P-glycoprotein expression in brain during ischemia-reperfusion

Full Text

Говоря о неврологии, нельзя не упомянуть того, что более 98% фармацевтических субстанций-кандидатов в препараты для терапии заболеваний центральной нервной системы никогда не достигают стадии клинических исследований [15]. Причиной этому зачастую является их недостаточное проникновение через гемато-энцефалический барьер (ГЭБ) для достижения минимальной эффективной концентрации в тканях мозга. В процессе транспорта лекарственных веществ через ГЭБ важную роль отводят функционированию глико-протеина-P (Pgp). Гликопротеин-Р (Pgp) - АТФ-зависи-мый мембранный белок-транспортер с широкой субстратной специфичностью [4]. Различные факторы внутренней и внешней среды, такие как генетические особенности, гормональный статус, гипоксия, прием ряда пищевых продуктов и лекарственных веществ способны влиять на активность Pgp и, как следствие, изменять проницаемость ГЭБ для субстратов белка-транспортера и приводить к неэффективности фармакотерапии или развитию нежелательных центральных эффектов [2, 5]. Доказано наличие Pgp в гематоэн-цефалическом барьере, глиальных клетках и нейронах головного мозга, где он совместно с другими защитными механизмами обеспечивает проникновение в ткани мозга лишь ряда низкомолекулярных веществ [17]. Инсульт встречается в среднем с частотой 200 случаев на 100000 населения [26]. Современные американские рекомендации по лечению ишемического инсульта не включают применение нейропротекторов для коррекции его послед- 44 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 4, 2015 г. ствий, вследствие недоказанности их клинической эффективности [11]. Одной из вероятных причин этого является недостаточное проникновение данной группы препаратов в головной мозг за счет эффлюкса Pgp. В ряде исследований как in vitro, так и in vivo показано, что экзогенная гипок-сическая гипоксия является индуктором функциональной активности и экспрессии Pgp [5, 12, 23]. Оценка экспрессии Pgp in vivo на фоне циркуляторной гипоксии выполнялась лишь в отдельных работах [6, 20]. Влияние на функционирование транспортера метаболических сдвигов при ишемии-реперфузии детально не изучалось, а полученные результаты носят противоречивый характер. Кроме того, разнонаправленные изменения функциональной активности и экспрессии Pgp на фоне окислительного стресса, продемонстрированные в ряде работ [23, 25], требуют проведения дополнительных исследований. В связи с вышеизложенным, целью настоящего исследования явилась оценка экспрессии Pgp в головном мозге при его ишемии-реперфузии, а также анализ корреляции между экспрессией транспортера и редокс-статусом ткани мозга. Материалы и методы Исследование выполнено на 38 крысах wistar массой 250-300 г. Манипуляции с животными осуществлялись в соответствие с правилами лабораторной практики (Приложение к приказу Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 года 708н). Животные были разделены на 2 серии. 1 -я серия - интактные животные (n=8), которым моделировали «ложную операцию» путем вскрытия кожи и мягких тканей шеи животного, выделения общей сонной артерии и ушивания раны. 2-я серия -это животные, которым моделировали ишемию головного мозга в течении 180 минут с последующей реперфузией. Животные 2-й серии были разделены на следующие группы: 60 мин, 4 ч, 24 ч, 5 суток и 14 суток после восстановления кровотока (n=6 на каждый срок опыта). Окклюзию общей сонной артерии моделировали под эфирным наркозом после вскрытия мягких тканей шеи животных, выделения правой общей сонной артерии и ее пережатия сосудистым зажимом в течение 180 минут. Все манипуляции выполнялись в условиях операционной вивария РязГМУ. По окончании исследования животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом. Для анализа забирали ткань правой лобной доли коры больших полушарий, часть которой фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина, а часть замораживали при -29°С для проведения биохимических исследований. Гистологический материал подвергался стандартной обработке, включающей обезвоживание в растворах этанола возрастающей концентрации, просветление ксилолом и помещение в парафин. Перед реакцией иммунного окрашивания проводили демаскировку антигенов тканей нагреванием на водяной бане в 10 мМ цитратном буфере (рН 6,0), блокировали эндогенную пероксидазу 3%-м раствором H2O2. Затем инкубировали срезы с первичными антителами к Pgp (Mdr-1 3H2833: sc-71557 «SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC», США) в разведении 1:50. Для иммунного окрашивания использовали полимерную систему детекции с пероксидазной меткой («DAKO», Дания). Ядра клеток докрашивали гематоксилином. Микропрепарат фотографировали цифровой камерой Canon Power Shot G5 c 400-кратным увеличением. В каждом гистологическом препарате оценивали 10 репрезентативных участков с помощью медицинской программы анализа и обработки цифровых изображений ImageJ. В связи с преимущественной локализацией Pgp в гематоэнцефалическом барьере головного мозга рассчитывали относительную площадь данной ткани, экспрессирующей Pgp как: площадь гематоэнцефалического барьера, экспрессирующего Pgp, (pix2) / общая площадь поля зрения (pix2). 45 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 4, 2015 г. В гомогенате коры больших полушарий определяли содержание ТБК-реактивных продуктов по реакции с тио-барбитуровой кислотой [1], свободных сульфгидрильных (SH) групп по реакции с дисульфид 5,5-дитиобис-2-нитробензо-атом [9], активность глутатионпероксида-зы (G-per) по реакции окисления восстановленного глутатитона с гидроперекисью третбутила и сопряженной с ней реакцией восстановления образовавшегося окисленного глутатиона НАДФН2 [3] и активность глутатион^-трансферазы (G-tr) по реакции конъюгации глутатиона с 1-хлор-2,4-динитробензолом, катализируемой данным ферментом [13]. Полученные результаты подвергали статистической обработке программой «StatSoft Statistica 7.0» и «БИОСТАТ». Тип распределения данных оценивали по критерию Шапиро-Уилка. При нормальном распределении данных использовали тест ANOVA, при распределении данных отличном от нормального - критерий Крускала-Уоллиса. Межгрупповые раз личия определяли по критерию Ньюмена-Кейсла. Зависимость экспрессии Pgp в гематоэнцефалическом барьере от изучаемых биохимических показателей оценивали по коэффициенту корреляции Пирсона (r) или Спирмена (Rs). Данные в таблицах представлены в виде среднего арифметического±стандартное отклонение (M±SD) - при нормальном распределении данных, или в виде медианы, нижнего и верхнего квартилей (Med, lq, uq) -при распределении данных, отличном от нормального. Результаты и их обсуждение 180-минутная односторонняя окклюзия общей сонной артерии крыс с последующей реперфузией в течение 60 мин, 4 ч, 24 ч, 5 суток и 14 суток приводила к снижению экспрессии Pgp в головном мозге через 60 мин и 4 после реперфузии на 52,5% и 63,1% (p<0,05) соответственно (рис. 1, табл. 1). В остальные сроки наблюдения изучаемый показатель достоверно от значений интактных животных не отличался (p>0,05). Рис. 1. Срезы коры лобной доли больших полушарий головного мозга крыс, окрашенные иммуногистохимически (х400 раз) 46 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 4, 2015 г. Окклюзия-реперфузия приводила к дуктов увеличивался через 60 мин после развитию выраженного окислительного реперфузии на 68,2% (p<0,05) по сравне-стресса в ткани коры головного мозга нию с показателями нормы. (табл. 1). Уровень ТБК-реактивных проТаблица 1 Выраженность окислительного стресса в коре больших полушарий и экспрессия гликопротеина-Р в гематоэнцефалическом барьере при односторонней окклюзии общей сонной артерии в течение 180 мин и последующей реперфузии Изучаемый показатель Серии эксперимента Интактные животные Ишемия-реперфузия 60 мин 4 ч 24 ч 5 дней 14 дней Экспрессия Pgp 1,42 (1,13; 1,596) 0,674 (0,598; 0,743)* 0,524 (0,43; 0,70)* 0,98 (0,94; 1,24) 0,89 (0,71; 1,17) 0,89 (0,75; 0,99) ТБК-реактивные продукты, нмоль/мг белка 8,98 (7,55; 9,8) 15,1 (11,4; 15,5)* 11,87 (10,78; 12,59) 11,65 (8,65; 13,6) 9,46 (7,7; 10,47) 11,79 (10,1; 12,55) SH-группы, мкмоль/мг белка 4,88 (4,2; 5,4) 3,5 (2,85; 4,07) 3,6 (3,4; 3,7) 2,77 (2,34; 3,33)* 2,78 (2,21; 3,48)* 3,3 (2,87; 3,53)* Активность G-tr, нмоль ХДНБ/мг белка*мин 80,8 (73,3; 87,97) 81,6 (66,62; 87,37) 72,12 (69,73; 87,20) 82,06 (69,7; 95,07) 84,95 (79,18; 90,18) 89,15 (78,24; 103,57) Активность G-per, нмоль НАДФН/мг белка*мин 19,68 (16,65; 22,16) 23,01 (17,53; 29,06) 16,4 (14,3; 18,04) 20,89 (15,95; 26,63) 19,46 (14,27; 22,96) 23,7 (20,38; 25,54) * - p<0,05 - достоверные различия по сравнению с показателями интактных животных Концентрация SH-групп снижалась через 24 ч после реперфузии на 43,2% (p<0,05), через 5 дней - на 43,0%, через 14 дней - на 32,4% (p<0,05). Активность G-tr и G-per достоверно от показателей интактных животных не отличались, хотя и имелась отчетливая тенденция к ее снижению на 4 час реперфузии. При проведении корреляционного анализа была выявлена обратная пропорциональная зависимость между экспрессией Pgp в гематоэнцефалическом барьере и концентрацией ТБК-реактивных продуктов в гомогенате мозга Rs=-0,425 (p<0,009). Экспрессия транспортера в мозге не коррелировала с остальными изучаемыми биохимическими показателями уровня окислительного стресса. В настоящем исследовании изучалась экспрессия Pgp в лобной доле коры головного мозга крыс при ишемии-реперфузии общей сонной артерии и ее корреляция с выраженностью окислительного стресса в ткани мозга. Установлено, что при окклюзии общей сонной артерии в течение 90 мин и последующей реперфузии выявляется снижение экспрессии Pgp в ГЭБ через 1 и 4 ч после реперфузии. В ткани мозга при этом наблюдается активация свободнорадикального окисления, что подтверждается повышением уровня ТБК-реактивных продуктов, снижением концентрации сульфгидрильных групп и тенденцией к снижению активности антиок-сидантных ферментов. В подавляющем большинстве исследований на культурах эндотелиальных клеток гематоэнцефалического барьера установлено, что гипоксическая гипоксия повышает экспрессию и функциональную активность Pgp, причем ведущая роль в регуляции данного процесса принадлежит ряду транскрипционных факторов, таких как HIF1, Sp1, Nrf2 [16, 18], а также ре-докс-статусу [18, 21]. С другой стороны, эксперименты in vivo демонстрируют неоднозначные результаты. 47 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 4, 2015 г. Исследование экспрессии Pgp у 3-месячных крыс со спонтанной гипертензией (3-month-old stroke-prone spontaneously hypertensive rats) показало более интенсивную экспрессию белка-транспортера и его иРНК в сосудах гиппокампа, чем у контрольных животных, а также по сравнению с сосудами коры [27]. Часовая ишемия печени крыс с последующей реперфузией в течение 4, 24, 48 часов и 1 недели привела к ингибированию экспрессии Pgp, а также возрастанию внутриклеточной концентрации флуоресцентного красителя родамина 123 - субстрата транспортера, что свидетельствует о снижении его функциональной активности [8]. Аналогично снижение печеночной экскреции родамина 123 на 26% было выявлено в другом исследовании при печеночной ишемии с последующей реперфузией в течение 24 часов, что может быть связано со сниженным поступлением в печень флуоресцентного красителя и угнетением синтеза АТФ. При этом экспрессия Pgp в мембране печеночных канальцев возрастала вдвое. В гема-тоэнцефалическом барьере мозга крыс изменения были аналогичны: 24%-е возрастание экспрессии транспортера при 30%-м снижении эффлюкса его субстрата [7]. Различия в представленных результатах могут быть связаны с рядом причин, например, разными объемом ишемизированного мозга, продолжительностью ишемии, областью головного мозга, которая забиралась для анализа. Анализ литературных данных свидетельствует также о разнонаправленном регуляторном влиянии редокс-статуса на функциональную активность и экспрессию Pgp. Вероятно, это связано с различной глубиной окислительного стресса, смоделированного в экспериментах [10, 19]. В ряде исследований показана большая уязвимость к оксидативному стрессу клеток, гиперэкспрессирующих Pgp, по сравнению с нормальными клетками [14, 24]. Поэтому возможной причиной ингибирования экспрессии Pgp в нашем эксперименте является выраженный окислительный стресс, вызывающий био деградацию белка-транспортера. Кроме того, установлено наличие белка, индуцируемого ишемией-реперфузией (ischemia-reperfusion-inducible protein - hIRIP), оказывающего ингибирующее влияние на эффлюксные транспортеры, в том числе Pgp. Выявлено, что экспрессия данного протеина повышается при окклюзии-реперфузии, а также эндотоксемии. hIRIP не изменяет биосинтез Pgp, однако оказывает негативное воздействие на его процессинг и способствует биодеградации белка-транспортера [22]. Выводы 1. Односторонняя окклюзия общей сонной артерии у крыс c последующей реперфузией приводит к развитию окислительного стресса в ткани лобной доли коры пораженного полушария головного мозга, и снижению экспрессии гликопро-теина-Р в головном мозге через 1 и 4 ч от момента реканализации. 2. Выявлена обратнопропорциональная зависимость между экспрессией глико-протеина-Р и уровнем ТБК-реактивных продуктов в ткани головного мозга.

References

Supplementary files