Fetoplacental complex parameters’ changes during repeated increase of the blood volume in female rabbits

Full Text

Ключевая функция плаценты, которая обеспечивается плацентарным кровообращением, — это газообмен между матерью и плодом, а одним из факторов, способствующим увеличению поступления материнской крови к плоду, является объемная скорость кровотока через фетальную часть плаценты [10]. При нарушении регуляции плацентарного кровообращения у плода развивается гипоксия, приводящая к отставанию его роста и развития.

Плацентарная недостаточность является актуальной проблемой акушерства. Она характеризуется как универсальная реакция на различные заболевания матери, акушерские осложнения беременности, заболевания плода, в патогенезе которых играют важную роль сосудистые нарушения. Основным проявлением дисфункции плаценты считают расстройство ее кровообращения, в результате которого нарушается адекватное снабжение плода кислородом и питательными веществами, достаточное для его роста и развития в различные сроки беременности. Наиболее грозное осложнение хронической гипоксии плода — нарушение развития мозга, вследствие которого развиваются перинатальные неврологические осложнения различной степени тяжести [14]. У отставших в развитии плодов имеется большой риск развития когнитивных нарушений, проявляющихся даже в школьном возрасте [12].

Несмотря на то что в последние годы значительно расширился арсенал лекарственных средств, направленных на коррекцию плацентарной дисфункции, спектр уже разрешенных к применению в акушерской практике препаратов ограничен. Одним из обязательных этапов внедрения новых препаратов являются доклинические испытания, цель которых — изучить влияние лекарственных средств на развитие плодов и плацент. При проведении экспериментальных исследований основную группу животных, получающих лекарственный препарат, сопоставляют с контрольной группой животных, лекарственных средств не получающих. При этом объем испытуемого лекарственного средства, сам по себе, может значительно менять объем циркулирующей крови (ОЦК) экспериментального животного, особенно мелкого, а такое введение, повторенное многократно в течение нескольких дней, может кумулировать этот эффект, оказывая неблагоприятное влияние на функциональное состояние плода. Внутрисосудистое введение дополнительного объема жидкости почти всегда сопровождается рядом рефлекторных реакций в материнском организме, в числе которых реакции сосудов матки. При этом функциональное состояние плодов, особенно при беременности, осложненной плацентарной недостаточностью, может меняться весьма значительно. Это обстоятельство не всегда учитывают, определяя контрольную группу в экспериментальных исследованиях, проводимых на некрупных животных, например самках кролика.

Цель настоящего исследования — изучить влияние многократных инфузий физиологического раствора в объеме, сопоставимом с объемом лекарственных препаратов, используемых при лечении плацентарной недостаточности, на развитие плацент и мозга нормально развитых и отставших в развитии плодов самок кролика во второй половине беременности.

Материалы и методы

Исследование проведено на 21 самке кролика породы Шиншилла (Oryctolaguscuniculus) массой 3500–3800 г. Животные получены из ФГУП ПЛЖ «Рапполово» (Ленинградская область). Все животные были вергильными и содержались в регламентированных условиях вивария ФГБНУ «НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта» на стандартном рационе питания. Спаривание самок с самцами проводили в одно и то же время дня. Первым днем беременности считался следующий день после спаривания.

Для создания плацентарной недостаточности, сопровождающейся задержкой развития плодов, всем животным на 18-й день беременности, соответствующий началу второй половины беременности у человека, под эфирным масочным наркозом в условиях асептики осуществляли чревосечение. Матку с плодами выводили в операционную рану, подсчитывали количество плодов в обоих рогах матки, после чего один рог (интактный) погружали в брюшную полость, а в другом роге производили перевязку примерно ^1/3 преплацентарных сосудов у каждого второго плодовместилища. Брюшную полость ушивали, животные самостоятельно выходили из наркоза. В последующем самок содержали в стандартных условиях.

Рандомизацию животных осуществляли методом последовательных номеров, представляющим собой метод простой случайной выборки (интернет-руководство по статистике для медико-биологических исследований). Все животные были пронумерованы по порядку. Затем с помощью функции Excel «СЛУЧМЕЖДУ» беременные самки кролика были разделены на 2 группы. Самки I группы (n = 9) после перевязки преплацентарных сосудов до конца беременности оставались интактными. Животным II группы (n = 12) с 19-го по 28-й дни беременности (10 дней) в одно и то же время суток в латеральную ушную вену медленно одномоментно вводили 14,0 мл 0,9 % раствора хлорида натрия, составляющего 6 % ОЦК самки кролика. Инфузии физиологического раствора производили животным, находящимся в естественном положении (сидя).

На 29-й день беременности под внутривенным тиопенталовым наркозом путем воздушной эмболии производили эвтаназию животных с последующим подсчетом выживших интактных и отставших в развитии плодов, взвешиванием плацент и плодов и забором биологического материала (ткани мозга плодов и плацент) для биохимических исследований.

В тканях мозга и плацент определяли уровень белка, общую антиоксидантную активность (ОАА), свободнорадикальное окисление (СРО), активность глутатионпероксидазы (ГП). В ткани мозга плодов исследовали специфические для мозга ферменты — ВВ-изоформу креатинкиназы (ВВ-КК) и нейроспецифическую енолазу. Определение содержания общего белка в пробах осуществляли на автоматическом биохимическом анализаторе Alcyon 300 (фирмы Abbott, США) с использованием тест-систем фирмы Thermoscientific (Финляндия). Для изучения интенсивности СРО был использован метод хемилюминометрии. Интенсивность СРО оценивали по величине Н₂О₂ — индуцируемой хемилюминесценции, измеряемой на хемилюминометре Emilitle-1105 (Россия). Для оценки состояния антиоксидантной системы использовали определение общей антиоксидантной активности (ОАА) в гомогенатах тканей плодов, отражающей способность тормозить СРО субстрата в модельной системе [2]. ОАА тканей мозга определяли методом хемилюминометрии в системе, содержащей гомогенат тканей плодов, фосфатный буфер (Рh 7,4) и 1,01 мМ раствор FeSO₄. Инициацию процесса вызывали 2 % раствором Н₂О₂. Антиоксидантный потенциал пробы коррелировал с величиной тангенса угла наклона кривой на стадии максимального убывания вспышки и измерялся в условных единицах. Принцип метода определения ГП в тканях плацент и мозга плодов заключался в способности фермента окислять восстановленный глутатион в присутствии гидроперекиси третичного бутила. Активность фермента выражали в мМоль восстановленного глутатиона в минуту на 1 мг белка [4]. Определение активности ВВ-КК в центрифугате тканей мозга осуществляли на автоматическом биохимическом анализаторе Alcyon 300 (фирмы Abbott, США) с использованием тест-систем СК-МВ FS фирмы DiaSys (Германия). Количественное определение содержания нейроспецифической енолазы в ткани мозга плодов кролика осуществляли методом иммуноферментного анализа с использованием набора CanAg NSE EIA (Швеция), предназначенного для количественного определения нейроспецифической енолазы (НСЕ) в человеческой сыворотке [3, 6].

Статистическую обработку данных проводили при помощи программы Statistica v. 10.0. Данные приводили в виде M ± SE (средняя арифметическая ± ошибка средней арифметической), а в ряде случаев, в виде Me (медианы). Проверку характера распределения данных производили путем расчета критерия Колмогорова–Смирнова и Лиллиефорса. Сравнение данных зависимых выборок проводили при помощи T-критерия Стьюдента, критериев знаков и Вилкоксона. Сравнение независимых выборок осуществляли при помощи U-критерия Манна–Уитни.

Критический уровень достоверности нулевой гипотезы (об отсутствии различий и влияний) принимали равным вероятности не менее 95 % (p ≤ 0,05), что принято считать стандартом в медико-биологических исследованиях.

Научно-исследовательская работа проведена в соответствии с Федеральным законом от 12.04.2010 № 61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств» 1, «Правилами лабораторной практики» 2, 3, Санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержании вивариев 4 и решением Локального этического комитета ФГБНУ «НИИАГиР им. Д.О. Отта», регламентирующими проведение научно-исследовательских работ с использованием лабораторных животных 5.

Этические принципы обращения с лабораторными животными соблюдались в соответствии с European Convention for the Protection of Vertebral Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes (1996) [11]. Перед началом исследования его план и стандартные операционные процедуры были рассмотрены и утверждены Этическим комитетом ФГБНУ «НИИАГиР им. Д.О. Отта».

Результаты и обсуждение

В табл. 1 приведена выживаемость интактных и подопытных плодов самок, получавших (II группа) и не получавших (I группа) физиологический раствор. Выживаемость плодов в подопытном роге матки у животных I группы была на 29,3 % меньше, чем в интактном роге матки (р < 0,05), а у II группы животных их выживаемость была равнозначной. При этом доля выживших плодов к концу исследования в интактном роге самок II группы была в 1,4 раза меньше (р < 0,01), чем таковая самок I группы, у которых выжило большинство плодов. Доля выживших плодов в подопытном роге обеих групп самок не различалась.

 

Таблица 1 / Table 1

Выживаемость плодов, развивавшихся в условиях нормального (интактные) и уменьшенного (подопытные) плацентарного кровообращения, самок I и II групп / Survival rate of fetuses that developed under normal (intact) and reduced (experimental) placental circulation in group I and II rabbit females

 

Группы животных / Groups of animals	Количество живых плодов / Number of live fetuses
	интактные, n = 100 / intact		подопытные, n = 24 / experimental
	18-й день / Day 18	29-й день / Day 29	18-й день / Day 18	29-й день / Day 29
I группа / Group I	39	34	19	11*
II группа / Group II	61	39**	23	16

* p < 0,05 дано по сравнению с интактными плодами; ** p < 0,01 дано по сравнению с интактными плодами I группы.

* p < 0.05 for the comparison with the intact fetuses; ** p < 0.01 given in comparison with intact fetuses of group I.

 

У подопытных плодов самок I группы перевязка ¹/₃ преплацентарных сосудов вызывала развитие плацентарной недостаточности: они отставали по массе от интактных плодов на 11,8 % (р < 0,05), хотя массы их плацент и мозга были равнозначны (табл. 2). Массы плодов, их мозга и плацент в интактном и подопытном роге матки самок II группы не различались.

 

Таблица 2 / Table 2

Массы плацент, плодов и мозга плодов в интактном и подопытном роге матки у самок I и II групп / Placental, fetal and fetal brain weight in intact and experimental uterine horn in group I and II rabbit females

 

Масса / Weight	I группа / Group I		II группа / Group II
	интактные / intact	подопытные / experimental	интактные / intact	подопытные / experimental
Плодов, г / Fetuses, g	45,20 ± 1.35 (n = 14)	39,89 ± 1,77* (n = 11)	41,26 ± 1,60 (n = 16)	36,41 ± 2,31 (n = 15)
Плацент, г / Placenta, g	5,96 ± 0,28 (n = 14)	5,21 ± 0,29 (n = 11)	5,43 ± 0,22 (n = 16)	4,85 ± 0,28 (n = 15)
Мозга, г / Brain, g	1,13 ± 0,02 (n = 14)	1,07 ± 0,02 (n = 11)	1,07 ± 0,03 (n = 16)	1,03 ± 0,03 (n = 15)

* p < 0,05 дано по сравнению с интактными плодами.

Примечание. n — количество плодов.

* p < 0.05 given in comparison with intact fetuses.

Note. n – number of rabbit fetuses.

 

В табл. 3 приведены биохимические показатели, характеризующие процессы метаболизма, наблюдающиеся в ткани мозга интактных и подопытных плодов самок контрольной и основной групп.

 

Таблица 3 / Table 3

Показатели свободнорадикального окисления в ткани мозга интактных и подопытных плодов самок I и II групп / Indicators of free radical oxidation in the brain tissue of intact and experimental fetuses of female groups I and II

 

Биохимические показатели / Biochemical parameters	I группа / Group I		II группа / Group II
	интактные / intact	подопытные / experimental	интактные / intact	подопытные / experimental
Белок, мг/мл / Protein, mg/ml	4,18 ± 0.11 (n = 14)	4,38 ± 0,12 (n = 10)	4,40 ± 0,12 (n = 15)	4,41 ± 0,12 n = 14
Общая антиоксидантная активность, отн. ед. / Total antioxidant activity, rel.units	0,38 ± 0,01 (n = 13)	0,41 ± 0,03 (n = 11)	0,45 ± 0,03** (n = 16)	0,45 ± 0,03 (n = 15)
Свободнорадикальное окисление, отн.ед/мг белка / Free radical xidation, rel.units/protein mg	23,10 ± 1,60 (n = 14)	20,89 ± 0,50 (n = 9)	27,03 ± 1,66 (n = 15)	29,38 ± 1,52** (n = 14)
Активность глутатионпероксидазы, мк МGSH в мин/мкг белка / Glutathione peroxidase activity, mcg МGSH min/protein mg	2,45 ± 0,59 (n = 14)	4,81 ± 1,07* (n = 11)	1,53 ± 0,28 (n = 15)	1,16 ± 0,23** (n = 14)
Активность ВВ-изоформы креатинкиназы, ЕД/мг белка / BB-KK activity, U/proteinmg	7,41 ± 0,41 (n = 14)	7,57 ± 0,27 (n = 11)	7,6 ± 0,20 (n = 16)	6,48 ± 0,28*,** (n = 15)
Содержание енолазы, мкг/мг белка / Enolasecontent, mcg/proteinmg	2,10 ± 0,11 (n = 14)	2,06 ± 0,10 (n = 11)	2,09 ± 0,11 (n = 15)	2,06 ± 0,11 (n = 16)

* p < 0,05 дано по сравнению с интактными плодами; ** p < 0,05 дано по сравнению с I группой.

Примечание. n — количество плодов

* p < 0.05 for the comparison with the intact fetuses; ** p < 0.05 for the comparison with the I group.

Note. n – number of fetuses.

 

Известно, что развитие плацентарной недостаточности может сопровождаться развитием у плодов, в том числе в ткани их мозга, окислительного стресса, который может быть связан с нарушением баланса свободно-радикальных процессов и эффективности антиоксидантной защиты [1]. Окислительный стресс в зависимости от интенсивности и длительности воздействия повреждающего фактора может вызывать, на первом этапе, формирование адаптивных механизмов, заключающихся в появлении нового соотношения между процессами свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты, а в дальнейшем, гибель клеток. При этом значительная роль в системе антиоксидантной защиты принадлежит ее глутатионзависимому звену [5].

Активность ГП у подопытных плодов самок I группы была почти в 2 раза выше (р < 0,05) по сравнению с таковой в мозге интактных плодов. Известно, что при окислительном стрессе, который наблюдается у подопытных плодов, нарушается баланс между про- и антиоксидантной системами биологического объекта как за счет неферментативного звена антиоксидантной защиты, о котором можно судить по значениям интегральных показателей ОАА и СРО, так и ферментативного звена, важным представителем которого является ГП. Увеличение активности ГП у подопытных плодов в нашем случае говорит об изменении активности ферментативного звена антиоксидантной защиты. Активация глутатионзависимого звена антиоксидантной защиты способствовала нормализации процессов СРО, интенсивность которых в тканях мозга подопытных плодов не изменилась, так же как показатель ОАА. Таким образом, у подопытных плодов в используемой нами экспериментальной модели наблюдалось развитие умеренного окислительного стресса, сопровождавшегося компенсаторной активацией в тканях их мозга ферментов глутатионзависимого звена антиоксидантной защиты.

Специфичный для мозга фермент, содержащийся главным образом в астроцитах и нейронах, — ВВ-КК [13]. Многочисленные авторы считают, что на фоне гипоксии наблюдается переход ВВ-КК из мозговой ткани в общий кровоток [17]. Этот факт дает основание считать, что увеличение активности ВВ-КК в крови плодов/новорожденных является маркером повреждения клеток мозга, где активность ВВ-КК снижается. Другим маркером повреждения нейронов может быть нейроспецифическая енолаза, содержание которой в крови в условиях гипоксии повышено [9]. Равнозначные активности ВВ-КК и содержания енолазы в тканях мозга подопытных и интактных плодов самок I группы, полученные в наших исследованиях, свидетельствуют об отсутствии повреждений клеток мозга у подопытных плодов при данной степени созданной у них гипоксии (табл. 3).

Таким образом, экспериментальная модель хронической плацентарной недостаточности, созданная путем перевязки ^1/3 преплацентарных сосудов в одном роге матки самок кролика обеих групп, является адекватной, воспроизводящей условия хронической плацентарной дисфункции, приводящей к формированию отставания в развитии плодов в клинической практике. Это подтверждается как меньшей (на 11,8 %) по сравнению с интактными массой подопытных плодов, так и увеличением в 2 раза активности ГП в ткани их мозга при равнозначной активности ВВ-КК и содержании енолазы в тканях мозга интактных и подопытных плодов контрольной группы самок, что свидетельствует об отсутствии повреждений у них клеток мозга.

Патогенез изменений, происходящих у плодов при изменении у них ОЦК, мало изучен. В исследовании [15] было изучено влияние увеличения ОЦК на недоношенный плод овцы в III триместре беременности, вызванного введением декстрана (в дозе 20 мл 6 % раствора) непосредственно плоду в нижнюю полую вену. Авторы исследовали в хроническом опыте церебральный кровоток и метаболизм катетеризированных плодов овцы при их нормоксии и гипоксии. Быстрое увеличение ОЦК при нормоксии у плода вызывало уменьшение концентрации гемоглобина и, следовательно, содержания кислорода в артериях плода. При этом артериальное давление и кровоток в мозге плода не изменялись. Авторы полагают, что быстрое увеличение ОЦК вызывает анемию у плода за счет гемоделюции, при которой не успевает развиться компенсаторное увеличение церебрального кровотока, что ведет к развитию гипоксии мозга. При наличии же гипоксии увеличение ОЦК еще больше нарушает снабжение плода кислородом и утяжеляет степень его гипоксии.

У плодов самок, которым производили инфузии физиологического раствора (II группа), отставания в росте подопытных плодов по сравнению с интактными плодами не было (табл. 2). У подопытных и интактных плодов масса тела, плацент и мозга были равнозначными. Не было различий в этой группе и между выживаемостью подопытных и интактных плодов (табл. 1). Однако функциональное состояние этих плодов значительно различалось, показателем чего было их выживание в конце опыта. Так, выживаемость интактных плодов самок II группы была в 1,4 раза меньше таковой у интактных плодов самок I группы (р < 0,01).

Активность ВВ-КК в ткани мозга подопытных плодов самок II группы была на 14,6 % меньше, чем у интактных плодов (р < 0,01), что по данным литературы может быть связано со снижением скорости метаболических процессов в мозговой ткани плодов, развивающихся в условиях хронической плацентарной недостаточности [16].

В тканях мозга интактных плодов II группы самок значения ОАА были выше по сравнению с таковыми интактных плодов самок I группы (р < 0,01), что свидетельствует, что многократное введение животным жидкости в объеме 14,0 мл приводило к изменению активности неферментативного звена антиоксидантной защиты и было значимым для метаболизма мозговой ткани интактных плодов II группы. Значения СРО в ткани мозга подопытных плодов cамок II группы были в 1,4 раза выше, а активность ГП в 4,1 раза ниже по отношению к таковой подопытных плодов самок I группы. Следовательно, в ткани мозга подопытных плодов II группы окислительный стресс сопровождался подавлением активности ГП и увеличением СРО, что свидетельствует о развитии окислительного стресса большей интенсивности по отношению к таковому подопытных плодов I группы.

Активность ВВ-КК в ткани мозга подопытных плодов II группы животных была почти в 1,2 раза ниже по сравнению с таковой подопытных плодов I группы (р < 0,05). Снижение активности ВВ-КК в тканях мозга этих плодов свидетельствует о срыве адаптивно-приспособительных реакций и сопровождается нарушением метаболизма клеток мозга. Содержание енолазы в тканях мозга подопытных и интактных плодов cамок I и II группы не различалось (табл. 3).

Известно, что при введении больших объемов жидкости, в том числе и физиологического раствора, скорость их выведения из сосудистого русла относительно небольшая [8]. В доступной литературе отсутствуют данные о значимых изменениях кровообращения при введении малых объемов жидкости в хроническом опыте. По данным Е.М. Шифмана и А.Д. Тиканадзе [7], которые изучали в остром опыте влияние введения малых доз перфорана и физиологического раствора (6 % ОЦК) на процессы, происходящие в микроциркуляторном русле брызжейки крыс, было показано, что на фоне стабильных показателей артериального давления сразу после введения этих растворов на 1-й минуте в артериях наблюдается кратковременное увеличение кровотока, объемная скорость которого к 5-й минуте возвращается к исходному уровню и в последующем конкордантно снижается в обеих группах, составляя через 25–30 мин после введения примерно половину от исходной. Эти исследования показывают, что при незначительных изменениях ОЦК его восстановление происходит довольно быстро. Однако в нашем исследовании видно, что ежедневное введение физиологического раствора, даже в относительно небольших дозах, может значимо менять метаболизм мозга как интактных, так и, еще в большей степени, подопытных плодов.

Выводы

Таким образом, многократное ежедневное введение физиологического раствора, составляющего 6 % ОЦК самки кролика, во второй половине беременности, вызывает нарушение функционального состояния нормально развитых и отставших в развитии плодов, что проявляется изменением их выживаемости и нарушением метаболизма мозга. Полученные результаты необходимо учитывать в экспериментальных исследованиях, направленных на доклиническую апробацию лекарственных средств.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Соблюдение этических стандартов. Этические принципы обращения с лабораторными животными соблюдались в соответствии с European Convention for the Protection of Vertebral Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes [11]. Перед началом исследования его план и стандартные операционные процедуры были рассмотрены и утверждены Этическим комитетом ФГБНУ «НИИАГиР им. Д.О. Отта»

1 Федеральный закон от 12.04.2010 №61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств».

2 Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении Правил лабораторной практики»..

3 Приказ Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 02 декабря 2009 г. № 544-ст. Национальный стандарт Российской Федерации ГОСТ Р53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики».

4 Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержании вивариев. Утверждены Главным Государственным санитарным врачом 06.04.1973 № 1045-73.

5 Протокол № 64 от 01.04.2014.

About the authors

Nataliya G. Pavlova

Pavlov First St. Petersburg State Medical University

Author for correspondence.
Email: ngp05@yandex.ru

MD, PhD, Dr. Sci. (Med.), Professor, Department of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Medicine

Russian Federation, Saint Petersburg

Anastasiya A. Yakovleva

Pavlov First St. Petersburg State Medical University

Email: biomed.1spbgmu@yandex.ru

PhD, Senior (Junior) Researcher, Laboratory of Pathophysiology of the Biomedical Research and Education Institute

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files