ANALYSIS OF MORPHOLOGICAL AND FUNCTIONAL CHANGES OF PHYLOGENETICALLY DIFFERENT AREAS OF THE CEREBRAL CORTEX IN RATS

Abstract

In experiment conducted on outbred white male rats, irradiated with a single dose of 1.0 Gy, morphological changes of neurocytes in neo- , archi- and paleocortex were analyzed within 18 months after the exposure. The obtained regression equations enable to count the time elapsed after irradiation, on the data of morphofunctional state of nerve cells in irradiated animals.

Full Text

Оценка закономерностей реакции человека на различные экзогенные факторы и поиск средств профилактики, защиты и лечения - одна из основных задач современной медицины [8, 10, 11, 13]. Создавая адекватные экспериментальные модели, исследователи преследуют цель -изучение механизмов воздействия исследуемого фактора на организм человека путем экстраполяции полученных данных эксперимента, опираясь на общность симптоматики у различных видов животных и человека [4, 6, 7] и разработанные коэффициенты экстраполяции [2, 3]. Материалы и методы Эксперимент спланирован и проведен на базе Государственного научноисследовательского испытательного института военной медицины МО РФ (г. Москва). В его основу положены данные о лучевой нагрузке у военнослужащих-ликвидаторов аварии на ЧАЭС и состоянии их здоровья в ранние и отдаленные сроки пострадиационного периода. Эксперимент проведен на 100 половозрелых крысах-самцах весом 200-230 г, в возрасте 1,5-2 месяцев к началу эксперимента. Животные подвергались общему равномерному однократному гамма-облучению спектр 1,2 МЭв на установке «Хи-затрон» (Со60) в дозе и 1,0 Гр. Мощность дозы облучения составляла 50 сГр/ч. Взятие материала производилось через 1 сут, 6, 12 и 18 месяцев после воздействия. Протокол эксперимента в разделах выбора, содержания животных и выведения их из опыта был составлен в соответствии с принципами биоэтики и правилами лабораторной практики, представленных в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985) и приказе МЗ РФ №267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики». Дозиметрический контроль равномерности облучения осуществлялся клиническим дозиметром 27012, стержневая камера которого располагалась в поле облучения. Неравномерность дозового поля составила ± 15%. Материалом исследования служили участки мозга, выделяемые согласно цитоархитектоническим 28 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №3, 2014 г. картам [5, 12, 14] - вторичная моторная кора (кора верхней лобной извилины (ВЛИ), прелимбическая (кора передней лимбической области (ПЛО), цитоархи-тектонические поля СА1-СА4 гиппокампа и зубчатая фасция (ЗФ), пириформная зона древней коры (ПЗ). Фрагменты мозга фиксировали в 10%-ном растворе формалина, приготовленном на 0,2 М фосфатном буфере. Парафиновые срезы толщиной 4-5 мкм окрашивали гематоксилином Караци-эозином для обзорных целей. Для изучения цитоархитектоники микропрепараты окрашивали метиленовым синим по Нисслю [1]. В изучаемых отделах коры головного мозга с помощью программы “Видео-Тест-Морфо” (С.-Петербург) проводили измерение площадей сечения тела нейроцитов, их ядра и ядрышка. Вычисляли ядерно-клеточный, ядерно-цитоплазматический и ядрышко -ядерный индексы. Ввод изображения производился через оптическую систему микроскопа “Leika“, DMLS, с видеокамерой JVC ТК-1280Е и адаптером, подключенные к компьютеру “PENTIUM-II”. Для проведения регрессионного анализа у каждого животного учитывались морфометрические показатели для 300 нормохромных нейроцитов. Полученные данные обрабатывались с помощью программ «Microsoft Excel 2003», «Statistica 6.0» for Windows. Статистический анализ количественных переменных основывался на вычислении средней величины, дисперсии, среднего квадратичного отклонения, ошибки среднего арифметического, коэффициентов ассиметрии и эксцесса. При этом учитывали характер закона распределения параметров: в условиях нормального распределения выборки для оценки вероятности различий использовали критерий Стьюдента, в остальных случаях - непараметрический критерий Вилкоксо-на-Манни-Уитни. Объем материала, необходимого для исследования, определяли методом аккумулированных средних. Достоверными при этом считались различия с вероятностью более 0,95 (Р<0,05). Нами был выполнен множественный регрессионный анализ между шестью определенными независимыми параметрами, характеризующими строение нейроцита (табл. 1) и сроками прошедшими после воздействия радиоактивного излучения. Таблица 1 Параметры, характеризующие строение нейроцита Условное обозначение Наименование показателя a1 Площадь сечения нейрона a2 Площадь сечения ядра as Площадь сечения ядрышка a4 Ядерно-клеточный индекс a5 Ядерно-цитоплазматический индекс a6 Ядрышко-ядерный индекс Для исключения мультиколлинеарности матрицы данных перед выполнением регрессионного исследования в каждой выборке для каждого показателя был проведен анализ матрицы коэффициентов парной корреляции 6 абсолютных морфометрических показателей нейронов (ai-a6). Значения некоторых из них коррелируют между собой с коэффициентом r>0,7, то есть расцениваются статистически как одна независимая величина. Морфометрические показатели нейронов, имеющие высокий коэффициент корре ляции (r>0,7) были редуцированы. Множественный линейный регрессионный анализ выполнялся в пакете программ IBM SPSS Statistics 20.0 методом пошагового исключения. Данная методика заключается в последовательном исключении факторов с помощью t-критерия. В результате построения уравнения регрессии и оценки значимости всех коэффициентов регрессии из модели исключался тот фактор, коэффициент при котором незначим и имел наименьшее значение t-статистики по абсолютной 29 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №3, 2014 г. величине. Таким образом, получалось новое уравнение множественной регрессии, и снова проводили оценку значимости всех оставшихся коэффициентов регрессии. Процесс исключения факторов останавливался лишь на том шаге, при котором все регрессионные коэффициенты были значимы. В ходе регрессионного анализа сформированных выборок, получены следующие регрессионные уравнения с коэффициентами регрессии, статистически значимо отличные от нуля при p=0,050. После каждого уравнения в скобках указан коэффициент корреляции (R), коэффициент детерминации (R2), коэффициент Фишера (F) и уровень значимости уравнения регрессии [9]. Результаты и их обсуждение В результате проведенного исследования были получены данные, свидетельствующие о значительном снижении площади сечения нейроцита, ядра и ядрышка в первые сутки после воздействия, далее в течение всего срока наблюдения -исследуемые показатели приближаются к исходным значениям, однако к концу срока все же остаются ниже контрольного уровня. Следует отметить, что, несмотря на сходную динамику всех исследуемых нейроморфологических параметров в старой и древней зонах коры головного мозга к 18 месяцам после воздействия площади сечения нейроцита, ядра и ядрышка возвращаются к контролю или превышают исходный уровень. Используя массив полученных характеристик нормохромных нейроцитов в филогенетически различных зонах коры головного мозга крыс, проведен регрессионный анализ с целью установления времени, прошедшего после сеанса облучения. Для клеток верхней лобной извилины: хВЛИ=6549,263-23073,808ха4-19885,256ха6; (R=0,991, R2=0,983, F=6320,214, при p=0,000); Для нейронов передней лимбической области: хПЛО=3019,975-12543,889ха4; (R=0,974, R2=0,948, F=3994,051, при p=0,000); Для нейроцитов пириформной зоны древней коры: хДК=6734,480+12,316ха2-38382,045ха5; (R=0,999, R2=0,999, F=161555,968, при p=0,000); Для пирамидных клеток поля СА1 гиппокампа: xGA1=-25867,205+3808,413xa3+5947,680xa4+27854xa5; (R=0,999, R2=0,999, F=108725,868, при p=0,000); Для пирамидных клеток поля СА2 гиппокампа: xCA2=784,483+47,593xa1+36,220xa2-16108,331xa5-98,302xa6; (R=0,999, R2=0,999, F=3559458 1,51,при p=0,000); Для пирамидных клеток поля СА3 гиппокампа: xcA3=-10093,915+232,619xa2-427,988xa4-314,462xa5; (R=0,992, R2=0,985, F=4855,678, при p=0,000); Для пирамидных клеток поля СА4 гиппокампа: XcA4=-6424,106-9,858xa2+2579,453xa3; (R=0,983, R2=0,966, F=3185,017, при p=0,000); Для гранулярных клеток зубчатой фасции: X3®=-2459,512+31,028xa1+13,541xa3-1996,030xa5-215381,191xa6; (R=0,999, R2=0,999, F=656244,788, при p=0,000). Регрессионный анализ позволяет рассчитать с известной долей допущений [2, 3] время, прошедшее после воздействия заданной дозы ионизирующего излучения, по известным морфофункциональным характеристикам нейроцитов. Соответственно, возможны прогнозирование и корректировка предполагаемых изменений в различных в филогенетическом отношении зонах коры головного мозга. Заключение Таким образом, регрессионный анализ, проведенный по результатам эксперимента, позволил обосновать зависимость морфофункциональных изменений, развивающихся в нейроцитах филогенетически различных отделов мозга от времени, прошедшего после облучения.