Отправить статью по E-mail 
АНАЛИЗ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ПРЕПАРАТА НООПЕПТ К СУБСТРАТАМ И МОДУЛЯТОРАМ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ABCB1-БЕЛКА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ IN VIVO
- Авторы: Черных И.В.1, Щулькин А.В.1, Якушева Е.Н.1, Гацанога М.В.1, Попова Н.М.1
-
Учреждения:
- Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова
- Выпуск: Том 25, № 1 (2017)
- Страницы: 30-41
- Раздел: Фармакология, клиническая фармакология
- Статья получена: 31.03.2017
- Статья опубликована: 31.03.2017
- URL: https://journals.eco-vector.com/pavlovj/article/view/6136
- DOI: https://doi.org/10.23888/PAVLOVJ2017130-41
- ID: 6136
Цитировать
Аннотация
В статье проанализировано влияние ноотропного препарата Ноопепт (N-фенил-ацетил-Ь-пролилглицина этиловый эфир) на функциональную активность ABCB1-белка и изучена его принадлежность к субстратам белка-транспортера на кроликах-самцах породы Шиншилла. Функционирование белка-транспортера оценивали по фармакокинетике его маркерного субстрата - фексофенадина. Фексофенадин вводили однократно внутрижелудочно в дозе 67,5 мг/кг до и после 14-дневного введения животным Ноопепта в дозе 10 мг/кг массы 3 раза в день. Количественное определение вещества проводили методом ВЭЖХ по разработанной ранее методике.
Для оценки принадлежности Ноопепта к субстратам ABCB1 -белка сравнивали его фармакокинетические параметры до и после курсового введения кроликам-самцам ве-рапамила - известного ингибитора данного белка-транспортера в дозе 20 мг/кг 3 раза в день. Фармакокинетику Ноопепта изучали по оригинальной методике ВЭЖХ.
Выявлено, что курсовое введение Ноопепта не приводило к достоверному изменению фармакокинетических параметров маркерного субстрата ABCB1 -белка - фексо-фенадина, что может свидетельствовать о сохранении функциональной активности данного белка-транспортера на исходном уровне. Установлено, что фармакокинетика Ноопепта не изменяется при курсовом введении кроликам ингибитора ABCBl-белка -верапамила, т.е. ноопепт не является субстратом данного белка-транспортера.
Ключевые слова
Полный текст
ABCB1-белок (гликопротеин-Р) - это мембранный АТФ-зависимый эффлюксный белок-транспортер, удаляющий из клетки широкий спектр эндогенных и экзогенных субстратов, включая лекарственные средства различных фармакологических и химических групп [1].
ABCB1-белок локализуется на мембранах эпителиоцитов слизистой оболочки тонкого кишечника и проксимальных канальцев нефронов почек, гепатоцитов, эн-дотелиоцитов гистогематических барьеров. Транспортер препятствует всасыванию лекарственных веществ, являющихся его субстратами в кишечнике, участвует в процессах распределения, способствует их выведению в желчь и мочу. Таким образом, от функциональной активности данного белка-транспортера зависит фармакокинетика лекарственных веществ-субстратов АВСВ1-белка, а значит эффективность и безопасность фармакотерапии [2]. Высокая активность АВСВ1-белка приводит к неэффективности лечения веществом-субстратом, а низкая активность - к передозировке.
Ноопепт (№фенил-ацетил^-пролил-глицина этиловый эфир) - дипептидный аналог пирацетама, являющийся современным оригинальным ноотропным и нейро-протективным препаратом, разработанным в НИИ фармакологии имени В.В. Закусова. Ноопепт применяется для терапии хронических ишемических поражений мозга, ряда нейродегенеративных заболеваний, шизофрении, эпилепсии [3].
В научной литературе отсутствуют исследования по оценке принадлежности Ноопепта к числу субстратов, индукторов и ингибиторов ABCB1-белка. Однако, исходя из химической структуры и физических свойств Ноопепта, можно предположить участие ABCB1-белка в его фармакокинетике или наличие у препарата способности модулировать его функциональную активность. Ранее среди модуляторов транспортера были обнаружены вещества пептидной структуры [4]. Описан механизм изменения функциональной активности ABCB1-белка веществами пептидной природы за счет непосредственного взаимодействия с частями его молекулы с модификацией его пространственной структуры [5].
Целью работы явилась оценка влияния Ноопепта на функциональную активность ABCB1-белка и принадлежность препарата к субстратам белка-транспортера.
Материалы и методы
Исследование выполнено на 12 половозрелых кроликах-самцах породы Шиншилла массой 3500-4300 г [6]. Работа с животными проводилась в соответствие с правилами лабораторной практики (Приложение к приказу Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 года 708н).
Животные были разделены на 2 серии: в первой серии (n=6) исследовали влияние Ноопепта на функциональную активность ABCB1-белка, во второй (n=6) -оценивали принадлежность Ноопепта к субстратам транспортера.
Животные первой серии получали фексофенадин (таблетки, покрытые оболочкой, Телфаст, 180 мг, Aventis Pharma, Италия) однократно внутрижелудочно в дозе 67,5 мг/кг массы [7] до и после 14дневного введения препарата Ноопепт (таблетки Ноопепт, 10 мг, ЗАО «ЛЕККО», Россия) в дозе 10 мг/кг массы 3 раза в день, а также на 5-й день его отмены [8]. Последнее введение Ноопепта выполняли утром за 20 мин до введения маркерного субстрата для возможности оценки прямого влияния препарата на ABCB1-белок (выбор времени обусловлен Tmax ноопепта -15 мин). После этого у кроликов забирали кровь из краевой вены уха в объеме 5 мл в гепаринизирован-ные пробирки, центрифугировали при 3000 об./мин в течение 10 мин для получения плазмы. В плазме крови определяли концентрацию фексофенадина методом ВЭЖХ на хроматографе «Stayer» (Россия) по методике, описанной ранее [9].
Животным второй серии вводили тестируемый препарат Ноопепт в дозе 50 мг/кг массы внутрижелудочно в форме суспензии на воде очищенной однократно до и после введения ингибитора АВСВ1-белка. Образцы крови забирали через 5, 10, 20, 30, 45, 60 и 90 мин после введения тестируемого препарата [10] с последующим анализом его фармакокинетики методом ВЭЖХ. Использовали хроматограф «Stayer» c УФ-спектрофотометрическим детектором при длине волны 206 нм. Состав подвижной фазы: вода деионизированная - ацетонитрил -ледяная уксусная кислота (50-50-0,1). Хроматографическая колонка Phenomenex Synergi 4u Polar-RP 80A (250х4,6) с зернением 4 мкм. В качестве ингибитора АВСВ1-белка животные получали верапа-мил (таблетки, покрытые оболочкой, 80 мг, Валента Фармацевтика ОАО, Россия) в дозе 20 мг/кг 3 раза в день [7] курсом 14-дней. Последнее введение верапамила выполняли утром - за 1 час до введения Ноопепта (время обусловлено lmax верапамила 1-2 ч).
Фармакокинетические параметры фексофенадина и ноопепта рассчитывали, используя модельно-независимый метод, с применением программы «Kinetica 5.0».
Полученные результаты обрабатывали с помощью программы «Stat Soft Statistica 7.0». Статистическую значимость различий между фармакокинетическими параметрами оценивали исходя из представления о логнормальном распределении данных. Сравнение изучаемых фармакокинетических параметров проводили с применением дисперсионного анализа повторных измерений (ANOVA) после их логарифмирования. Статистически значимыми принимали различия при значении р<0,05. Дополнительно рассчитывали двухсторонний 90% доверительный интервал отношения геометрических средних значений фармакокинетических параметров на фоне введения исследуемых веществ (верапамила и Ноопепта) к параметрам интактных животных. Согласно рекомендациям U.S. Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research [11] значимыми считаются различия между фармакокинетическими параметрами, если двухсторонний 90% доверительный интервал их отношения находится вне диапазона 0,8-1,25 (80-125%). Полученные результаты представлены в таблицах в виде среднего геометрического и его 95% доверительного интервала.
Результаты и их обсуждение
14-дневное введение кроликам-самцам Ноопепта не вызвало статистически значимых изменений ни одного из исследованных фармакокинетических параметров фексофенадина (табл. 1).
14-дневное введение кроликам-сам-цам ингибитора ABCB1-белка - верапами-ла не приводило к достоверному изменению фармакокинетики Ноопепта по сравнению с исходными параметрами (табл. 2).
В нашем исследовании в качестве маркерного субстрата АВСВ1 белка выбран рекомендуемый FDA гистаминолитик III поколения - фексофенадин, который не ме-таболизируется в организме, а его всасывание в кишечнике, распределение и элиминация зависят от функционирования данного транспортера. Поэтому динамика концентрации фексофенадина в крови характеризует функциональную активность АВСВ1 белка [7, 11, 12].
Таблица 1. Фармакокинетические параметры фексофенадина (67,5 мг/кг) до и после введения Ноопепта (10 мг/кг 3раза в день 14 дней)
Фармакокинетический параметр фексофенадина | Интактные животные (n=6) | Животные после введения Ноопепта (n=6) | Животные на 5-й день отмены Ноопепта (n=6) |
Omax, нг/мл | 241,3 (138,2; 421,2) | 360,7 (171,8; 757,5) | 331,2 (209,0; 524,9) |
AUC0-t нг*ч/мл | 2520,4 (1012,9; 6271,1) | 3023,9 (1682,7; 5433,9) | 2799,5 (2318,1; 3380,8) |
AUC/t1/2 | 203,9 (85,6; 486,3) | 247,2 (106,2; 575,4) | 219,6 (99,3; 485,6) |
Cl, л*ч-1 *кг-1 | 15,8 (4,8; 52,3) | 13,9 (6,4; 30,3) | 15,8 (11,2; 22,3) |
Примечание: данные представлены в виде среднего геометрического и его 95% доверительного интервала
Таблица 2. Фармакокинетические параметры Ноопепта (50 мг/кг) до и после введения верапамила (20 мг/кг 3раза в день 14 дней)
Фармакокинетический параметр Ноопепта | Интактные животные (n=6) | Животные после введения верапамила (n=6) |
С max, нг/мл | 44,43 (25,20; 78,33) | 26,16 (11,47; 59,70) |
AUCo^ok, нг*мин/мл | 1133,36 (599,19; 2143,74) | 932,89 (501,66; 1734,81) |
AUC0-t, нг*ч/мл | 1111,39 (596,81; 2069,63) | 854,067 (417,11; 1748,77) |
Cl, л*мин-1кг-1 | 44,12 (23,32; 83,45) | 53,60 (28,82; 99,67) |
AUC/t1/2, | 80,75 (38,38; 169,90) | 62,97 (21,36; 185,68) |
Примечание: данные представлены в виде среднего геометрического и его 95% доверительного интервала
Отсутствие статистически значимых изменений фармакокинетики фексофена-дина после курсового введения кроликам Ноопепта свидетельствует о том, что скорость абсорбции маркерного субстрата в кишечнике и интенсивность его экскреции не изменялись, что показывает сохранение функциональной активности ABCB1-белка на исходном уровне.
Ранее было установлено, что Ноопепт (10 мкМ) увеличивает ДНК-связывающую активность HTF-1 [13] - транкрипционного фактора, повышающего экспрессию ABCB1-белка [14]. Полученные нами результаты не согласуются с этими данными, видимо, потому, что мы использовали Но-опепт в условиях нормы у интактных животных и изучали функционирование транспортера на уровне целостного организма, а не в культуре клеток.
Возможной причиной отсутствия влияния Ноопепта на функциональную активность ABCB1-белка на уровне целостного организма, установленное в нашем исследовании, может являться короткий период его полувыведения, который по данным литературы составляет у кроликов 0,3±0,03 ч [10], что минимизирует возможность его прямого взаимодействия с белком-транспортером и изменения его активности. Кроме того, на уровне целостного организма ABCB1-белок испытывает влияние множества факторов (клеточное окружение, гормональный фон и пр.), в то время как in vitro они отсутствуют.
Оценка принадлежности лекарственных веществ к субстратам ABCB1-белка in vivo проводится следующим образом. Фармакокинетика тестируемого препарата оценивается до и после введения классических ингибитора и индуктора ABCB1-белка. Если курсовое введение кроликам-самцам ингибитора транспортера - верапамила приводит к увеличению плазменной концентрации тестируемого вещества и снижению его экскреции, а курсовое введение индуктора ABCBf-белка - рифампицина - к обратной динамике - делается вывод о принадлежности препарата к субстратам белка-транспортера [15]. В данной работе при пероральном введении Ноопепта интактным животным в дозе 50 мг/кг массы его максимальная концентрация в плазме крови составила 44,43 (25,20; 78,33) нг/мл. При этом, в случае принадлежности Ноопепта к субстратам ABCB1-белка, введение рифам-пицина дополнительно снизит его плазменную концентрацию, что не позволит детектировать ее применяемым нами способом. В связи с указанным ограничением, в нашей работе вводился только ингибитор белка-транспортера - верапамил, который повышает концентрацию в крови тестируемых субстратов.
Отсутствие достоверных различий между фармакокинетическими параметрами Ноопепта до и после курсового введения кроликам верапамила свидетельствует о том, что тестируемый препарат не является субстратом ABCB1-белка или вовлечение данного транспортера в процессы всасывания, распределения и экскреции тести руемого вещества не имеет существенного значения для его фармакокинетики.
Независимость фармакокинетики Но-опепта от функционирования ABCB1-белка, а также отсутствие влияния препарата на функциональную активность транспортера позволяет безопасно и без корректировки дозы назначать его совместно с препаратами, являющимися маркерными субстратами белка-транспортера (дигоксин, дабигатрана этаксилат, талинолол и др.) с минимальной вероятностью нежелательных межлекарственных взаимодействий.
Выводы
- Курсовое введение Ноопепта в дозе 10 мг/кг массы 3 раза в день в течение 14 дней кроликам-самцам не приводит к изменению функциональной активности ABCB1-белка, оцениваемой по фармакокинетике его маркерного субстрата фексофе-надина.
- Ноопепт не является субстратом ABCB1-белка по результатам тестирования in vivo, что подтверждается отсутствием значимых изменений его концентрации на фоне ингибитора ABCB1-белка - верапамила.
Конфликт интересов отсутствует.
Об авторах
И. В. Черных
Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова
Автор, ответственный за переписку.
Email: e.yakusheva@rzgmu.ru
к.б.н., ассистент кафедры общей и фармацевтической химии Россия
А. В. Щулькин
Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова
Email: e.yakusheva@rzgmu.ru
к.м.н., ассистент кафедры фармакологии с курсом фармации Россия
Е. Н. Якушева
Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова
Email: e.yakusheva@rzgmu.ru
д.м.н., проф., зав. кафедрой фармакологии с курсом фармации Россия
М. В. Гацанога
Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова
Email: e.yakusheva@rzgmu.ru
аспирант кафедры фармакологии с курсом фармации Россия
Н. М. Попова
Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова
Email: e.yakusheva@rzgmu.ru
к.м.н., ассистент кафедры фармакологии с курсом фармации Россия
Список литературы
- Montanari F., Ecker G.F. Prediction of drug-ABC-transporter interaction - Recent advances and future challenges // Adv. Drug. Deliv. Rev. 2015. Vol. 86. P. 17-26.
- Якушева Е.Н., Черных И.В., Щуль-кин А.В., Попова Н.М. Гликопротеин-Р: структура, физиологическая роль и молекулярные механизмы модуляции функциональной активности // Успехи физиологических наук. 2014. Т. 45, №4. С. 89-98.
- Островская Р.У., Вахитова Ю.В., Салимгареева М.Х., Ямиданов Р.С., Садовников С.В., Капица И.Г., Середенин С.Б. К механизму действия ноопепта: снижение активности стресс-индуцируемых протеин-киназ и активация экспрессии нейротрофи-нов // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2010. Т. 73, №12. С. 2-5.
- Новиков С.А. Гидрофильные гексапептиды - новый класс регуляторов АТФ-зависимых транспортных белков множественной лекарственной устойчивости: автореф. дис. ... канд. мед. наук. М., 2008. 24 с.
- Carrigos M., Mir L.M., Orlowski S. Competitive and Non-Competitive Inhibition of the Multidrug-Resistance-Associated P-glycoprotein ATPase // Eur. J. Biochem. 1997. Vol. 244, №2. P. 664-673.
- Гацанога М.В., Черных И.В., Щулькин А.В., Якушева Е.Н., Попова Н.М. Можно ли оценивать принадлежность лекарственных веществ к субстратам гликопротеина-Р на самках кроликов породы шиншилла // Наука молодых (Eruditio Juve-nium). 2016. №3. С. 5-10.
- Колхир С.В. Клиническое значение изучения активности транспортера лекарственных средств гликопротеина-Р для оптимизации фармакотерапии: автореф. дис. ... канд. мед. наук. М., 2007. 21 с.
- Коваленко Л.П., Смольникова Н.М., Алексеева С.В., Немова Е.П., Сорокина А.В., Мирамедова М.Г. и др. Доклиническое изучение токсичности ноопепта // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2002. Т. 65, №1. С. 62-64.
- Якушева Е.Н., Щулькин А.В., Черных И.В., Титов Д.С. Функциональная активность и экспрессия гликопротеина-P при экспериментальных манипуляциях // Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2014. №2. С. 74-77.
- Бойко С.С., Жердев В.П., Гуда-шева Т.А., Островская Р.У., Коротков С.А., Кравцова О.Ю. Биодоступность ноопепта -нового ноотропного препарата дипептид-ной структуры // Химико-фармацевтический журнал. 2004. Т. 38, №12. С. 3-5.
- Guidance for Industry Drug Interaction Studies - Study Design, Data Analysis, Implications for Dosing, and Labeling Recommendations / U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER). 2012. 75 p. Available at: http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidance complianceregulatoryinforma-tion/guidances/ucm292362.pdf.
- 12. Ohura K., Nakada Y., Kotani S., Imai T. Design of Fexofenadine Prodrugs Based on Tissue-Specific Esterase Activity and Their Dissimilar Recognition by P-Glycoprotein // J. Pharm. Sci. 2015. Vol. 104, №9. P. 3076-3083.
- Vakhitova Y.V., Sadovnikov S.V., Borisevich S.S., Ostrovskaya R.U., Gudasheva T.A., Seredenin S.B. Molecular Mechanism Underlying the Action of Substituted Pro-Gly Dipeptide Noopept // Acta Naturae. 2016. Vol. 8, №1. P. 82-89.
- 14. Ding Z., Yang L., Xie X., Xie F., Pan F., Li J. et al. Expression and significance of hypoxia-inducible factor-1 alpha and MDR1/P-glycoprotein in human colon carcinoma tissue and cells // Cancer Res. Clin. Oncol. 2010. Vol. 136, №11. P. 1697-1707.
- Якушева Е.Н., Щулькин А.В., Черных И.В. Оценка принадлежности мек-сидола к субстратам, ингибиторам или индукторам гликопротеина-P // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2015. Т. 78, №5. С. 19-23.
Дополнительные файлы
