобными клеточными аспектами механизма его действия. Кроме того, диметилбигуанид продемонстрировал способность уменьшать жесткость клеточных мембран, которая часто наблюдается у пациентов с сахарным диабетом и может вносить вклад в развитие его осложнений [7].

Метформин активизирует АМФ-активируемую протеинкиназу (АМФК) – печёночный фермент, играющий немаловажную роль в инсулиновой сигнализации, а также во всём энергетическом балансе организма и метаболизме глюкозы и жиров, в том числе и в печени. Активация АМФК необходима для ингибирующего эффекта метформина на печёночный глюконеогенез [8].

Резюмируя вышесказанное, можно утверждать, что противоишемическое действие метформина основано на кумулировании энергетических запасов гепатоцитов и замедлении расходования текущих сформированных запасов питательных веществ.

Моксонидин, являясь агонистом центральных имидазолиновых рецепторов (IR₁), участвует в перераспределении печёночного кровотока за счёт раскрытия коллатералей, исходящих из a. Gastrica sinistra, остававшихся свободными от пережатия. Также, дополнительная активность может быть обусловлена центральным влиянием моксонидина на раскрытие печёночных сосудов в момент реперфузии печени. Нельзя исключать и определённого влияния моксонидина на периферические имидазолиновые рецепторы [9].

Агонист периферических имидазолиновых рецепторов (IR₂) С7070 реализует своё гепатопротекторное действие при ишемии/реперфузии печени по механизмам, аналогичным при ишемизации кожного лоскута. Очевидно, что его влияние на сохранность митохондрий реализуется, в том числе, через АТФазные каналы, представленные на внешней и внутренней мембранах митохондрий. Замедление и блокирование лавинообразного тока ионов железа, в свою очередь, снижает оксидативный стресс со всеми его проявлениями при реперфузии печени [10].

Активация имидазолиновых рецепторов приводит к увеличению синтеза арахидоновой кислоты и ингибированию Na⁺/H⁺ ионообменных каналов. Есть основания предполагать, что имидазолиновые рецепторы относятся к семейству нейроцитокиновых рецепторов [11]. Активация центральных I₁−рецепторов снижает артериальное давление и уменьшает частоту сердечных сокращений. Все это является следствием воздействия на периферическую симпатическую нервную систему, заключающегося в её центральном торможении.

За время известности нового поколения имидазолиновых агонистов было проведено множество доклиничеких и клинических исследований эффективности этих лекарственных препаратов.

Так, например, есть данные, что внутривенное применение моксонидина вызывает у крыс увеличение диуреза, экскреции натрия и калия. Этот эффект полностью блокировался селективным антагонистом имидазолиновых рецепторов эфароксаном и ослаблялся под влиянием блокатора α-адренорецепторов йохимбина [12].

Центральные I₁−рецепторы гипоталамической области вовлечены в регуляцию уровня гликемии крови, что показано в эксперименте с селективным агонистом I₁−рецепторов агматином, вызывающим снижение уровня глюкозы в крови. Аналогичным действием обладает и моксонидин. Кроме того, предполагается, что имидазолиновые рецепторы локализуются в поджелудочной железе и их активация приводит к увеличению секреции инсулина [13].

Применение моксонидина у крыс линии Zucker (модель ожирения) вызывало снижение уровня гипоталамического нейропептида Y, что может быть одним из механизмов, объясняющих снижение массы тела на фоне терапии этим препаратом [14].

Следует отметить, что не все перечисленные эффекты можно объяснить за счет активации центральных I₁−рецепторов. По-видимому, некоторые из них, все же опосредуются α₂−адренорецепторами. Кроме того, определенный вклад вносит и периферическое действие лекарств.

Представители харьковской фармакологической школы, напротив, обратили внимание на способность агонистов периферических имидазолиновых рецепторов влиять на гликемический контроль [15]. Согласно их исследованиям, препараты этой группы по своему гипогликемическому действию не уступают метформину. А вот нежелательных побочных явлений у них гораздо меньше. Кроме того, в отличие от метформина, агонисты периферических имидазолиновых рецепторов не вызывают гипопротеинемию и гиперлактацидемию.

Помимо прочих локализаций, имидазолиновые рецепторы расположены и на мембранах адипоцитов – клеток жировой ткани. Стимуляция этих рецепторов приводит к усилению метаболизма липидов.

При лечении моксонидином (0,4 мг/сут) в течение 8 недель 20 пациентов с АГ наблюдалось достоверное снижение АД, но уровни общих липидов, окисленных липопротеидов низкой плотности и соотношение различными подтипов липопротеидов низкой плотности достоверно не изменялись [16].

Ввиду вышесказанного, становится очевидным преимущество агонистов периферических имидазолиновых рецепторов (IR₂) как препаратов, влияющих на снижение структурных и функциональных повреждений печени в условиях её ишемии/реперфузии.

Выводы

1. Агонист имидазолиновых рецепторов II типа С7070 в дозе 10 мг/кг в 4,5 раза предотвращает повышение уровней АЛТ и АСТ и в 2,5 раза уменьшает площади ишемических повреждений и некроза при моделировании 15-ти минутной ишемии печени. Гепатопротекторный эффект С7070 на 50% снимался антагонистом периферических имидазолиновых рецепторов BU224 (10 мг/кг).
2. Моксонидин обладает менее выраженным гепатопротекторным действием, и снижает площади ишемических
   повреждений и некроза до 3,9-4,5 раз. Коэффициенты гепатопротекторной активности моксонидина по данным лабораторных исследований составили соответственно 44,99 и 36,88 для АЛТ и АСТ. Коэффициент гистологической гистопротекторной активности моксонидина составляет 72,33.
3. Метформин на треть снижает площади ишемических повреждений и некроза по данным морфометрических коэффициентов и, лишь, на 50% восстанавливает уровни АЛТ и АСТ после предшествующей ишемии/реперфузии печени. Коэффициенты гепатопротекторной активности метформина для АЛТ и АСТ составили соответственно 34,20 и 21,02. Коэффициент гистологической гепатопротекторной активности метформина составил 38,96.
4. По гепатопротекторной активности изученные препараты уступали С7070 (72,81/62,13/82,61 АЛТ/АСТ/гистология соответственно).

 

Конфликт интересов отсутствует.

Исследование произведено в рамках совместной работы по государственному контракту от «10» декабря 2014 г. №14411.2049999.19.109 "Доклинические исследования антидиабетического лекарственного средства – агониста имидазолиновых рецепторов".

Авторы благодарят ОБУЗ «Областное патологоанатомическое бюро» комитета здравоохранения Курской области за проведение морфологического исследования препаратов печени крыс.

Об авторах

А. П. Довгань

Белгородский государственный национальный исследовательский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: dr.dovgan@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6941-4020
SPIN-код: 9406-8460

ассистент кафедры фармакологии и клинической фармакологии

Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85

С. В. Поветкин

Курский государственный медицинский университет

Email: dr.dovgan@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1302-9326
SPIN-код: 5412-3120

д.м.н., профессор, зав. кафедрой клинической фармакологии

Россия, 305004, Курская обл, г. Курск, ул. Карла Маркса, д. 3

Г. А. Батищева

Воронежский государственный медицинский университет им. Н.Н. Бурденко

Email: dr.dovgan@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4771-7466
SPIN-код: 2285-1917

д.м.н., профессор, зав. кафедрой клинической фармакологии

Россия, 394036, Воронежская обл, г. Воронеж, ул. Студенческая, д. 10,

А. А. Должиков

Белгородский государственный национальный исследовательский университет

Email: dr.dovgan@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8866-8993
SPIN-код: 7584-3080

д.м.н., профессор кафедры анатомии и гистологии

Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85

М. В. Покровский

Белгородский государственный национальный исследовательский университет

Email: dr.dovgan@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1493-3376
SPIN-код: 9201-3580

д.м.н., профессор, зав. кафедрой фармакологии

Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85

Ж. С. Урожевская

Белгородский государственный национальный исследовательский университет

Email: dr.dovgan@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5874-1763
SPIN-код: 3360-1887

аспирант кафедры фармакологии и клинической фармакологии

Россия, 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85

Список литературы

Дополнительные файлы