MYC FAMILY GENES IN SOLID-PSEUDOPAPILLARY TUMORS OF THE PANCREAS

Abstract

In the paper the study of molecular disorder genes c-Myc and N-Myc in solid-pseudopapillary tumor of the pancreas. Examined 24 samples of tumors obtained from 21 patients, including 19 primary, recurrent 1, 4 metastasis. Fluorescence in situ hybridization was performed using DNA samples lokusspetsificheskih to the loci 2p24, 6q23, 8q24 company «Vysis, Abbott Laboratories Inc», demonstrated that amplification of the N-Myc gene in solid-pseudopapillary tumor can be another confirming its neurogenic origin.

Full Text

Солидно-псевдопапиллярная опухоль (СППО) редкая злокачественная опухоль, составляющая 0,2 - 2,7% от общего числа злокачественных опухолей и около 6% всех экзокринных образований поджелудочной железы [22, 23, 30]. СППО возникает во второй - третьей декаде жизни преимущественно у лиц женского пола, хотя описаны случаи у мужчин и детей [21, 25, 33, 37]. В классификации ВОЗ СППО относятся к опухолям с неизвестным гистогенезом [3]. В ранних классификациях опухолей поджелудочной железы (ПЖ) они рассматривались в группе нефункционирующих опухолей из островковых клеток. Позднее, была выдвинута гипотеза происхождения данной опухоли из клеток полового гребня. Авторы предполагают, что в процессе эмбриогенеза закладка поджелудочной железы и полового гребня находятся близко друг к другу, поэтому клетки из полового гребня могут мигрировать в поджелудочную железу и, как следствие, под влиянием дисгормональных нарушений может развиться СППО, что косвенно подтверждается экспрессией прогестеронрецепторов опухолевыми клетками. [29, 35]. В подтверждение данной гипотезы Deshpande V с соавт. (2010) описали три случая подобных новообразований в яичниках со сходной с СППО-морфологией и иммунопрофилем [10]. В противовес данной гипотезе - «эмбриональной миграции» Heiser PW с соавт. (2008) на созданной экспериментальной модели на мышах путем активации ß-катенина в клетках поджелудочной железы, индуцировали рост опухоли, морфологически сходной с человеческой СППО, поэтому авторы предложили гипотезу развития данных опухолей из клеток-предшественников протокового эпителия [18]. Ряд исследователей, выявив диффузную экспрессию CD117 и DOG1 опухолевыми клетками СППО, предположили, что гистогенез СППО близок к гистогенезу гастроинтестинальных стромаль-ных опухолей, однако отсутствовали мутации с-KIT и PDGFRA. Более того, выявленная сходная экспрессия DOG1 как в центроацинарных клетках поджелудочной железы, так и в СППО, не исключает происхождение данной опухоли из дериватов ацинарных структур [2, 6]. 13 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 2, 2013 г. В последнее время в литературе активно обсуждается гипотеза происхождения СППО из производных не полового гребня, а нервной пластинки. Например, Chen c соавт. (2004) придерживаются данной гипотезы на основании выявленной ими меланоцитарной дифференци-ровки в СППО [8]. Cavard и соавт. (2009) поддерживают эту же гипотезу, исходя из активации генов и регуляторных белков, участвующих в Wnt-и Notch сигнальных путях, а также наличия экспрессии маркеров нейрогенной дифференцировки (SOX10 и TuJ-1) [7]. По данным Li L. И Guo Y. с соавт. (2011), клетки СППО обладают уникальной околоядерной точечной экспрессией онкомаркера CD99, первоначально характерного для группы опухолей нейроэктодермального происхождения [16, 20]. Также была выявлена очаговая экспрессия еще одного маркера нейроэктодермальных опухолей FLI-1, однако мутация гена EWS/FLI-1 не была подтверждена при молекулярных исследованиях [32]. Более того, иммуногисто-химическая (ИГХ) экспрессия опухолевыми клетками белка ß-катенина, являющегося рецептором Wnt пути, а также мутация гена ß-катенина, расположенного в 3 экзоне (CTNNB1) характерна не только для СППО, но и для медуллобластом, и примитивных нейроэктодермальных опухолей [1, 14, 17]. Во всех опухолях нервной системы также задействованы гены семейства Myc (c-Myc и N-Myc), при этом в большинстве случаев, отмечалась не только повышенная ИГХ- экспрессия белков генов семейства Myc, но и молекулярные нарушения в самих генах [4, 26, 27, 28]. Известно, что активированные гены семейства Myc в постнатальном периоде обладают способностью вызывать опухолевый рост, особенно в комбинации с другими онкогенами [13]. Целью нашего исследования явилось изучение молекулярных нарушений генов c-Myc и N-Myc в солидно- псевдопапил-лярной опухоли поджелудочной железы. Материалы и методы В исследовании использованы 24 образца опухолей полученных от 21 больного, из них: 19 первичных, 1 рецидивная, 4 метастаза. Флуоресцентная гибридизация in situ была проведена с использованием локусспецифических ДНК-проб (молекулярных зондов) к локусам 2p24, 6q23, 8q24 фирмы «Vysis, Abbott Laboratories Inc», США. Использовали парафиновые блоки фрагментов опухолей с предварительной гистологической окраской срезов для выбора наиболее репрезентативных участков для дальнейшего исследования. Далее срезы обрабатывали по следующей методике: депарафинация срезов в серии ксилолов, дегидратация в спиртах восходящей концентрации, обработка пепсином, денатурация и гибридизация с ДНК-зондами в гибридизационной камере HYBrite в течение 16-18 часов, отмывка, контрастирование и заключение препарата среду в DAPI I. По окончании реакции гибридизации срезы изучали во флюоресцентном микроскопе «Axio Imager A2» («Karl Zeiss», Германия). Изображение фиксировали с помощью цифровой CCD-видеокамеры «Axiocam» («Karl Zeiss»). Результаты оценивались после подсчета сигналов в 200 отдельно лежащих ядрах. В качестве контроля использовали непораженную ткань поджелудочной железы. Сбалансированным считали профиль при наличие в 90 % ядер двух сигналов от контрольной пробы и двух сигналов от исследуемой пробы. В случае наличия в 90 % ядер двух сигналов от контрольной пробы и более двух сигналов от исследуемой пробы выявлялась амплификация. Результаты и обсуждение Клинические данные по больным и макроскопическая характеристика опухолей приведены в таблице 1. Все больные исключительно женского пола, возраст колебался от 18 до 67 лет, средний возраст составил 34,4 года, при этом до 45 лет 17 больных (81%), после 45 - 4 (19%). Клинически доброкачественное поведение опухоли (без развития рецидивов и метастазов) отмечалось у 17 больных (81%). У четырех пациентов (19%) на момент наблюдения имелись метастазы опухоли, из них: в печень - 2 случая, лимфоузлы - 2, желудок - 2, селезенку - 1, большой сальник - 1, брыжейку тонкой и толстой кишки - 1. Размеры ме- 14 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 2, 2013 г. Таблица 1 Морфологические и молекулярно-биологические особенности _опухолей поджелудочной железы_ № п/п Воз раст Пол Размер опухолисм Наличие рецидива или метастазов Экспрессия ß-кате-нина FISH- інализ Г ен C-myc Ген N-myc 1 18 ж 5,5 да* да сбалансированный профиль амплификация 2 33 ж 2,5 нет да нет сигнала нет сигнала 3 67 ж 3,5 нет да сбалансированный профиль амплификация 4 44 ж 13 да** да сбалансированный профиль амплификация 5 48 ж 6.5 да*** да нет сигнала нет сигнала 6 19 ж 4 нет да сбалансированный профиль сбалансированный профиль 7 49 ж 9 да**** да сбалансированный профиль сбалансированный профиль 8 31 ж 0,6 нет да сбалансированный профиль сбалансированный профиль 9 36 ж 2,5 нет да сбалансированный профиль сбалансированный профиль 10 59 ж 5 нет да сбалансированный профиль сбалансированный профиль 11 42 ж 2 нет да нет сигнала нет сигнала 12 24 ж 3,5 нет да сбалансированный профиль амплификация 13 25 ж 3,5 нет да сбалансированный профиль сбалансированный профиль 14 21 ж 11 нет да сбалансированный профиль сбалансированный профиль 15 23 ж 3,5 нет да сбалансированный профиль амплификация 16 29 ж 11 нет да сбалансированный профиль сбалансированный профиль 17 24 ж 17 нет да нет сигнала нет сигнала 18 35 ж 3,5 нет да сбалансированный профиль амплификация 19 31 ж 15 нет да сбалансированный профиль сбалансированный профиль 20 39 ж 5,5 нет да сбалансированный профиль сбалансированный профиль 21 25 ж 2,5 нет да сбалансированный профиль амплификация * метастазы в парапанкреатические лимфоузлы **рецидив в культю поджелудочной железы с вовлечением в процесс левой почки, метастазы в печень, большой сальник, брыжейку тонкой и толстой кишки *** метастазы в желудок, селезенку ****метастазы в печень Рис. 1а. Операционный материал. Опухолевая ткань мягкая, розоватые солидные участки чередуются с кистозными полостями заполненными крошащимися массами Рис. 1б. Псевдососочковые структуры в СППО. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 200 Рис. 1в. Дистрофические изменения в СППО в виде скопления кристаллов холестерина и многоядерных клеток инородных тел. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 100 Рис. 1г. Дистрофические изменения в СППО в виде очагов миксоматоза и участков обызвествления. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 50_ 15 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 2, 2013 г. тастазов от 0,3 (в лимфоузлах) до 25 см (в печени). Длительность периода от первичной опухоли до появления метастазов составила 3, 72, 122 мес. В одном случае наблюдалось одномоментное выявление метастазов (в печень) и первичной опухоли. В одном случае отмечался рецидив опухоли в культе поджелудочной железы через 46 месяцев. Макроскопически СППО были представлены одиночным или множественными узлами размерами от 0,6 до 17 см (средний размер 6,2 см). Опухолевые узлы были инкапсулированы и хорошо отграничены от окружающей паренхимы железы. На разрезе опухолевая ткань мягкая, светло-коричневые или розоватые солидные участки чередовались с кистозными полостями и участками кровоизлияний. Кисты были заполнены темно бурым густым содержимым с крошащимися массами (рис. 1а). Макроскопически преобладал солидный вариант строения опухоли - 12 случаев (57,1%), также встречался кистозно-солидный - 8 (38,1%) и кистозный - 1 (4,8%). Микроскопически опухоли были представлены сравнительно мономорфными полигональными клетками, окружающими множество тонких капилляроподобных кровеносных сосудов (рис. 1б). Строма была представлена нежными фиброваскулярными прослойками с очагами миксоматоза и гиа-линоза. Также в ряде опухолей наблюдались дистрофические изменения в виде скопления шаровидных клеток с пенистой цитоплазмой (пенистые макрофаги), кристаллов холестерина, многоядерных клеток инородных тел, очагов миксоматоза, участков обызвествления и кровоизлияний (рис. 1в, г). Характерным гистологическим признаком являлось наличие по периферии опухоли так называемых «озер крови» с включением отдельных опухолевых клеток или их комплексов (рис. 2а). Макро- и микроскопическая характеристика метастазов и рецидивных опухолей была аналогична первичным СППО. Для подтверждения диагноза СППО во всех образцах проводилось ИГХ исследование опухоли на ß-катенин. Ядерная и цитоплазматическая экспрессия ß- катенина отмечена в 21 случае (100%) (рис. 2б). Флуоресцентная гибридизация in situ: в 4 случаях (после длительной фиксации в формалине) материал оказался непригоден для анализа результатов флуоресцентной гибридизации in situ из-за невозможности визуализировать сигналы от ДНК-зондов. Во остальных случаях (17) получен сбалансированный сигнал гена c-Myc (рис. 2в). Амплификация гена N-Myc выявлена в 7 из 17 случаев (41%), при этом в двух случаях опухоли проявляли агрессивное клиническое течение с развитием метастазов (табл. 1, рис. 2г). Известно, что Wnt и Notch сигнальные пути в период эмбриогенеза отвечают за дифференцировку нормальных тканей, в том числе играют ключевую роль в развитии нервной системы (рис. 3а,б). •• •'Vf'VSlin • м _£Г . ' Г. 'VÎ Рис. 2а. «Озера крови» в СППО. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 50 Рис. 2в. Сбалансированный сигнал гена C-myc в клетках С! Ц ПО, метод флуорисцентной гибридизации in situ, х600 Рис. 2б. Экспрессия ß-катенина клетками СППО. Метод иммуногистохимии. Ув. 50 Рис. 2г. Амплификация гена N-myc в клетках СППО, метод флуорисцентной гибридизации in situ, х600 16 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 2, 2013 г. OFF-State ON-State Рис. 3а. WNT-сигнальный путь В эмбриональном периоде ß-катенин выступает в качестве посредника диффе-ренцировки нервного гребня, подавляет эпидермальную дифференцировку и активирует пигментацию и рост нервных волокон [34]. Однако, некоторые исследования указывают на роль Wnt сигнализации в поддержании плюрипотентности и регулировании роста эмбриональных стволовых клеток [5, 24]. В постнатальном периоде эти сигнальные пути связаны с патогенезом примитивных «бластных» опухолей нервной системы таких как нейроб-ластома, медуллобластома, ретинобластома, глиобластома и примитивные нейроэктодермальные опухоли [11, 15, 19]. Кроме того, имеется связь Notch-пути с геном N-Myc, который является белком-мишенью Huwel убиквитин лигазы в Notch сигнализации [36]. Выводы Амплификация гена N-Myc в СППО может быть еще одним подтверждением ее нейрогенного происхождения. Однако, данная опухоль обладает низким потенциалом злокачественности и редко мета-стазирует и рецидивирует в отличие от агрессивного течения бластных опухолей 17 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, № 2, 2013 г. нервной системы. Возникают опухоли намного позднее и протекают более благоприятно. Возможно, это связано с тем, что свою агрессивность опухоли нервной системы проявляют в результате взаимодействия многих онкогенов. С другой стороны, у больных медуллобластомой и PNET экспрессия ß-катенина рассматривается в качестве маркера благоприятного исхода в отличие от других типов опухо лей (рак кишки, молочной железы, печени), в которых его ядерная экспрессия связана с прогрессированием заболевания [9, 12]. По предположению Tiemann K и соавт., мутации ß-катенина могут не влиять на скорость пролиферации в СППО в связи с активацией ингибиторов циклин-зависимой киназы p21 и p27, играющих важную роль в прекращении активирована Wnt сигнализации [31].