Morphological characteristics and features in sertoli cell ultrastructure experimental varicocele

Full Text

По данным различных литературных источников, от бесплодия в мире страдает около 50-100 млн. человек [3, 10], то есть одна из 5-7 пар репродуктивного возраста является бесплодной [1]. Варикоцеле является наиболее распространенной причиной мужского бесплодия [5, 8]. Понятие «репродуктивная функция» складывается в первую очередь из процесса формирования половых клеток. Причиной мужского бесплодия и снижения сперматогенной функции яичка являются острые и хронические расстройства кровообращения в нем, потому что развивающиеся половые клетки очень чувствительны к гипоксии [2, 7]. Собственно, сперматогенез происходит в извитых канальцах, выстланных клетками Сертоли и герминогенными клетками, окружёнными перитубулярны-ми клетками и миоцитами. Основной функцией, выполняемой клетками Серто-ли, является обеспечение развития половых клеток - сперматозоидов, кроме того они формируют гематотестикулярный барьер за счёт плотных соединений между собой, выполняют опорную, трофическую, фагоцитарную функции [6]. В литературе дебатируются вопросы о степени эффективности оперативной коррекции варикоцеле, а также о влиянии этого заболевания на уровень сперматогенеза и фертильности мужчин. Цель исследования: установить анатомические морфометрические особенности клеток Сертоли при моделировании варикоцеле и после его лечения. Материалы и методы Экспериментальные исследования проведены на двадцати беспородных со-баках-самцах, массой от 9 до 12 кг. На проведение эксперимента получено разрешение комиссии по биоэтике Винницкого национального медицинского университета им. Н.И. Пирогова (протокол № 1 от 13 января 2011), которой установлено, что проведенные исследования соответствуют 17 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №4, 2013 г. этическим и морально-правовым требованиям согласно приказу МЗО Украины № 281 от 01.11.2000 г. При проведении исследований придерживались основных правил надлежащей лабораторной практики GLP (1981), закона Украины № 3447-IV «О защите животных от жестокого обращения» от 21 февраля 2006 г. Собак распределили на контрольную и опытную группы. В контрольной группе животных двум беспородным собакам (контроль 1) никаких вмешательств не проводили; трем животным (контроль 2) под тиопенталовым наркозом проводили вскрытие брюшной полости, после чего послойно ушивали брюшную стенку и через 30 суток выполняли рассечение и ушивание левого пахового канала. Животным опытной группы (пятнадцать собак) создавали модель варикоцеле. Моделирование варикоцеле прово-ди-ли на беспородных собаках-самцах. Парентерально вводили гонадотропин 300 ед/кг и 0,2 мл 1% раствора прогестерона в течение 10-ти суток. На следующие сутки проводили срединную лапаротомию, накладывали лигатуру на левую почечную вену на 2/3 ее диаметра в месте между нижней полой и яичковыми венами. Введенным через почечную вену бужом разрушали клапаны яичковой вены. Рану послойно зашивали. Операцию проводили под тиопенталовым наркозом: внутри-плеврально в области заднего угла правой лопатки вводили 2% раствор тиопентала натрия из расчета 1,5-2 мл на 1кг массы тела животного (30-40 мг/кг). Для пре-медикации использовали внутримышечное введение 2% раствора димедрола из расчета 0,2 мл на 1 кг массы тела животного (3-5 мг/кг) и 2,5% раствора аминазина из расчета 0,2 мл на 1 кг (5-7,5 мг/кг). Животных опытной группы разделили на три подгруппы. Животным первой подгруппы (пять собак) после создания модели варикоцеле никаких вмешательств не проводили. Животным второй опытной подгруппы (пять собак) через 30 суток после создания модели варикоцеле проводи ли хирургическое вмешательство по методике Иваниссевича. Операция выполнялась следующим образом. Проводился разрез кожи длиной 4 см. разрезался апоневроз наружной косой мышцы живота (длина разреза 2 см) по направлению волокон. Мышцы (внутренняя косая и поперечная) расслаивались над внутренним кольцом пахового канала. Варикозно расширенные яичковые вены находили между брюшиной и мышечной стенкой. Яичковые вены пережимались двумя зажимами Кохера, перевязывались и пересекались. Животным третьей опытной подгруппы (пять собак) через 30 суток после создания модели варикоцеле проводили оперативное вмешательство по собственной методике [4]. Формировали межвенозные анастомозы для улучшения оттока крови из гроздевидного сплетения. Париетальную брюшину отводили медиально. Забрюшинно находили яичковых вену и глубокую вену, огибающую подвздошную кость, пересекали их таким образом, чтобы проксимальный конец ветви глубокой вены, огибающей подвздошную кость, имел полноценный клапан. С помощью прецизионной техники почечный конец яичковой вены и проксимальный конец глубокой вены, огибающей подвздошную кость, сшивали между собой, формируя анастомоз по типу «конец-в-конец". Яичковый конец яичковой вены и проксимальный конец дополнительной поверхностной вены (или поверхностной вены, огибающей подвздошную кость) тоже сшивали между собой, формируя анастомоз по типу «конец-в-конец". Дистальные концы глубокой вены, огибающей подвздошную кость, и дополнительной поверхностной вены (или поверхностной вены, огибающей подвздошную кость) перевязывали. Интраоперационно при проведении реконструктивных операций вводили 0,3-0,5 мл гепарина, 5 мл трентала. Через 60 суток после создания модели варикоцеле животным контрольной и опытной групп исследовали оба яичка. Для забора материала животных после предварительной премедикации повторно вводили в 18 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №4, 2013 г. наркоз, фиксировали на операционном столе и проводили обработку операционного поля как для оперативного вмешательства. Операционную рану обрабатывали антисептиками и закрывали ее стерильными салфетками. После этого проводили операцию по удалению яичек, и забирали материал для морфологического исследования. Для электронно-микроскопического исследования кусочки яичка фиксировали в 2,5%-ном растворе глютаральдегида на 0,1 М фосфатном буфере и дофиксировали в 1%-ном растворе четырехокиси осмия на фосфатном буфере, 1% растворе таниновыми кислотами, обезвоживали в батарее спиртов возрастающей концентрации и ацетоне, проводили в смесях ацетона и эпона и заливали в смесь эпона и аралдита. Морфологические структуры контрастировали в процессе обезвоживания материала насыщенным раствором уранилацетатам, а на срезах - цитратом свинца. Срезы толщиной 40-60 нм, полученные на ультрамикротоме УМТП-7, изучали в электронном микроскопе ПЭМ-125 К. Статистическая обработка полученных результатов проведена с использованием параметрических и непараметрических методов оценки полученных результатов. Результаты и обсуждение В контрольной группе поддерживающие клетки (клетки Сертоли) были неправильной формы с отростками, плазмо-лемма основы лежала на базальной мембране. Крупные округло-овальные ядра с единичными инвагинациями кариолемы имеют электронопрозрачную кариоплазму в связи с тем, что в ней преобладает эух-роматин. Имеются осмиофильные ядрышки, много рибосомальных гранул (рис. 1). Цитоплазма эозинофильная. В перинукле-арном участке цитоплазмы имеются орга-неллы, небольшие митохондрии, отдельные канальцы гранулярной эндоплазма-тической сети, рибосомы, преимущественно первичные лизосомы, наблюдаются микрофиламенты. Морфометрический анализ параметров клеток Сертоли животных контрольной группы (контроль 1 и 2) показал следующие характеристики: диаметр клеток колебался от 11,77 мкм до 14,42 мкм, средний диаметр клеток составил 13,21±0,11 мкм. Площадь самых малых клеток соответствовала 108,77 мкм2, крупнейших - 163,33 мкм2, в среднем равнялась 137,49±2,27 мкм2. Клетки имели достаточно большие ядра, диаметр которых колебался от 5,99 мкм до 8,29 мкм и в среднем составлял 7,29±0,10 мкм. Маленькие ядра имели площадь 28,15 мкм2, самые большие 53,94 мкм2, средняя площадь ядра была равна 42,03±1,17 мкм2. Ядерноцитоплазматическое соотношение составляло 0,44± 0,01. Через 30 суток после моделирования варикоцеле (животные первой опытной группы) наблюдается деструкция поддерживающих клеток. Часть из них имеет ос-миофильную карио- и цитоплазму. Ядра неправильной формы, пикнотически изменены, с инвагинацией кариолемы и очагово-расширенными перинуклеарными пространствами. В кариоплазме определяются мелкодисперсный хроматин и плохо различимые ядрышки. Определяется деструкция органелл, канальцы эндоплазматиче-ской сети расширены, на отдельных участках значительно, и образуют светлые полости неправильной формы. Поврежденные митохондрии имеют электроннопрозрачный матрикс, редуцированные кристы. Цитоплазматические отростки истончены, в них также имеется деструкция органелл (рис. 2). Морфология клеток Сертоли животных после моделирования варикоцеле соответствовала результатам исследования других авторов [9]. Морфометрический анализ параметров клеток Сертоли через 30 суток после моделирования варикоцеле показал значительные изменения по сравнению с контролем. Площадь клеток была меньше (P <0,05) по сравнению с контролем в 1,43 раза, периметр клеток - в 1,2 раза (P <0,05), диаметр клеток - в 1,2 раза. Параметры ядер клеток через 30 суток тоже уменьшались. Площадь ядра через 30 суток была меньше (P <0,05) по сравнению с контролем в 2,45 раза, периметр ядра - в 1,58 раза (P <0,05), диаметр ядра - в 1,57 19 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №4, 2013 г. раза. Ядерно-цитоплазматическое соотношение клеток Сертоли после моделирования варикоцеле составило 0,21 ± 0,01. У животных второй опытной подгруппы через 30 суток после операции по Иваниссевичу площадь клеток Сертоли сравнению с 30-дневным сроком модели выросла - в 1,1 раза и составила в среднем 108,71±2,48 мкм2, однако была меньше (P <0, 05) по сравнению с контролем в 1,3 раза. Периметр клеток в среднем равнялся 38,36±0,43 мкм, что больше показателей 30-дневного срока модели - в 1,1 раза, но меньше показателей контроля в 1,1 раза. Возрос также диаметр клеток. Он был большим по сравнению с 30-дневным варикоцеле - в 1,1 раза, но меньше показателей контроля в 1,1 раза, а в среднем - 11,74±0,13 мкм. Площадь ядер клеток через 30 суток тоже была больше (P < 0,05) по сравнению с 30-дневным сроком модели в 1,3 раза и составила 22,87 ±0,87 мкм2, но была меньше показателей контроля в 1,8 раза. Периметр ядер клеток в среднем был меньше показателей контроля в 1,4 раза, но больше показателей 30-дневного срока модели - в 1,2 раза (P > 0,05). Увеличивался также диаметр ядер клеток. Он был меньше показателей контроля в 1,4 раза, но меньше по сравнению с 30дневным варикоцеле - в 1,2 раза, в среднем 5,37 ± 0,10 мкм (P < 0,05). Ядерноцитоплазматического соотношения клеток Сертоли через 30 суток после операции по Иваниссевичу составило 0,27 ± 0,01. Венозный застой в яичке приводит к структурным изменениям клеток Сертоли. Отмечаются осмиофильные поддерживающие клетки грушевидной и овальной формы, однако в ядрах могут быть крупные ядрышки. Ядра более светлые по сравнению с контрольной группой. По сравнению с ультраструктурой клеток через 30 суток после моделирования варикоцеле лучше сохранены органеллы цитоплазмы, вакуолизация также менее выразительна (рис. 3). У животных третьей опытной подгруппы через 30 суток после операции по собственному методу площадь клеток Сертоли сравнению с 30-дневным сроком модели выросла - в 1,5 раза, по сравнению с операцией по Иваниссевичу была больше в 1,3 раза, имела недостоверную разницу по сравнению с контролем и составляла, в среднем, 141,86±3,38 мкм2. Периметр клеток в среднем равнялся 43,64±0,55 мкм, что больше показателей 30-дневного срока модели - в 1,2 раза, и в 1,1 раза - по сравнению с операцией по Иваниссевичем, был также незначительно больше (P> 0,05) от показателей контроля. Увеличился также диаметр ядер клеток. Он был большим по сравнению с 30дневным варикоцеле в 1,6 раза, по сравнению с операцией по Иваниссевичу - в 1,4 раза, в среднем равнялся 7,27±0,08 мкм, незначительно отличаясь от параметров контроля. Площадь ядер через 30 суток после операции по собственному методу составила 41,63±0,90 мкм2, что в 2,4 раза больше (P <0,05) по сравнению с 30-дневным сроком модели и в 1,8 раза больше (P <0,05) по сравнению с операцией по Иваниссевичу (рис. 4). Ядерно-цитоплазматического соотношения клеток Сертоли через 30 суток после формирования межвенозних анастомозов по собственному методу составило 0,42±0,01, приближается к показателям контроля. Базальная мембрана четко контури-рована, умеренной толщины. Многие поддерживающие клетки с крупными округлыми ядрами с эухроматином в кариоплазме. В цитоплазме небольшие митохондрии, преимущественно первичные лизосомы, имеются фагосомы. Выводы Морфометрический анализ параметров клеток Сертоли яичка после моделирования варикоцеле показал, что по сравнению с контролем площадь, периметр и диаметр клеток и их ядер достоверно уменьшались с увеличением сроков варикоцеле. После операции по Иваниссевичу увеличивались показатели площади, периметра и диаметра клеток Сертоли и их ядер, однако недостаточно для нормализации их функции. Операция формирования межвеноз-ных анастомозов с использованием мик-рососудистого метода дает лучшие результаты регенерации клеток Сертоли по срав- 20 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №4, 2013 г. Рис. 1. Субмикроскопическая организация внутреннего расположения клеток извилистого семенного канальца яичка интактного животного. Ядро (1) и цитоплазма (2) поддерживающей клетки, сперматоцит первого порядка (3). х7000 Рис. 2. Субмикроскопическая организация стенки извилистого канальца и нижней части его внутреннего клеточного состава у животных при моделировании варикоцеле. Ядро (1) и цитоплазма (2) миоидной клетки, сустентоцит (3), сперматоцит I типа (4). х7000 Рис. 3. Субмикроскопическая организация извилистого семенного канальца и сперматогенного эпителия после моделирования варикоцеле и операции по Иванисевичу. Миоидна клетка (1), базальная мембрана (2), сустентоцит (3), сперматоцит I (4), и II (5) типов, х4000 21 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №4, 2013 г. Рис. 4. Сравнение показателей площади ядер клеток Сертоли у интактных животных, через 30 суток после создания модели варикоцеле, через 30 суток после выполнение операции по Иваниссевичу и через 30 суток после выполнения операции по собственному методу нению с традиционными обструктивными операциями, поскольку она нормализует ядерно-цитоплазматическое соотношение и создает тем самым более благоприятные условия для восстановления сперматоген-ной функции. При проведении дальнейших исследований перспективно провести морфо-метрию клеток Лейдига и изучить влияние на них изменений гемомикроциркуля-торного русла.

References

Supplementary files