Влияние аргинина на активность и компартментализацию лизосомальных цистеиновых протеиназ паренхиматозных органов при оксидативном стрессе на фоне экспериментальной гипергомоцистеинемии

Полный текст

Гомоцистеин является промежуточным продуктом цикла обмена метионина и обладает выраженным цитотоксическим действием, в том числе за счет провокации образования свободных радикалов, влекущего за собой развитие оксидативного стресса [1]. В настоящее время в качестве наиболее значимого проявления оксидативного стресса рассматривается окислительная модификация белков, поскольку данный процесс не только вызывает образование стабильных и удобных для измерения и последующей трактовки маркеров, но и существенно меняет разнообразные функции этих биомолекул [2], приводя к ранее трудно объяснимым нарушениям функций клеток и тканей на фоне свободнорадикальной патологии. Наибольшее значение придается необратимому окислению белков с образованием карбонильных производных [3]. Такие белки утрачивают нативные функции и формируют агрегаты, подлежащие деградации. В качестве агентов такой деградации могут выступать различные виды клеточных и внеклеточных протеиназ, в том числе лизосомальные. Наибольший интерес здесь представляют лизосомальные цистеиновые протеиназы изза доказанной способности не только расщеплять захваченные в ходе эндоцитоза белки, но и перемещаться в цитоплазму сквозь избыточно проницаемую по разным причинам лизосомальную мембрану [4]. Следует отметить, что несмотря на значительное количество работ, увязывающих повышение уровня гомоцистеина в крови с развитием различных патологических состояний, детализация механизмов тканевых изменений остается актуальной. Поскольку в предшествующих исследованиях нами были обнаружены изменения активности лизосомальных цистеиновых протеиназ и проницаемости лизосомальных мембран в миокарде на фоне гипергомоцистеинемии и продемонстрировано корректирующее действие аргинина на указанные процессы [5], целью данного исследования стала оценка влияния аргинина на активность и внутриклеточное распределение катепсинов B, L, H в ткани печени, почки и легкого при экспериментальной гипергомоцистеинемии и развивающегося на ее фоне окислительного повреждения белков.

Материалы и методы

Исследование выполнено на 32 конвенциональных половозрелых крысахсамцах линии Wistar. Содержание и выведение животных из эксперимента осуществлялось в соответствии с протоколами, изложенными Международным Советом Медицинских Научных Обществ (CIOMS) в «Международных рекомендациях по проведению медикобиологических исследований с использованием животных» (1985) и правилами лабораторной практики – Приложение к приказу Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 г. №708н.

Моделирование выраженной гипергомоцистеинемии [6] проводили внутрижелудочным введением метионина в качестве субстрата для синтеза гомоцистеина в виде суспензии, приготовленной на 1% крахмальном растворе с добавлением 10% твина80, в дозе 1,5 г/кг ежедневно 2 раза в сутки в течение 21 дня (n=8). Суспензия вводилась экспериментатором с участием ассистента с помощью стеклянного градуированного шприца с зондом. Объём вводимой суспензии зависит от массы животного и не превышает 1,5 мл. Выведение животных из эксперимента осуществлялось на 22е сутки.

Животным контрольной группы (n=8), контроль 1, таким же образом внутрижелудочно вводилась суспензия, не содержащая метионин (состав по массе: 10% твина80, 1% крахмала, 89% воды) в течение 21 дня. Выведение животных из эксперимента осуществлялось на 22е сутки.

Для изучения эффектов аргинина на фоне выраженной гипергомоцистеинемии выборке животных (n=8) вводили аргинин per os 1 раз в сутки в дозе 500 мг/кг на 0,9% растворе NaCl в течение 10 суток [7] параллельно с введением метионина по схеме, описанной выше (с 12 по 21 сутки введения метионина).

Животным контрольной группы (n=8) осуществляли введение аргинина per os 1 раз в сутки в дозе 500 мг/кг на 0,9% растворе NaCl в течение 10 суток параллельно с введением суспензии, не содержащей метионин, по схеме, описанной выше – контроль 2. Выведение животных из эксперимента осуществлялось на 22е сутки.

При выведении животных из эксперимента эвтаназия осуществлялась под эфирным наркозом обескровливанием при сохраненном дыхании и сердцебиении, после чего немедленно извлекались печень, почка и легкое. Органы раздельно помещали в охлажденный 0,25 М раствор сахарозы, очищали от остатков жировой и соединительной ткани, промывали средой выделения и готовили точные навески с использованием электронных весов (AJH220 CE, Япония). Гомогенизация тканей осуществлялась в холодном 0,25 М растворе сахарозы в соотношении 1:10 на гомогенизаторе «Potter S» (Sartorius, Германия) в стеклянном стакане тефлоновым пестиком при зазоре 0,160,24 мм. Скорость вращения составляла 1000 об/мин для почки и легкого и 900 об/мин для печени, время гомогенизации – 50 и 35 секунд соответственно.

Субклеточное фракционирование полученных гомогенатов осуществляли последовательным центрифугированием: 15 мин при 800 g для удаления не полностью разрушенных клеток и ядер, 15 мин при 14000 g для удаления митохондрий и 30 мин при 20000 g для осаждения лизосом. Полученный при заключительном центрифугировании супернатант представлял собой цитоплазматическую (неседиментируемую) фракцию гомогената, осадок (седиментируемая фракция) – грубую фракцию лизосом. Для проведения дальнейших исследований осадок ресуспендировали в 0,25 М сахарозе с добавлением Тритона Х100 в конечной концентрации 0,1%.

Концентрацию гомоцистеина определяли в сыворотке крови коммерческим набором «AxisShield» (США) методом иммуноферментного анализа, концентрацию белка в неседиментируемой и седиментируемой фракциях гомогенатов – по методу Лоури коммерческим набором НПЦ «Экосервис» (Россия, СПб).

Для оценки выраженности окислительной модификации белков осуществляли измерение уровня карбонильных производных в неседиментируемой фракции гомогенатов по R.L. Levine в модификации Е.Е. Дубининой спонтанном и металлиндуцированном варианте [8] с регистрацией продуктов реакции (динитрофенилгидразонов) на спектрофотометре (СФ2000, Россия, СПб) в ультрафиолетовой и видимой части спектра. Для анализа полученных результатов использовался способ комплексной оценки содержания продуктов окислительной модификации белков [9]. Результаты выражали в единицах оптической плотности (е.о.п.) на грамм белка. Оценка резервноадаптационного потенциала (РАП) [10] осуществлялась с использованием значений общих площадей под кривой спектра поглощения карбонильных производных, результат выражали в процентах.

Aктивнoсть лизосомальных цистеиновых протеиназ – катепсинов В, L и Н – изучалась раздельно в седиментируемой и неседиментируемой фракциях гомогенатов спектрофлуориметрическим методом [11] с регистрацией продукта реакции (7амидо4метилкумарина) на спектрофлуориметре System 3 Scanning Spectrofluorometr (Optical technology devices, inc. Elmstord, New York, 10523). Удельную активность ферментов выражали в нкат/г белка и обозначали НСА (для неседиментируемой фракции) и СА (для седиментируемой). Общая активность в гомогенате (ОА) рассчитывалась как сумма НСА и СА для каждого фермента.

Для оценки компартментализации катепсинов использовали значение доли внелизосомальной активности (НСА%), которую рассчитывали как процентное соотношение неседиментируемой активности соответствующего фермента к его общей активности.

Аутокаталитическое действие катепсинов оценивалось по коэффициенту отношения значения активности каждого фермента после 15минутной прекаталитической инкубации к параллельно определяемому значению активности без преинкубации [12] (K_aca – коэффициент аутокаталитического действия).

В качестве дополнительного маркера стабильности лизосомальной мембраны в седиментируемой и неседиментируемой фракциях гомогенатов определяли активность кислой фосфатазы (суммарную и тартратстабильную) с использованием коммерческого набора «Витал Диагностикс СПб» (Россия, СПб), активность тартратчувствительной фракции определяли как разницу между суммарной и тартратстабильной активностью.

Статистическую обработку результатов проводили с применением программы Statistica 10.0. Проверку нормальности распределения данных осуществляли с помощью критерия ШапироУилка (Wкритерий). Поскольку отмечалось отсутствие согласия большинства данных с нормальным распределением, в качестве характеристик использовали медиану (Ме), верхний и нижний квартили (Q1и Q3 соответственно), результаты представляли в формате Ме [Q1;Q3], для оценки статистической значимости различий независимых выборок использовали ранговый критерий МаннаУитни (Uтест). Оценку ранговой корреляции осуществляли с помощью коэффициента Спирмена.

Результаты и их обсуждение

Измерение концентрации гомоцистеина в сыворотке крови продемонстрировало значительное нарастание показателя у животных, получавших метионин, относительно контрольной группы 1 (293,10 [273, 10; 318, 20] мкмоль/л и 5,90 [5, 50; 6, 70] мкмоль/л соответственно, р=0,001). При этом у животных, получавших аргинин на фоне метионина, данный показатель составил 92,80 [58, 75; 112, 07], что статистически значимо ниже показателей, обнаруженных для группы с изолированным введением метионина (р=0,001), но существенно выше значений контрольной группы 2 (5,87 [5, 65; 6, 77], р=0,002).

Данные, полученные в результате комплексной оценки состояния окислительной модификации белков в изучаемых тканях (табл. 1) демонстрируют, что на фоне экспериментальной гипергомоцистеинемии формируется статистически значимое повышение общего содержания окислительно карбонилированных белков в печени и почке (S_общ) за счет статистически значимого повышения содержания альдегидных форм динитрофенилгидразонов, считающихся первичными маркерами окислительного повреждения белков [13]. Таким образом, подтверждается тезис о роли гомоцистеина в качестве провокатора оксидативного стресса для указанных тканей, кроме того, наши данные согласуются с полученными ранее аналогичными результатами для миокарда [14]. Однако следует отметить, что, в отличие от миокарда, ткань печени и почек не продемонстрировала ни статистически значимых изменений вторичных маркеров окислительного повреждения белков (КДНФГ), ни изменений показателя РАП. Таким образом, несмотря на явные признаки развития окислительного стресса для ткани печени и почек на фоне гипергомоцистеинемии, его степень для данных тканей не столь выражена, как для сердечной мышцы. Причиной может оказаться как более развитая система антиоксидантной защиты, так и лучшая утилизация первично окислительно измененных белков.

Введение аргинина в дозе 500 мг/кг в течение 10 суток на фоне метионина привело к полной коррекции выявленных изменений, приблизив показатели состояния окислительного карбонилирования белков к значениям соответствующего контроля и сформировав статистически значимые снижения уровней S_общ и S_{АДНФГсумм} относительно группы, получавшей метионин.

 

Таблица 1. Результаты комплексной оценки состояния окислительной модификации белков в экспериментальных и контрольных группах (Ме [Q₁; Q₃])

Показатель	Группа/орган
	Контроль 1
	Печень	Почка	Легкое
Sобщ	2,87 [2, 76;2, 87]	2,22 [2, 12;2, 64]	2,10 [1, 69;2, 82]
SАДНФГ, сумм	2,34 [2, 07;2, 53]	1,83 [1, 72;2, 19]	1,61 [1, 28;2, 27]
SКДНФГ, сумм	0,60 [0, 46;0, 76]	0,41 [0, 32;0, 46]	0,47 [0, 41;0, 54]
РАП%	57,10 [49, 50; 57, 10]	50,00 [42, 20; 54, 50]	37,80 [35, 80; 46, 00]
	Метионин
	Печень	Почка	Легкое
Sобщ	5,30 [4, 25;5, 50]*, р1=0,003	3,58 [2, 94;3, 72]*, p1=0,005	2,19 [1, 90;2, 81]
SАДНФГ, сумм	4,75 [3, 85;5, 16]*, р1=0,002	2,93 [2, 44;3, 02]*, р1=0,003	1,67 [1, 51;2, 11]
SКДНФГ, сумм	0,42 [0, 35;0, 52]	0,55 [0, 40;0, 71]	0,41 [0, 39;0, 53]
РАП%	58,10 [29, 40;59, 10]	48,8 [44, 80; 67, 90]	54,30 [44, 80; 65, 20]
	Контроль 2
	Печень	Почка	Легкое
Sобщ	1,03 [0, 99;1, 07]	2,41 [1, 06;3, 90]	2,16 [1, 98;2, 47]
SАДНФГ, сумм	0,71 [0, 69;0, 73]	2,10 [0, 66;3, 38]	1,67 [1, 57;1, 98]
SКДНФГ, сумм	0,33 [0, 28;0, 35]	0,45 [0, 41;0, 54]	0,44 [0, 40;0, 55]
РАП%	24,5 [22, 50;26, 90]	54,50 [38, 20;70, 00]	49,60 [36, 90;56, 40]
	Метионин + аргинин
	Печень	Почка	Легкое
Sобщ	1,46 [1, 03;1, 89]#, р2=0,008	1,85 [1, 45;2, 42]#, р2=0,047	1,92 [1, 49;2, 34]
SАДНФГ, сумм	1,21 [0, 81;1, 57]#, р2=0,008	1,60 [1, 31;1, 93]#, р2=0,03	1,26 [1, 11;1, 83]
SКДНФГ, сумм	0,25 [0, 23;0, 32]#, p2=0,05	0,35 [0, 23;0, 50]	0,53 [0, 38;0, 63]
РАП%	67,10 [50, 27;76, 00]	76,30 [59, 30;80, 10]	54,30 [23, 50;80, 50]

Примечания: *, p₁ – статистические значимые отличия от соответствующего контроля, #, p₂ – статистически значимые отличия от группы, получавшей метионин

 

При оценке изменений активности и внутриклеточного распределения лизосомальных цистеиновых протеиназ на фоне окислительного стресса, вызванного экспериментальной гипергомоцистеинемией и его коррекции аргинином, обнаружен ряд ткане и энзимоспецических тенденций.

Так, для катепсина В (табл. 2) наиболее яркие отличия обнаружены для ткани почки: активность фермента на фоне гипергомоцистеинемии статистически значимо снижалась как в лизосомальной (СА), так и в цитоплазматической (НСА) фракциях, формируя статистически значимое снижение общей активности (ОА).

 

Таблица 2. Изменения активности и компартментализации лизосомальных цистеиновых протеиназ в экспериментальных и контрольных группах: катепсин В (Ме [Q₁; Q₃])

Показатель	Группа/орган
	Контроль 1
	Печень	Почка		Легкое
ОА, нкат/г белка	0,43 [0, 39;0, 54]	0,93[0, 85;1, 12]		0,14 [0, 12;0, 17]
СА, нкат/г белка	0,41 [0, 38;0, 52]	0,88[0, 81;1, 08]		0,14 [0, 12;0, 16]
НСА, нкат/г белка	0,020 [0, 015;0, 024]	0,045 [0, 042;0, 047]		0,003 [0, 003;0, 005]
НСА, %	4,30 [2, 9;5, 6]	4,9 [4, 0;5, 6]		2,6 [1, 9;4, 6]
	Метионин
	Печень	Почка		Легкое
ОА, нкат/г белка	0,37 [0, 29;0, 43]	0,64 [0, 50;0, 81]*, р1=0,01		0,16 [0, 04;0, 24]
СА, нкат/г белка	0,36 [0, 29;0, 42]	0,62 [0, 48;0, 79]*, р1=0,02		0,16 [0, 04;0, 24]
НСА, нкат/г белка	0,007 [0, 005;0, 011]*, р1=0,01	0,020 [0, 016;0, 022]*, р1=0,002		0,003 [0, 001;0, 003]
НСА, %	2,4 [1, 2;3, 2]	3,2 [2, 6;4, 6]		1,7 [1, 1;3, 1]
	Контроль 2
	Печень	Почка		Легкое
ОА, нкат/г белка	0,34 [0, 30;0, 40]	1,36 [0, 68;2, 07]		0,94 [0, 81;1, 06]
СА, нкат/г белка	0,33 [0, 29;0, 38]	1,31 [0, 62;2, 02]		0,93 [0, 80;1, 05]
НСА, нкат/г белка	0,011 [0, 010;0, 012]	0,058 [0, 050;0, 067]		0,011 [0, 010;0, 012]
НСА, %	3,0 [2, 7;3, 4]	4,0 [2, 8;9, 5]		0,9 [0, 7;1, 4]
	Метионин + аргинин
	Печень		Почка		Легкое
ОА, нкат/г белка	0,23 [0, 20;0, 24]*, p1=0,005		0,59 [0, 50;0, 67]		0,98 [0, 92;1, 13]#, p2=0,002
СА, нкат/г белка	0,22 [0, 20;0, 24]*, p1=0,005		0,51 [0, 43;0, 59]		0,97 [0, 92;1, 12]#, p2=0,002
НСА, нкат/г белка	0,005 [0, 005;0, 006]*, p1=0,005		0,072 [0, 071;0, 088]*#, p1=0,01, p2=0,002		0,005 [0, 002;0, 008]
НСА, %	2,3 [2, 0;2, 6]*, p1=0,05		13,8 [11, 3;14, 3]#, p2=0,002		0,4 [0, 1;1, 1]#, p2=0,05

Примечание: *, p₁ – статистические значимые отличия от соответствующего контроля, #, p₂ – статистически значимые отличия от группы, получавшей метионин

 

При этом введение аргинина вызвало лишь нарастание активности фермента в цитоплазматической фракции, сформировав статистические значимые отличия в сторону повышения не только от показателей группы, получавшей метионин, но и от соответствующего контроля. Отсутствие статистически значимых отличий общей активности фермента в сочетании со значительным нарастанием показателя доли неседиментируемой активности (НСА%) подчеркивает, что причиной является изменение компартментализации с интенсификацией выхода фермента из лизосомальной в цитоплазматическую фракцию, в том числе для утилизации окислительно поврежденных белков. В ткани печени на фоне гипергомоцистеинемии также присутствует тенденция к снижению активности катепсина В, однако статистически значимые изменения получены только для неседиментируемой активности. Интересно, что введение аргинина в данном случае не только не корректирует, но даже усугубляет выявленные изменения, статистически значимо отдаляя значения показателей от значений контрольной группы без статистически значимых отличий от группы с изолированной гипергомоцистеинемией.

Изменения активности и компартментализации катепсина L (табл. 3) при экспериментальной гипергомоцистеинемии оказались аналогичными катепсину В, но гораздо более выраженными. Так, статистически значимое снижение показателей НСА, СА и ОА катепсина L обнаружено как для ткани почки, так и для печени, при этом снижение активности в цитоплазматической фракции в обоих случаях оказалось более выраженным, чем для лизосомальной, что подтверждается статистически значимыми снижениями доли неседиментируемой активности.

 

Таблица 3. Изменения активности и компартментализации лизосомальных цистеиновых протеиназ в экспериментальных и контрольных группах: катепсин L (Ме [Q₁; Q₃])

Показатель	Группа/орган
	Контроль 1
	Печень	Почка	Легкое
ОА, нкат/г белка	1,70 [1, 19;2, 10]	2,03 [1, 90;2, 27]	1,65 [1, 45;1, 84]
СА, нкат/г белка	1,64 [1, 14;2, 03]	1,97 [1, 83;2, 18]	1,64 [1, 40;1, 83]
НСА, нкат/г белка	0,063 [0, 061;0, 066]	0,071 [0, 068;0, 079]	0,019 [0, 014;0, 026]
НСА, %	3,9 [3, 1;5, 1]	3,8 [3, 1;4, 0]	1,3 [0, 8;1, 5]
	Метионин
	Печень	Почка	Легкое
ОА, нкат/г белка	1,12 [0, 93;1, 22]*, p1=0,04	0,66 [0, 55;0, 74]*, p1=0,001	2,05 [1, 73;2, 31]
СА, нкат/г белка	1,10 [0, 91;1, 21]	0,66 [0, 54;0, 73]*, p1=0,001	2,01 [1, 72;2, 31]
НСА, нкат/г белка	0,019 [0, 010;0, 025]*, p1=0,001	0,009 [0, 007;0, 013]*, p1=0,001	0,021 [0, 006;0, 035]
НСА, %	2,0 [0, 8;2, 4]*, p1=0,001	1,2 [1, 1;1, 6]*, p1=0,001	0,9 [0, 4;1, 8]
	Контроль 2
	Печень	Почка	Легкое
ОА, нкат/г белка	1,16 [1, 03;1, 28]	2,92 [2, 37;4, 12]	1,70 [1, 31;2, 18]
СА, нкат/г белка	1,12 [0, 99;1, 25]	2,83 [2, 30;4, 06]	1,68 [1, 30;2, 15]
НСА, нкат/г белка	0,037 [0, 028;0, 042]	0,075 [0, 071;0, 084]	0,024 [0, 020;0, 026]
НСА, %	3,1 [2, 5;3, 4]	2,8 [1, 9;3, 5]	1,2 [0, 9;1, 4]
	Метионин + аргинин
	Печень	Почка	Легкое
ОА, нкат/г белка	1,23 [1, 00;1, 27]	1,89 [1, 82;1, 94]*#, p1=0,02, p2=0,002	1,52 [1, 33;1, 99]
СА, нкат/г белка	1,18 [0, 95;1, 23]	1,81 [1, 75;1, 86]*#, p1=0,01, p2=0,002	1,50 [1, 30;1, 98]
НСА, нкат/г белка	0,048 [0, 040;0, 054]#, p2=0,008	0,080 [0, 074;0, 084]#, p2=0,002	0,026 [0, 016;0, 034]
НСА, %	4,0 [3, 1;5, 4]#, p2=0,002	4,0 [3, 9;4, 3]*#, p1=0,005, p2=0,01	1,6 [1, 0;2, 5]

Примечания:*, p₁ – статистические значимые отличия от соответствующего контроля, #, p₂ – статистически значимые отличия от группы, получавшей метионин

 

Применение аргинина вновь не корректирует изменений общей и лизосомальной активности катепсина L в ткани печени, однотипно катепсину В, однако вызывает перераспределение фермента в цитоплазматическую фракцию, приводя к статистически значимому повышению неседиментируемой активности катепсина L и ее доли относительно группы, получавшей изолированно метионин. В ткани почки же введение аргинина на фоне метионина привело к частичной коррекции изменений общей и лизосомальной активности катепсина L: значения оказались статистически выше таковых для группы, получавшей изолированно метионин, но статистически значимо ниже, чем в соответствующей контрольной группе. При этом изменения активности фермента в неседиментируемой фракции оказались скорректированы полностью, причиной вновь можно считать перераспределение фермента: доля неседиментируемой активности статистически значимо нарастает не только относительно группы с экспериментальной гипергомоцистеинемией, но и относительно соответствующего контроля.

Изменения активности и распределения катепсина Н (табл. 4) в ткани печени практически повторяют обнаруженные для катепсина L, единственным отличием является неполная коррекция снижения несе диментируемой активности аргинином. При этом в ткани почки на фоне экпериментальной гипергомоцистеинемии мы обнаружили повышение общей активности фермента, однако эти изменения произошли за счет лизосомальной фракции, доля неседиментируемой активности оказалась статистически значимо ниже контрольных значений. Применение аргинина привело, тем не менее, к дополнительному повышению общей активности фермента, которая статистически значимо превысила значения для группы с изолированным введением метионина, приблизившись к значениям соответствующего контроля. Особенно выраженными оказались изменения неседиментируемой активности, статистически значимо превысившие не только значения, полученные для группы с изолированным введением метионина, но и показатели контрольной группы. Наличие вклада в выявленные изменения внутриклеточного перераспределения фермента подтверждается статистически значимым повышением значения доли цитоплазматической фракции относительно группы с экспериментальной гипергомоцистеинемией.

 

Таблица 4. Изменения активности и компартментализации лизосомальных цистеиновых протеиназ в экспериментальных и контрольных группах: катепсин H (Ме [Q₁; Q₃])

Показатель	Группа/орган
	Контроль 1
	Печень	Почка	Легкое
ОА, нкат/г белка	0,75 [0, 56;0, 83]	1,63 [1, 26;2, 29]	1,24 [1, 11;1, 46]
СА, нкат/г белка	0,70 [0, 52;0, 78]	1,57 [1, 21;2, 24]	1,21 [1, 08;1, 42]
НСА, нкат/г белка	0,048 [0, 037;0, 059]	0,044 [0, 043;0, 070]	0,039 [0, 024;0, 044]
НСА, %	7,1 [6, 4;7, 3]	3,5 [2, 3;4, 3]	2,9 [2, 6;3, 1]
	Метионин
	Печень	Почка	Легкое
ОА, нкат/г белка	0,50 [0, 44;0, 54]*, p1=0,01	2,64 [2, 52;2, 78]*, p1=0,02	1,45 [1, 19;1, 78]
СА, нкат/г белка	0,47 [0, 41;0, 51]*, p1=0,02	2,60 [2, 48;2, 75]*, p1=0,01	1,43 [1, 16;1, 75]
НСА, нкат/г белка	0,028 [0, 025;0, 030]*, p1=0,004	0,038 [0, 032;0, 051]	0,024 [0, 022;0, 031]
НСА, %	5,6 [5, 0;6, 3]*, p1=0,01	1,5 [1, 2;2, 0]*, p1=0,02	2,0 [1, 1;2, 5]
	Контроль 2
	Печень	Почка	Легкое
ОА, нкат/г белка	1,06 [0, 91;1, 26]	3,49 [3, 27;4, 14]	3,34 [2, 88;3, 56]
СА, нкат/г белка	0,98 [0, 84;1, 18]	3,40 [3, 20;4, 07]	3,24 [2, 79;3, 47]
НСА, нкат/г белка	0,081 [0, 073;0, 087]	0,080 [0, 071;0, 084]	0,094 [0, 083;0, 097]
НСА, %	7,6 [6, 9;7, 8]	2,2 [1, 8;2, 5]	2,8 [2, 6;3, 0]
	Метионин + аргинин
	Печень	Почка	Легкое
ОА, нкат/г белка	0,93 [0, 89;1, 08]#, p2=0,002	3,01 [2, 97;3, 05]#, p2=0,05	2,32 [2, 07;2, 48]*#, p1=0,008, p2=0,008
СА, нкат/г белка	0,85 [0, 83;1, 00]#, p2=0,002	2,92 [2, 88;2, 96]	2,26 [2, 01;2, 41]*#, p1=0,008, p2=0,01
НСА, нкат/г белка	0,070 [0, 068;0, 072]*#, p1=0,05, p2=0,002	0,088[0, 084;0, 090]*#, p1=0,05, p2=0,002	0,069[0, 061;0, 077]*#, p1=0,02, p2=0,002
НСА, %	7,3 [6, 4;8, 2]#, p2=0,02	2,9 [2, 8;3, 0]#, p2=0,002	3,0 [2, 8;3, 3]#, p2=0,02

Примечание: *, p₁ – статистические значимые отличия от соответствующего контроля, #, p₂ – статистически значимые отличия от группы, получавшей метионин

 

Интересно, что ткань легкого продемонстрировала устойчивость к развитию оксидативного стресса при экспериментальной гипергомоцистеинемии и отсутствие изменений показателей окислительного повреждения белков сопровождались для этой ткани отсутствием изменений активности и внутриклеточного распределения лизосомальных цистеиновых протеиназ.

При оценке связи показателей окислительного карбонилирования белков и активности/распределения катепсинов для изучаемых моделей наиболее яркие тенденции были получены для ткани почки, где и в целом изменения значений также оказались более выраженными (табл. 5). Для всех изучаемых ферментов получены статистически значимые обратные корреляционные связи общего содержания карбонилированных белков и первичных маркеров окислительного повреждения протеинов с показателями неседиментируемой активности всех изучаемых катепсинов и значениями доли цитоплазматической фракции как всех катепсинов, так и кислой фосфатазы. Степень корреляционной связи во всех случаях оказалась от средней (0,55) до высокой (0,87).

 

Таблица 5. Корреляционный анализ связей показателей активности и распределения лизосомальных цистеиновых протеиназ ткани почки с маркерами окислительного повреждения белков

	Sобщ		SАДНФГ, сумм
	R	р	R	р
Катепсин В ОА	0,30	0,168	0,25	0,255
Катепсин L ОА	0,57	0,005	0,57	0,006
Катепсин Н ОА	0,0006	0,998	0,11	0,618
Катепсин В СА	0,26	0,244	0,20	0,370
Катепсин L СА	0,57	0,005	0,57	0,006
Катепсин Н СА	0,04	0,865	0,07	0,749
Катепсин В НСА	0,72	0,0002	0,74	0,00008
Катепсин L НСА	0,58	0,005	0,65	0,001
Катепсин Н НСА	0,57	0,01	0,65	0,001
Катепсин В НСА%	0,55	0,008	0,61	0,002
Катепсин L НСА%	0,48	0,023	0,56	0,006
Катепсин Н НСА%	0,58	0,005	0,59	0,004
КФ сумм НСА%	0,83	0,000002	0,84	0,000001
КФ тч НСА%	0,69	0,0004	0,71	0,0002
КФ тс НСА%	0,87	0,0000001	0,85	0,0000004

 

В ткани печени статистически значимые корреляционные связи с показателями окислительного повреждения белков были получены только для активности катепсина Н: неседиментируемая активность продемонстрировала обратную корреляционную связь средней степени (рис. 1), седиментируемая и общая активность – обратную корреляционную связь высокой степени (рис. 2, 3). При этом для доли цитоплазматической фракции получены обратные корреляционные связи в отношении катепсина В (0,55, р=0,01 с S_общ; 0,56, р=0,01 с S_{АДНФГ, сумм}), катепсина L (0,49, p=0,02 с S_общ; 0,47, p=0,03 с S_{АДНФГ, сумм}) и тартратчувствительной кислой фосфатазы (0,46, p=0,03 с S_общ; 0,45, p=0,04 с S_{АДНФГ, сумм}).

Полученные результаты подтверждают наличие связи между изменением активности лизосомальных ферментов и их перераспределением в цитоплазматическую фракцию с уровнем окислительного повреждения белков. Обратный характер корреляций можно считать частным подтверждением общего тезиса об ингибиторном влиянии окислительной модификации белков на их функции, в том числе энзиматическую. Одновременно, наличие подобных связей позволяет сделать предположение о том, что формирующаяся под влиянием аргинина коррекция показателей окислительной модификации белков может в качестве одной из причин иметь развивающееся одновременно перемещение лизосомальных цистеиновых протеиназ в цитоплазматическую фракцию.

Следует отметить, что обнаруженные в изучаемых моделях изменения активности катепсинов преимущественно в сторону снижения на фоне развивающегося окислительного стресса при гипергомоцистеинемии и коррекция показателей аргинином могут объясняться не только снижением их синтеза изза окислительного повреждения нуклеиновых кислот [15] либо снижением активности ферментов при их непосредственной окислительной модификации [16], но и изменением соотношения активных и проферментных форм. Для проверки последнего тезиса нами была предпринята оценка коэффициента аутокаталитического действия (Кaca) изучаемых катепсинов (табл. 6), поскольку для них аутокаталитический процессинг описан в качестве механизма оперативного перевода зимогена в активную форму фермента [1719].

 

 

Рис. 1. Корреляционные связи неседиментируемой активности катепсина Н печени с показателями окислительного карбонилирования белков

 

Рис. 2. Корреляционные связи седиментируемой активности катепсина Н печени с показателями окислительного карбонилирования белков

 

Рис. 3. Корреляционные связи общей активности катепсина Н печени с показателями окислительного карбонилирования белков

 

Оказалось, что описанные выше многочисленные изменения активности катепсинов в ткани почки на фоне окислительного стресса при экспериментальной гипергомоцистеинемии не сопровождаются изменениями коэффициента аутокаталитического действия, что дает основания полагать, что соотношение активных и проферментных форм в данной модели роли не играет. При этом применение аргинина на фоне экспериментальной гипергомоцистеинемии приводит к статистически значимому снижению Кaca в цитоплазматической фракции относительно контроля. Такие изменения могут говорить о существовании большей части протеиназ в активной форме, что в какойто степени подтверждает ранее высказанное предположение о возможной роли выходящих из лизосом катепсинов в утилизации окислительно поврежденных белков как о возможном механизме коррекции аргинином изменений, вызванных экспериментальной гипергомоцистеинемией.

В ткани печени, однако, на фоне гипергомоцистеинемии получено статистически значимое нарастание показателя Каса для неседиментируемой активности катепсина В, что позволяет предполагать, что описанное выше снижение его активности в цитоплазматической фракции может иметь причиной замедление дозревания зимогенов; для остальных показателей статистически значимых отличий не получено. Интересно, что применение аргинина на фоне экспериментальной гипергомоцистеинемии, приводя к дальнейшему снижению активности катепсина В в цитоплазматической фракции, вызывает и дальнейшее значительное нарастание Каса. Выявленные ранее изменения активности катепсинов L и Н в ткани печени для изучаемых моделей не сопровождались статистически значимыми изменениями Каса, что не дает оснований предполагать наличие вклада изменения соотношения проферментных и активных форм в обнаруженные сдвиги. Однако введение аргинина на фоне экспериментальной гипергомоцистеинемии привело к статистически значимому снижению показателя Каса в неседиментируемой фракции как относительно группы с введением метионина, так и относительно контроля, что указывает на то, что обнаруженная частичная коррекция сниженной на фоне оксидативного стресса активности данного фермента в цитоплазматической фракции может быть связана с увеличением доли активных форм.

Интересной находкой мы считаем обнаружение изменений показателя Каса для ткани легкого. Хотя, согласно ранее представленным данным, данная ткань не демонстрирует изменений показателей окислительного повреждения белков и активности катепсинов, оказалось, что развитие экспериментальной гипергомоцистеинемии приводит к статистически значимому повышению показателя Каса для катепсинов L и Н в неседиментируемой фракции, а введение аргинина возвращает показатели к контрольным значениям. Таким образом, при экспериментальной гипергомоцистеинемии данная ткань характеризуется увеличением доли неактивных форм без статистически значимого снижения активности, что можно трактовать, как компенсаторное нарастание синтеза и вывода в цитоплазму указанных катепсинов, создающее в итоге резистентность к повышению уровня окислительно поврежденных белков.

 

Таблица 6. Значения коэффициента аутокаталитического действия катепсинов В, L, H в экспериментальных и контрольных группах (Ме [Q₁; Q₃])

Показатель	Группа/орган
	Контроль 1
	Печень	Почка	Легкое
Катепсин В, НСА	0,18 [0, 12;0, 40]	1,01 [0, 79;1, 17]	0,49 [0, 49;0, 97]
Катепсин В, СА	0,47 [0, 14;0, 71]	0,97 [0, 68;1, 09]	0,76 [0, 67;0, 97]
Катепсин L, НСА	0,80 [0, 74;0, 83]	0,87 [0, 76;0, 95]	0,62 [0, 31;0, 86]
Катепсин L, СА	0,83 [0, 72;1, 28]	0,95 [0, 88;1, 02]	0,84 [0, 66;1, 14]
Катепсин H, НСА	0,63 [0, 35;0, 79]	0,87 [0, 81;1, 19]	0,49 [0, 37;0, 54]
Катепсин H, СА	0,60 [0, 40;0, 80]	0,89 [0, 86;0, 94]	0,25 [0, 18;0, 47]
	Метионин
	Печень	Почка	Легкое
Катепсин В, НСА	0,73 [0, 46;0, 98]*, p1=0,03	0,95 [0, 77;1, 12]	0,81 [0, 61;0, 98]
Катепсин В, СА	0,68 [0, 58;0, 91]	0,81 [0, 63;0, 96]	0,49 [0, 33;1, 22]
Катепсин L, НСА	1,04 [0, 56;1, 12]	0,90 [0, 65;1, 53]	1,16 [0, 85;3, 99]*, p1=0,03
Катепсин L, СА	0,67 [0, 54;0, 81]	0,90 [0, 82;1, 08]	1,03 [0, 94;1, 16]
Катепсин H, НСА	0,49 [0, 44;0, 6]	0,89 [0, 82;0, 95]	0,70 [0, 60;0, 78]*, p1=0,02
Катепсин H, СА	0,37 [0, 30;0, 61]	0,91 [0, 83;0, 95]	0,39 [0, 31;0, 49]
	Контроль 2
	Печень	Почка	Легкое
Катепсин В, НСА	1,20 [0, 82;1, 47]	1,42 [1, 36;1, 60]	0,35 [0, 32;0, 37]
Катепсин В, СА	1,36 [1, 15;1, 75]	1,47 [0, 74;3, 78]	1,18 [0, 88;1, 22]
Катепсин L, НСА	0,81 [0, 71;0, 83]	1,02 [0, 94;1, 26]	0,58 [0, 53;0, 65]
Катепсин L, СА	0,75 [0, 62;0, 85]	0,96 [0, 76;1, 06]	0,77 [0, 69;1, 10]
Катепсин H, НСА	0,67 [0, 52;0, 77]	1,19 [1, 06;1, 33]	0,62 [0, 55;0, 63]
Катепсин H, СА	0,44 [0, 35;0, 53]	0,80 [0, 72;0, 97]	0,38 [0, 35;0, 41]
	Метионин + аргинин
	Печень	Почка	Легкое
Катепсин В, НСА	1,45[1, 26;1, 61]#, p2=0,02	0,84[0, 81;1, 02]*, p1=0,005	1,2[0, 98;2, 2]*, p1=0,02
Катепсин В, СА	0,69[0, 50;0, 82]*, p1=0,005	1,44[1, 08;1, 62]	0,90[0, 84;1, 02]
Катепсин L, НСА	0,60[0, 58;0, 67]	0,87[0, 86;0, 89]*, p1=0,02	0,31[0, 08;0, 59]#, p2=0,008
Катепсин L, СА	0,61[0, 55;0, 72]	0,8[0, 77;1, 09]	0,89[0, 82;1, 08]
Катепсин H, НСА	0,27[0, 25;0, 29]*#, p1=0,008, p2=0,005	0,99[0, 98;1, 03]*, p1=0,05	0,48[0, 33;0, 6]#, p2=0,05
Катепсин H, СА	0,25[0, 20;0, 36]	0,62[0, 50;0, 81]	0,33[0, 33;0, 34]

Примечания:*, p₁ – статистические значимые отличия от соответствующего контроля, #, p₂ – статистически значимые отличия от группы, получавшей метионин

 

Достаточно однотипные изменения компартментализации изучаемых катепсинов при окислительном стрессе, вызванном экспериментальной гипергомоцистеинемией и, особенно, его коррекции аргинином дают основания предполагать наличие универсального механизма перераспределения ферментов из лизосом в цитоплазму. Наиболее вероятной причиной здесь представляется общее повышение проницаемости лизосомальной мембраны на фоне оксидативного стресса [20]. Данное предположение подтверждается результатами оценки доли неседиментируемой фракции для маркерного фермента лизосом – кислой фосфатазы (табл. 7): на фоне введения аргинина наблюдается статистически значимое нарастание показателей относительно группы с изолированным введением метионина не только для ткани почки, где значения при гипергомоцистеинемии оказались статистически значимо снижены, но и для печени, не продемонстрировавшей изначально статистически значимых отличий. При этом ткань легкого на фоне экспериментальной гипергомоцистеинемии оказалась единственной, показавшей значительное повышение суммарной активности кислой фосфатазы в группе, получавшей метионин, что может быть результатом компенсаторного увеличения количества лизосом в этой ткани и соотносится с ранее высказанным предположением о компенсаторном увеличении синтеза катепсинов. Возможно, именно этот процесс создал резистентность ткани легкого к формированию окислительного повреждения белков и суммарному отсутствию видимых изменений активности катепсинов. При этом на фоне экспериментальной гипергомоцистеинемии доля цитоплазматической активности суммарной и тартратчувствительной кислой фосфатазы в ткани легкого снижается, введение аргинина приводит к нарастанию показателя НСА% для тартратчувствительной фракции.

 

Таблица 7. Изменения активности и компартментализации фракций кислой фосфатазы в экспериментальных и контрольных группах (Ме [Q₁; Q₃])

Показатель	Группа/орган
	Контроль 1
	Печень	Почка	Легкое
КФсумм, нкат/г белка	310,2 [303, 3;333, 9]	663,4 [629, 8;859, 3]	514,6 [424, 9;607, 9]
НСА% Кфсумм	6,2 [5, 7;6, 9]	4,2 [3, 4;5, 0]	2,0 [2, 0;2, 6]
НСА% КФтч	3,0 [2, 7;3, 7]	2,8 [2, 0;3, 5]	2,8 [2, 0;3, 5]
НСА% КФтс	10,4 [9, 0;11, 6]	5,8 [3, 9;7, 0]	2,3 [1, 8;2, 7]
	Метионин
	Печень	Почка	Легкое
КФсумм, нкат/г белка	313,5 [298, 5;362, 6]	742,8 [643, 8;862, 00]	933,0[802, 6;1148, 8]*, p1=0,001
НСА% Кфсумм	6,0 [5, 2;6, 3]	1,8 [1, 6;2, 0]*, p1=0,003	1,4 [1, 0;1, 6]*, p1=0,005
НСА% КФтч	3,9 [2, 4;5, 1]	1,4 [0, 9;1, 7]*, p1=0,007	0,9 [0, 2;1, 1]*, p1=0,005
НСА% КФтс	7,6 [6, 0;9, 6]	2,3 [1, 6;2, 5]*, p1=0,004	1,9 [1, 1;2, 6]
	Контроль 2
	Печень	Почка	Легкое
КФсумм, нкат/г белка	204,7 [187, 8;247, 3]	591,1 [509, 9;678, 4]	523,9 [432, 6;643, 5]
НСА% Кфсумм	5,2 [4, 6;7, 1]	3,9 [3, 5;4, 3]	1,9 [1, 7;2, 5]
НСА% КФтч	4,4 [3, 7;5, 2]	3,7 [2, 9;4, 0]	1,9 [1, 4;4, 6]
НСА% КФтс	5,3 [5, 1;7, 7]	4,1 [3, 4;4, 8]	2,1 [1, 8;2, 2]
	Метионин + аргинин
	Печень	Почка	Легкое
КФсумм, нкат/г белка	309,9[271, 5;328, 1]*, p1=0,02	382,2[365, 3;397, 9]*#, p1=0,005, p2=0,002	588,7[571, 9;619, 1]#, p2=0,002
НСА% Кфсумм	7,0 [6, 5;8, 3]#, p2=0,03	4,7 [4, 5;4, 8]*#, p1=0,02, p2=0,002	1,6 [1, 5;1, 7]
НСА% КФтч	7,6 [7, 5;8, 5]*#, p1=0,008, p2=0,03	3,1 [2, 9;3, 2]#, p2=0,002	2,4 [1, 8;3, 0]#, p2=0,004
НСА% КФтс	7,0 [5, 9;8, 3]	6,6 [5, 9;7, 2]*#, p1=0,005, p2=0,002	1,3 [1, 0;1, 5]*, p1=0,008

Примечания: *, p₁ – статистические значимые отличия от соответствующего контроля, #, p₂ – статистически значимые отличия от группы, получавшей метионин

Выводы

1. Аргинин в дозе 500 мг/кг при 10дневном введении полностью корректирует развивающееся на фоне экспериментальной гипергомоцистеинемии повышение продуктов окислительного карбонилирования белков.
2. Под действием аргинина происходит нарастание сниженной при изолированной гипергомоцистеинемии активности катепсинов В, L, Н в цитоплазматической фракции печени и почки за счет внутриклеточного перераспределения ферментов.
3. Изменения компартментализации лизосомальных цистеиновых протеиназ под действием аргинина происходят через вызываемое им неселективное повышение проницаемости лизосомальной мембраны.
4. Обнаружены обратные корреляционные связи содержания продуктов окислительной модификации белков с активностью катепсинов в цитоплазматической (неседиментируемой) фракции и долей их неседиментируемой активности, позволяющие предполагать наличие вклада изменения компартментализации лизосомальных цистеиновых протеиназ в развивающуюся под действием аргинина компенсацию окислительного стресса на фоне экспериментальной гипергомоцистеинемии.

Об авторах

Мария Алексеевна Фомина

ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: marya.fom@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-5550-0625
SPIN-код: 1480-4281

к.м.н., доцент, доцент кафедры биологической химии с курсом клинической лабораторной диагностики факультета дополнительного профессионального образования

Россия, 390026 г. Рязань, ул. Высоковольтная, д. 9

Александр Александрович Терентьев

ФГБОУ ВО Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова Минздрава России

Email: marya.fom@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2453-8377
SPIN-код: 1141-6524

д.м.н., профессор, членкорреспондент РАН, профессор кафедры биохимии и молекулярной биологии лечебного факультета

Россия, 117997, г. Москва, ул. Островитянова, 1

Список литературы

Дополнительные файлы