Пространственная реконструкция компактной части черного вещества головного мозга человека

Полный текст

Общеизвестно, что физиологическое старение и болезнь Паркинсона (БП) проявляются морфологическими изменениями черного вещества (ЧВ) головного мозга. Вместе с тем, возрастную инволюцию ЧВ характеризует естественная убыль нейронов [1], а болезнь Паркинсона – избирательная гибель дофаминовых нейронов в его компактной части [2]. Интенсивность и однородность количественных изменений нейронов в структурах ЧВ как в условиях физиологического старения, так и в условиях патологии – БП, возможно оценить с помощью морфометрического исследования. Вместе с тем, углубленная оценка количественных изменений клеточных структур ЧВ основана на исследовании соответствующих параметров отдельных скоплений нейронов, составляющих это образование мозга. В связи с этим, выдвигались различные варианты разделения ЧВ на отдельные клеточные структуры. В одном из них ЧВ делилось на две зоны – черную (компактную часть), представленную 21 группой пигментированных нейронов, и красную (ретикулярную часть), состоящую из слабопигментированных клеток [3]. Другие авторы объединяли в 6 обособленных групп дофаминовые нейроны, расположенные в области среднего мозга [4], а дофаминовые нейроны ЧВ группировали по нигросомам – зонам иммунореактивности кальбиндина – кальцийсвязывающего белка, содержащегося в нигростриатных афферентных волокнах и клеточном нейропиле [5]. Кроме того, были предложены схемы разделения компактной части ЧВ мозга человека на области, доступные для изучения морфометрическими методами [6].

На основе подобных схем и классификаций у лабораторных животных был проведен анализ распределения холинергических [7] и дофаминовых нейронов [8] в ЧВ головного мозга, и описаны модели пространственной структурной организации ЧВ. В то же время, сведений, характеризующих подобные трехмерные модели организации нейронных структур компактной части ЧВ мозга человека, в доступной нам литературе мы не нашли.

Цель работы – уточнить особенности морфохимической организации ЧВ мозга человека и провести пространственную реконструкцию структур его компактной части.

Материалы и методы

Нейронные структуры ЧВ исследовали на аутопсийном мозге лиц, не имевших в анамнезе сведений о неврологической патологии и умерших от интеркуррентных заболеваний в возрасте от 52 до 84 лет (10 случаев). Средний возраст составил 71 год. Материал был получен из коллекции лаборатории функциональной морфохимии Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научный центр неврологии» (ФГБНУ НЦН). Протокол исследования был одобрен Локальным этическим комитетом ФГБНУ НЦН (протокол №63/17 от 25.05.2017).

Образцы среднего мозга, отобранные для исследования, фиксировали в 4% растворе формалина, подвергали стандартной гистологической обработке и заключали в парафиновые блоки, которые раскладывали на последовательные серии фронтальных срезов толщиной 10 мкм. Часть срезов окрашивали 1% раствором крезилового фиолетового по методу Ниссля, другую часть использовали для проведения иммуногистохимических реакций. Дофаминовые нейроны выявляли иммуногистохимически по локализации тирозингидроксилазы (ТГ), используя поликлональные кроличьи антитела к тирозингидроксилазе (Sigma, №T8700) в разведении 1:1500. Для выявления связывания антител применяли набор Thermo Fisher Ultra Vision на основе полимерной системы детекции с щелочной фосфатазой. При проведении окрашивания руководствовались протоколами производителей антител. Препараты изучали и документировали с помощью микроскопа «Leica DMLB» (Германия), оснащенного цифровой фотокамерой «Leica DC300» (Германия).

Для объемной реконструкции и морфометрии из каудальных двух третей ЧВ отбирали серии из 2535 срезов, с интервалом между сериями – 0,2 мм. Окрашенные срезы мозга сканировали с помощью слайдсканера «Plustek Opticfilm 8200i» (Китай), используя разрешение 3600 dpi. Для выполнения трехмерной реконструкции серии срезов выравнивали в соответствии с анатомическими ориентирами и обрабатывали с помощью программы «Image J» (свободное программное обеспечение, National Institutes of Health, США). Полученные изображения использовали для локализации групп клеток в исследуемых структурах. С изображений срезов, окрашенных крезиловым фиолетовым, получали карты распределения нейронов, отмечая тела нейронов вручную при помощи графического планшета «Wacom».

Изображения срезов, окрашенных на тирозингидроксилазу, сегментировали по яркости для выделения границ дофаминергических структур. При помощи программы «FreeD» (некоммерческое программное обеспечение, Institut JeanPierre Bourgin, Франция) [9] на изображениях выделяли области наибольшей локальной плотности нейронов в ЧВ и границы других структур среднего мозга, затем проводили трехмерную реконструкцию на основе полученных контуров клеточных скоплений. Полученную пространственную модель ЧВ сглаживали и создавали ее окончательное изображение в программе «Blender» (свободное программное обеспечение, Blender Foundation, Нидерланды). Подробнее использованные методы были описаны нами ранее [10].

Морфометрическое исследование проводили c помощью программы «Leica QWin Standart v.2.6» (лицензионное программное обеспечение, Leica Microsystems Imaging Solution, Serial № 4563, Великобритания). Оценивали плотность расположения нейронов в структурах компактной части ЧВ на срезах, окрашенных по методу Ниссля (объектив х40, окуляр x10). Для этого подсчитывали их количество в поле зрения микроскопа на всей глубине среза, а затем пересчитывали число нервных клеток на единицу объёма (0,1 мм³). Кроме того, в этих же структурах оценивали интенсивность иммуноокрашивания на ТГ в условных единицах (от 0 до 255). Работу проводили на восьмибитных изображениях, полученных при увеличении объектива x4, при этом учитывали фоновое окрашивание, и вычисляли медианные значения по группе на разных уровнях по рострокаудальной оси.

Полученные результаты обрабатывали в программе «GNU PSPP v.1.01» (свободное программное обеспечение, Free Software Foundation, США). Плотность расположения нейронов в структурах компактной части ЧВ сопоставляли, используя критерий Стьюдента для сравнения групп с попарнонезависимыми вариантами.

Результаты и их обсуждение

На неокрашенных макропрепаратах – фронтальных срезах среднего мозга структуры ЧВ выявлялись в виде отдельного тяжа темнокоричневого цвета (рис. 1,а). При окрашивании по Нисслю в ЧВ различали две зоны скоплений нейронов (рис. 1,б): одна из них прилежала к ножке мозга и была более густоклеточной, другая располагалась ниже и латеральнее красного ядра. Границы ЧВ определяли по локализации дофаминовых нейронов и их отростков (рис. 1,в), а местоположение этого образования мозга по отношению к другим структурам ствола – при помощи пространственной реконструкции, проведенной по срезам среднего мозга, окрашенным на ТГ (рис. 2,а).

На полученной трехмерной модели пространственной организации ЧВ, построенной на основании срезов среднего мозга, окрашенных по Нисслю, компактная часть ЧВ (рис. 2,б) была представлена 9ю тяжами, состоящими из скоплений групп нейронов, и эти тяжи были ориентированы в рострокаудальном направлении. При проецировании построенной модели на плоскость в компактной части ЧВ выделили 4 области: медиальную, латеральную, дорсальную и вентральную (рис. 2,б).

Морфометрическое исследование плотности расположения нейронов в выделенных нами областях компактной части ЧВ показало, что плотность их расположения была выше в медиальной и вентральной области, чем в латеральной и дорсальной областях (рис. 3,а).

Оценка интенсивности иммуногистохимического окрашивания на ТГ в этих областях (за исключением латеральной области) обнаружила наибольшую экспрессию ТГ в медиальной области ЧВ (рис. 3,б).

Проведенное исследование позволило уточнить пространственную локализацию скоплений групп нейронов в ЧВ мозга людей старших возрастных групп и разграничить компактную часть ЧВ на отдельные области, доступные для изучения методами математической морфологии. Работы по трехмерной реконструкции черной субстанции мозга крыс и мышей демонстрируют сходное цитоархитектоническое деление компактной части ЧВ грызунов на три или четыре области, в зависимости от того, выделяют ли авторы медиальную область [8, 11]. Вместе с тем, повидимому, группы дофаминовых нейронов ЧВ грызунов являются менее дифференцированными, по сравнению с человеком, что выражается в отсутствии четко различимого сегментарного разделения отделов ЧВ и подтверждается как настоящей работой, так и другими авторами [12].

 

Рис. 1. Локализация черного вещества на поперечном срезе среднего мозга человека. а – макропрепарат, фиксация формалином; б – окраска методом Ниссля; в – иммуногистохимическое выявление тирозингидроксилазы. ЧВ – черное вещество; 1,2 – вентральная, редкоклеточная, и дорсальная, густоклеточная, области, соответственно; пунктир с точкой – границы компактной части ЧВ

 

Рис. 2. Объемная реконструкция черного вещества среднего мозга человека. а – границы и относительное расположение в среднем мозге дофаминергических структур черной субстанции по локализации тирозингидроксилазы (синим); б – объемная организация нейрональных скоплений в каудальных 2/3 черного вещества, на основе окрашивания крезиловым фиолетовым. ЧВ – черное вещество; НМ – ножка мозга; КЯ – красное ядро. Группы нейронов черной субстанции (1-9): медиальная область – 1,2; дорсальная область – 6-8; вентральная область – 3-5; латеральная область – 9

 

Рис. 3. Количественные показатели областей черной субстанции. а – плотность распределения нейронов на 0,1 мм3; б – распределение интенсивности окрашивания (в условных единицах яркости) на тирозингидроксилазу в каудо-ростральном направлении (по оси абсцисс – номера срезов через 0,2 мм). Д – дорсальная область; В – вентральная область; М – медиальная область; Л — латеральная область

 

Согласно результатам нашего исследования, компактная часть ЧВ головного мозга человека состоит из 9 тяжей (представляющих собой скопления групп нейронов), которые при сопоставлении с данными литературы [13] соответствуют следующим сегментам: вентромедиальному – тяжи 1 и 2, промежуточному – тяж 3, вентролатеральному – тяжи 4 и 5, дорсомедиальному – тяж 6, дорсолатеральному – тяжи 7 и 8. Латеральной части дорсальной области соответствует тяж 9. Предложенная нами пространственная модель ЧВ головного мозга показывает неполное соответствие при сравнении с другими вариантами организации ЧВ [14, 15], что выражается выявленной нами большей детализацией структур этого образования мозга. Такое несоответствие, возможно, обусловлено тем, что один из упомянутых выше вариантов разделения ЧВ предполагал изучение зон иммунореактивности кальбиндина, и оба варианта – не предполагали применение методов трехмерной реконструкции.

Морфометрическое исследование компактной части ЧВ показало, что плотность расположения нейронов в медиальной области была выше, чем в других областях компактной части ЧВ (за исключением вентральной), и интенсивность окрашивания на ТГ в медиальной области была наибольшей, что соответствует результатам других исследователей [13]. В связи с этим, можно предположить, что у лиц старших возрастных групп инволютивные изменения в меньшей степени затрагивают медиальную область этого образования головного мозга. По данным литературы, разные группы дофаминовых нейронов среднего мозга отличаются не только локализацией и своими связями, но и различной уязвимостью к действию повреждающих факторов в эксперименте, при нейродегенеративной патологии и при физиологическом старении [16]. Причины этого до конца не выяснены, но предполагают, что в основе избирательной устойчивости отдельных групп дофаминовых нейронов лежат различия их нейрохимического профиля, обусловливающие их подверженность окислительному стрессу [17].

Заключение

Таким образом, пространственная структурная морфохимическая организация черного вещества головного мозга человека отличается тем, что на всем его протяжении выявляли скопления нейронов, входящих в состав 9 тяжей, ориентированных в рострокаудальном направлении, которые при проецировании на горизонтальную плоскость формировали 4 области: медиальную, латеральную, дорсальную и вентральную. Морфометрическое исследование этих областей позволило обнаружить, что медиальная область черного вещества оказалась менее подверженной возрастной инволюции.

Об авторах

Дмитрий Николаевич Воронков

ФГБНУ Научный центр неврологии

Автор, ответственный за переписку.
Email: neurolab@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-5222-5322
SPIN-код: 1576-8871

к.м.н., старший научный сотрудник лаборатории функциональной морфохимии отдела исследований мозга 

Россия, г. Москва

Владимир Николаевич Сальков

ФГБНУ Научный центр неврологии

Email: neurolab@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-1580-0380
SPIN-код: 1459-9812

д.м.н., старший научный сотрудник лаборатории функциональной морфохимии отдела исследований мозга 

Россия, г. Москва

Рудольф Михайлович Худоерков

ФГБНУ Научный центр неврологии

Email: neurolab@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-6951-3918
SPIN-код: 4647-8405

д.м.н., заведующий лабораторией функциональной морфохимии отдела исследований мозга

Россия, г. Москва

Список литературы

Дополнительные файлы