Ultrix疫苗免疫原性主要参数的研究

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目的：进行FORT有限公司生产包含不同血清型流感病毒的Ultrix疫苗的临床研究：菌株包括H1N1 A/California/7/2009 (H1N1) pdm 09、H3N2 A/HongKong/4801/2014、NYMCX-263B (15/184) 和 B/Brisbane/60/2008 NYMCBX-35 (15/300) Victorialineage (2016年流行病季节)、并H1N1 A/Michigan/45/2015 NYMCX-275 (16/248) 、H3N2 A/HongKong/4801/2014、NYMCX-263B(15/184) 及 B/Brisbane/60/2008 NYMCBX-35 (15/300) Victorialineage (2017年流行病季节) 。

材料与方法：免疫原性主要参数的研究包括测定平均几何抗体效价、血清保护和血清转换水平，以及免疫接种后抗体效价增加4倍的个体相对数量。用显微法测定了血凝反应的免疫原性。用与疫苗株相同的流感病毒血清型抗原检测血清。

结果：Ultrix的血清保护率达到91.7—95.8% (2016年) 和93.8—97.9% (2017年) 。含有H1N1A/California血清型的Ultrix疫苗6个月后可达到最大的血清保护水平。在2016年和2017年接种疫苗期间，所有疫苗株的平均anti-НА几何水平增加了2.55-4.36倍，在2016年首次免疫21天后，超过70%的志愿者的抗体滴度增加了4倍。

结论：包含不同血清型流感病毒的Ultrix疫苗的临床研究结果证明免疫原性参数符合专利药品委员会 (CPMPEMEA、CPMP/EWP/1045/01) 及俄罗斯联邦国家药典第十三版 (SP RF XIII)的要求。

全文:

流感仍然是最常见的传染病之一，发生危及生命的并发症的风险很高[1-3]。新的流感病毒血清学变体的出现，如在2009年出现菌株А/H1N1/A/California/7/ 2009导致温和性及严重流感的发展[1, 4]在严重免疫抑制的背景下，出现多器官功能衰竭[5]，并伴有高死亡率[4]。目前，降低感染和相关并发症风险的最佳工具是使用流感疫苗[6-8]。利用免疫生物药物控制流感的发生通常有几个方面。一方面，一个特定个体的免疫系统对循环的病毒株和那些它第一次遇到的病毒株有不同的反应，如果它们有抗原相似性[7, 9, 10]。另一方面，疫苗接种后免疫的形成，H—和N—病毒糖蛋白抗体的持续存在依赖于流感疫苗的免疫原性等指标[4, 11, 12]。流感疫苗的免疫原性及降低流感抗体滴度的动态仍然是许多研究的主题，这些研究与制药市场上流感疫苗的多样性有关。

目的是评估与不同抗原组成的疫苗株后21天、6个月、10个月和持续时间的抗血凝素抗体 (anti-НА) 接种疫苗后的灭活流感分裂疫苗Ultrix (LSR-001419/08) 的免疫原性。

材料与方法

临床研究包括48名志愿者 (根据监管文件签署知情同意书) ，年龄为18岁到60岁之间 (n=48)  (平均年龄为35±8.2岁) ，2016年9月和2017年5月使用"FORT" LLC生产的Ultrix接种。 在疫苗的生产中使用了菌株H1N1 A/California/7/2009 (H1N1) pdm 09，H3N2 A/HongKong/4801/2014，NYMCX-263B (15/184) ，B/Brisbane/60/2008 NYMCBX-35 (15/300) Victorialineage由世界卫生组织推荐的2016年流行病季节节，并菌株 H1N1 A/ Michigan/45/2015 NYMCX-275 (16/248) ，H3N2 A/HongKong/4801/2014，NYMCX-263B (15/184) ，B/Brisbane/60/2008NYMCBX-35 (15/300) Victorialineage, 建议2017年流行病季节使用，每个品系的血凝素含量为15微克。根据俄罗斯联邦国家药典第十三版 (SP RF XIII) ，血液血清中的抗体水平由微粒体在血细胞凝集抑制反应 (HI test) 中来测定[13]。为了建立反应，从用于生产相应流行季节疫苗的流感病毒株中使用了流感诊断学。使用RDE试剂 (Deben Diagnostics Ltd.，英国) 从免疫血清中去除非特异性血凝抑制剂。这项研究使用了微型平板 (96孔V形) ，在接种疫苗21天后使用成对的志愿者血清，然后在6个月和10个月后进行。血凝素滴度小于1:10，估计为1:5。为了评估Ultrix疫苗的有效性，使用了免疫原性标 (见表1) 。

所得数据采用Statistica 6.0软件包进行统计处理。

表1

流感疫苗的免疫原性标准*

免疫原性标准

数值

血清转换因子 (与基线水平相比，平均几何抗体效价在第21天增加) ，
表达为增加的多样性

>2.5

血清转换水平 (其抗体滴度增加了
4倍以上的志愿者的百分比)

>40%

血清保护水平 (接种后第21天抗体滴度大于1:40的个体百分比)

>70%

注：*根据专利药品委员会 (CPMPEMEA，CPMP/EWP/1045 / 01) 及 XIII的数据

结果与讨论

2016年接种疫苗前，经H1N1 A/California/7/2009  (H1N1) pdm09诊断检测的血清阴性血清数为12名 (25.0%) ；经H3N2 A/HongKong/4801/2014 (H3N2) 为 14名 (29.2%) ；经B/Brisbane/60/2008位11名 (22.9%) 。2名志愿者 (4.2%) 对三种Ultrix疫苗株缺乏抗体。大部分的血清反应阳性的血清，在缺乏数据以前的疫苗证实了，作为一个规则，病毒在循环过程中对人体免疫系统的积极作用，并疫苗的抗原成分相匹配的流感病毒亚型结构[7]。用血清转化的志愿者在血清阴性个体中 (抗体效价1:20或以下) 及血清阳性个体中 (抗体效价1:40或以上) 之间的相对数量在Ultrix接种后的21天和180天示于表2。

表2

抗体效价的范围，血清阴性个体和血清阳性者中血清转化的志愿者人数

接种前的

志愿者人数 (%)

菌株的抗原变异

H1N1A/California

H3N2A/HongKong

B/Brisbane

A*

B*

A

B

A

B

12 (25%)

36 (75%)

14 (29,25%)

33 (68,75%)

11 (22,9%)

37 (77,1%)

接种疫苗后21天

具有血清转化的志愿者人数 (%)

 (抗体滴度范围)

10

 

(83,3%)

(1:40-1:320)

25

 

(69,4%)

(1:40-1:1280)

12

 

(85,7%)

(1:80-1:640)

25

 

(75,75%)

(1:40-1:640)

8

 

(72,3%)

(1:20-1:320)

27

 

(72,97%)

(1:40-1:640)

Pf*

> 0, 05

> 0, 05

> 0, 05

接种疫苗后180天

具有血清转化的志愿者人数 (%)

 (抗体滴度范围)

10

 

(83,3%)

(1:40-1:320)

16

 

(44,4%)

(1:160-1:640)

6

 

(42,9%)

(1:20-1:640)

11

 

(33,3%)

(1:160-1:320)

5

 

(45,5%)

(1:80-1:160)

7

 

(18,9%)

(1:160-1:6400)

Pf*

< 0,05

> 0,05

< 0,05

注：*A—血清阴性；B—血清阳性；Pf—Fisher角转化

总的来说，2016年接种的大多数志愿者都表现出明显的免疫系统激活，对Ultrix疫苗的所有菌株都形成了强烈的、可比较的免疫持续时间。在21天后接种疫苗的人群中，血清转化为H1N1A/California和B/Brisbane菌株发现于35人 (72.9%) ，并H3N2A/HongKong菌株于37名志愿者 (77.1%) 。对血清阴性和血清阳性志愿者21天后的血清转换血清的相对数量进行比较分析，未发现流感抗体的效价为1:40或更高的出现与疫苗接种前的初始抗体水平之间存在联系。尽管血清阳性志愿者中有更多的人有血清转化，即25人和27人，分为A (H1N1) 、A (H3N2) 及B菌株，但这种差异在统计学上是不可靠的 (Pf >0.05) 。唯一的例外是血清阴性和血清阳性个体在6个月后对A (H1N1) 和B的抗原变异的免疫反应。无论初始抗体水平如何，疫苗接种前，抗体滴度为1:20的志愿者血清转化率 (83.3和45.5%) 明显高于血清阳性志愿者 (Pf < 0.05) 。

单次免疫后21天anti-HA抗体效价几何平均倍率为173.5；135.7和88.5，于95.8形成血清保护；病毒株A (H1N1) 、A (H3N2) 和B分别占91.7%和93.7%。

研究中发现了H1N1A/California菌株的抗原性更高，单次免疫6个月后免疫系统激活并血清保护高达100％的情况证明该结论。同期H3N2A/Hong Kong和B/Brisbane的血清阳性血清数量分别逐渐减少至85.4和91.7%，并保护水平保持在较高水平，符合CPMPEMEA和CPMP/EWP/ 1045/01的要求 (表1) 。

在2017年接种后，志愿者重复接种了10个月后的Ultrix疫苗，其中H1N1A/California株被H1N1A/Michigan株替代，对H3N2A/ HongKong和B/Brisbane株的反应与首次接触疫苗株抗原时相比不那么强烈。H3N2A/ HongKong和B/Brisbane抗体反应阳性血清的数量在第一次抗原刺激后增加了3.1倍和4.1倍，而第二次抗原刺激仅增加了2.4倍和2.5倍 (Pf<0.001和Pf<0.05) 。2017年，接种H1N1A/Michigan株疫苗导致在更多的志愿者 (97.9％) 中以1:40或更多的效价形成抗体。然而，较高比例的血清阳性个体并不认为H1N1A/California 株具有低免疫原性，因为接种前H1N1A/ Michigan株的血清阴性血清数量比H1N1A/California株少1.4倍。

在10个月后 (2017年) 反复接种Ultrix，刺激了2016年和2017年疫苗相同病毒抗原的抗体的产生，其效价低于H1N1A/ Michigan株。第一次疫苗接种后的H3N2A/Hong Kong毒株，在2名志愿者 (4,2%) 中测定了最大滴度为1:640，在62.5%的志愿者中，抗体滴度增加了4-8倍。重复接种同样的毒株刺激了抗体的产生，其效价不超过1:320于5人 (10.4%) ，缺乏血清转换，是29名志愿者 (60.4%) 的免疫系统活性较低的特点，而在数量明显较少的志愿者 (35.4%) 中抗体滴度增加了4-8倍。重复免疫期间，B/Brisbane毒株的12份血清的anti-НА滴度增加了4-8倍，比首次免疫时降低了2.7倍 (2017年下降了25%，2016年下降了66.7%) 。

在一个血清 (2.1%) 中检测到对H1N1A/California抗体滴度的最大增加至1:1280。在50%以上的血清中，抗体滴度增加4-8倍，分别为39.6%—18.7%。在一份血清中还检测到了最高效价为1:320的抗体 (2.1%) 对H1N1A/Michigan，在41.7%的志愿者中发现了血清转换。尽管血清保护水平的差异 (分别为70.8和41.7％) ，对H1N1A/California和H1N1A/Michigan的anti-HA抗体效价的相对数量的分析没有显示血清转化水平的统计学显着性差异 (Pf>0.05) ，这证实了不同来源的疫苗A/H1N1株的密切抗原组成。血清阴性血清和血清转化血清数量的比较数据见表3。

表3

2016年 (21天后，并180天后) 及2017年
 (21天后) 接种后血清阴性和血清阳性血清的结构

接种后的时间/

菌株的抗原变异

抗体滴度增加的多重性

绝对 /%

0

2

4

8

16

32

 (21天)

/H1N1A/California*

7/14,6

7/14,6

19/39,6

9/18,8

4/8,3

2/4.2

/H3N2A/HongKong*

9/18,8

4/8,3

23/47,9

7/14,6

4/8,3

1/2,1

/B/Brisbane*

5/10,4

8/16,7

22/45,8

10/20,8

3/6,3

–

 (6个月)

/H1N1A/California*

10/20,8

13/27,1

13/27,1

8/16,7

3/6,3

1/2,1

H3N2A/HongKong*

15/31,3

15/31,3

13/27,1

2/4,2

2/4,2

1/2,0

B/Brisbane*

20/41,7

17/35,4

7/14,6

1/2,1

2/4,2

1/2,1

 (21天)

/H1N1A/Michigan**

12/25,0

16/33,3

18/37,5

1/2,1

–

1/2,1

/H3N2A/HongKong**

14/29,2

15/31,3

13/27,1

4/8,3

16/4,2

–

/B/Brisbane**

17/35,4

16/33,3

8/16,7

4/8,3

3/6,3

–

注：* 2016年季节 **—2017年

少数志愿者 (5人至9人) 分别对B/Bris-bane和H3N2A/HongKong株具有免疫耐受。超过50%的接种者显示抗体效价增加了4-8倍 (58.4%的人有H1N1A/California抗体；62.5%的人有H3N2A/HongKong抗体，66.6%的人有B/Brisbane抗体) ，这对流感病毒的个体和集体免疫的形成具有重要意义。6个月后的重复血清测试显示，没有抗体效价动态的志愿者数量增加，而抗体效价增加4-8倍的血清数量减少。例如，6个月后，接种B/Brisbane毒株无抗体疫苗的人数增加了4倍，而接种同一毒株抗体增加4-8倍的志愿者人数从66.6下降到16.7%。免疫系统对不同疫苗中常见抗原和新抗原的不同反应与抗原印迹免疫现象有关，其本质表现为当反复接触免疫系统最初记忆的抗原时，免疫系统会产生更强的免疫反应[9, 10]。在这项临床研究中，很难确定是哪种菌株导致了抗原印迹，这不仅是由于某些血清型流感病毒[3]在自然界中广泛传播了几十年，但也使用不同类型的H1N1血清型甲型流感病毒作为近年来用于季节性免疫的疫苗的一部分[12, 11]。

抗体效价几何多重性平均值比较，疫苗株抗原性差异无统计学意义。然而，与接种前的初始抗体滴度相比，anti-HA抗体效价几何平均倍率分别增加2.55倍和4.36倍 (Pf<0.05) ，差异有统计学意义 (见表4) 。

表4

2016、2017年接种后21天anti-HA抗体效价几何平均倍率值

免疫原性标准

2016年

2017年

H1N1A/California

H3N2A/HongKong

B/Brisbane

H1N1A/Michigan

H3N2A/HongKong

B/Brisbane

anti-HA抗体效价几何平均倍率

4,36

3,89

3,89

2,63

2,51

2,55

弗里德曼规则

<0,01

<0,01

<0,01

<0,05

<0,05

<0,05

注：* 接种Ultrix疫苗后，流感病毒不同抗原变异的志愿者血清中抗体效价的平均几何值的多重增加

在接种疫苗后的不同时间段检测到的anti-HA抗体效价之间的差异水平使用弗里德曼准则来测定，该准则用于比较48 (n) 血清研究的4个测定条件 (接种疫苗前的抗体滴度，21天、180天和10个月后) 。Хr²=70,05938的经验值反映秩数的显著差异。在x²0,05和x²0.01的显著性水平上，分别等于7.81和11.34，证实了接种后不同时间段产生的抗体滴度的非随机差异，在6个月后达到最大值。

结论

因此，临床研究的流感疫苗Ultrix的免疫反应的形成评估表明，免疫生物药物符合主要标准的免疫原性。Ultrix疫苗在接种21天后为90%以上的接种者提供了血清保护水平，并使流感抗体的平均几何滴度比初始水平提高了2.5倍以上。

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作者简介

Olga Evdokimova

Ryazan State Medical University

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ORCID iD: 0000-0002-5035-7302
SPIN 代码: 4822-7475
Researcher ID: G-7393-2019

MD, PhD, Associate Professor, Head of the Department of Microbiology

俄罗斯联邦, Ryazan

Stanislav Afanasiev

Scientific and Production Complex OOO FORT

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ORCID iD: 0000-0002-4222-2870
SPIN 代码: 7197-7329
Researcher ID: G-9232-2019

PhD in Pharmaceutical Sciences, Assistant Director of the Production Complex for Quality

俄罗斯联邦, Ryazan

Olga Antonova

Scientific and Production Complex OOO FORT

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SPIN 代码: 1266-3887
Researcher ID: 8100-2019

Head of Group of Virological Tests in Virological Laboratory of the Production Complex for Quality

俄罗斯联邦, Ryazan

Valentina Konopleva

Ryazan State Medical University

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MD, PhD, Associate Professor of the Department of Microbiology

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Ilya Gorelov

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Alla Kruglova

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Vladimir Biryukov

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SPIN 代码: 8828-1240
Researcher ID: B-9161-2019

MD, PhD, Head of Consultative and Diagnostic Center

俄罗斯联邦, Ryazan

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