Effects of a single introduction of pamidronate on intact bone under the conditions of the experimental model of the treatment of tuberculosis ostitis

Full Text

АКТУАЛЬНОСТЬ

Основа хирургического лечения костно-суставного туберкулеза состоит в радикальной резекции деструктивных очагов в пределах здоровых тканей [2, 5, 7, 8, 14, 15]. Восстановление костной ткани в зоне оперативного вмешательства может происходить с формированием заполненных рубцовой тканью остаточных пострезекционных полостей [1], как предикторов развития ортопедических последствий и осложнений, особенно при локализации в метаэпифизарных отделах нижних конечностей. Один из методов восстановления костной ткани в зоне резекции — применение костно-пластических материалов [4, 6, 12]. Однако в условиях послеоперационной адаптации имплантаты подвергаются закономерным биологическим процессам перестройки, первой их фазой является лизис, который в условиях исходного инфекционного процесса может быть преждевременным. При этом даже нормально протекающая адаптация имплантата в больших костных дефектах требует большего времени для восстановления и, следовательно, иммобилизации и ограничения осевой нагрузки на пораженный сегмент, что ухудшает условия реваскуляризации и остеогенеза, замедляя процессы остеорегенерации. Другим методом регуляции костеобразования можно считать торможение активности остеокластов, обеспечивающих остеорезорбцию как один из начальных механизмов репаративной остеорегенерации. Указанным действием селективно обладают бисфосфонаты — препараты на основе пирофосфата, обладающие не только эффектом торможения дифференцировки остеокластов из предшественников, но и противовоспалительной активностью [17, 18]. Бисфосфонаты используют при лечении как системных, в том числе моногенных заболеваний скелета — первичного [10] и вторичного остеопороза [3], так и при очаговых поражениях — кистах, метастазах литических опухолей, небактериальном остеомиелите [9, 11, 13, 16].

На сегодняшний день отсутствуют сведения о влиянии бисфосфонатов на костную ткань (включая исходно здоровую) в условиях лечения специфического инфекционного процесса, в том числе на фоне противотуберкулезной терапии.

Цель исследования — изучение морфологических и морфометрических особенностей интактной костной ткани контралатеральной конечности в условиях комплексного лечения экспериментального туберкулезного остита.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

На модели туберкулезного остита^* медиального мыщелка правой бедренной кости (инфекционный агент — вирулентный лекарственно чувствительный референс-штамм Mycobacterium tuberculosis H37Rv из коллекции ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России) у 21 половозрелого кролика-самца породы Советская шиншилла (ФГУП «Питомник лабораторных животных „Рапполово“» Национального исследовательского центра «Курчатовский институт») изучены морфологические особенности и морфометрические характеристики интактных бедренных костей, репрезентативно отобранных из четырех экспериментальных групп:

• группа 1 (контроль) — течение туберкулезного остита без какой-либо терапии на протяжении всего периода наблюдения;
• группы 2–4 — выполнено радикальное хирургическое удаление очага с костной пластикой (OSTEOSET^® 2 DBM), в том числе дополненное: группа 2 — противотуберкулезной терапией (ПТТ) с учетом известной чувствительности штамма микобактерий (изониазид в дозе 10 мг/кг, пиразинамид и этамбутол по 20 мг/кг перорально 5 раз в неделю, 6 мес.), группа 3 — противотуберкулезной терапией и однократным введением бисфосфонатов (памидроновая кислота в дозе 1 мг/кг внутривенно капельно через 10 дней после хирургического лечения), группа 4 — только однократным введением памидроновой кислоты.

Модельные животные содержались в условиях сертифицированного вивария ФГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии» Минздрава России. Выведение кроликов из эксперимента проводилось в соответствии с Рекомендациями Европейской комиссии по эвтаназии животных через 6 мес. после операции. Из аутопсийного материала дистальных эпиметадиафизов интактных бедренных костей изготовлены гистологические срезы толщиной 3–5 мкм, которые в последующем оцифрованы для проведения морфометрического исследования. Изучены: макро- и микроструктура препаратов, средние (M) значения площади костной ткани (M, % площади препарата), толщины костных балок (M, мкм), числа остеобластов, остеоцитов, остеокластов (M, п/зр.) и доля их активных форм (%).

Статистическая обработка данных выполнена в программе Statistica 12, для оценки характера распределения использовали критерий Шапиро – Уилка, применяли методы описательной статистики (Me [Q₂₅; Q₇₅]) и непараметрические методы (критерии Краскела – Уоллиса, Манна – Уитни). Статистические расчеты производились по данным 10 полей зрения с определением среднего (M) значения показателя для препарата.

NB! Анализ особенностей костной ткани непосредственно в зоне моделирования туберкулезного остита не является целью настоящей публикации.

РЕЗУЛЬТАТЫ

При морфологическом исследовании макро- и микропрепаратов ни в одном случае не выявлено специфического поражения, отсутствовали инфильтративные изменения, признаки ремодуляции и фиброзирования. Суставная поверхность представлена гиалиновым хрящом правильного гистологического строения с гладкой поверхностью, отчетливым остеохондральным переходом без дистрофических изменений (рис. 1). Кортикальная кость в эпифизарной зоне представлена зрелой пластинчатой костной тканью с хорошо визуализирующимися остеонными структурами и гаверсовыми каналами. Надкостница умеренно васкуляризована, нормального гистологического строения, без признаков воспаления.

 

Рис. 1. Макропрепарат дистального эпиметадиафиза левой бедренной кости кролика. 1 — Гиалиновый хрящ; 2 — кортикальная кость; 3 — метаэпифизарная пластинка; 4 — костный мозг

Fig. 1. Gross specimen of the distal epimetadiaphysis of the left rabbit femur. 1 — Hialine cartilage; 2 — cortical bone; 3 — metaepiphyseal plate; 4 — bone marrow

 

В зоне дистального эпифиза бедренной кости трабекулярное строение сохранено, костные балки формируют петлистую сеть, заполняющую пространство всей эпифизарной зоны. Метаэпифизарная пластинка представлена зрелыми костными балками, выражена слабо (рис. 2).

 

Рис. 2. Зона эпиметафиза левой бедренной кости, окраска гематоксилином и эозином, оцифрованный препарат: a — препарат группы 3; b — препарат группы 4

Fig. 2. The area of the epimetaphysis of the left femur, hematoxylin-eosin staining, digitized preparation: a — preparation of group 3; b — preparation of group 4

 

Межбалочное пространство эпифизарной зоны представлено ретикулярной стромой с адипоцитами, встречаются единичные клетки костного мозга, которые в большинстве представлены лимфоцитами и гранулоцитами, редко моноцитами/макрофагами. Встречаются локальные участки с повышенной клеточностью.

Сосудистая сеть развита, представлена сосудами различного калибра венозного и артериального типа. В диафизе костный мозг нормального гистологического строения, определяются клетки всех ростков гемопоэза на всех стадиях развития, соотношение гемопоэтического и жирового компонентов 50/50.

На поверхности костных трабекул обнаружены в основном покоящиеся остеобласты (рис. 3).

 

Рис. 3. Костные балки образцов контрольной группы, эндостальная зона с неактивными остеобластами, окраска гематоксилином и эозином: a — ув. ×100; b — ув. ×400

Fig. 3. Bone beams of the samples of the control group, endosteal zone with inactive osteoblasts, hematoxylin-eosin staining: a — magn. ×100, b — magn. ×400

 

Медианные значения исследуемых показателей для всех препаратов составили (Me [Q₂₅; Q₇₅]): площадь костной ткани — 24,0 [18, 0; 29, 0] %, толщина костных балок — 117,8 [106, 3; 122, 8] мкм, число остеобластов — 6,8 [6, 5; 11, 2], остеоцитов — 10,4 [9, 6; 11, 4]. Доля активных остеобластов составляет 0,3 [0, 2; 0, 4] % от клеток эндостальной зоны, доля активных остеоцитов от общего количества остеоцитов — 0,2 [0, 1; 0, 2]%. Остеокласты не обнаружены ни в одном из препаратов. Разброс данных клеточного состава препаратов в разных группах проиллюстрирован на рис. 4.

 

Рис. 4. Клеточность препаратов (M клеток на 1 п/зр., ув. ×1000)

Fig. 4. Cellularity of preparations (M cells in the field of view, magn. ×1000)

 

В препаратах разных групп выявлены следующие особенности (рис. 4–6):

• на фоне отсутствия как оперативного, так и медикаментозного лечения (группа 1) определяются минимальные значения площади костной ткани (17 %) и толщины костных балок (98 мкм), максимальное количество остеобластов — 11,2 п/зр. (9,5 [8, 25; 13, 5], p < 0,05), в том числе активных — 4,7 п/зр. (5,0 [1, 75; 6, 0], p < 0,05), среднее количество остеоцитов — 10,6 п/зр. (10,5 [9, 0; 12, 0]), что может говорить об активации репаративных процессов, индуцированных ответом организма на туберкулезную инфекцию;
• в препаратах оперированных животных, получавших противотуберкулезную терапию (группы 2 и 3), площадь костной ткани составила 26 и 24,5 %, толщина костных балок 114,5 и 121 мкм, количество остеобластов 6,6 (7,0 [5, 25; 7, 0]) и 6,1 п/зр. (6,0 [4, 25; 7, 0]) соответственно, пул остеоцитов при этом представлен преимущественно неактивными клетками (12 и 14 % активных клеток). Схожие данные могут быть объяснены преобладанием эффекта угнетения остеогенеза противотуберкулезной терапией над торможением резорбции костной ткани эффектом бисфосфонатов;
• в препаратах животных, которым однократно вводили бисфосфонаты в послеоперационном периоде (группы 3 и 4), определяется минимальное значение активных остеобластов — 1,2 (0,5 [0, 0; 1, 0]) и 1,3 п/зр. (0,5 [0, 0; 2, 0]) соответственно (p < 0,05), — что отражает более ранний переход к неактивным формам и может указывать на ускорение процессов остеорепарации;
• максимальная толщина костных балок (124,5 мкм), большее по сравнению с группами 2 и 3 общее количество остеобластов (p < 0,05) и остеоцитов — 7,0 (6,5 [6, 0; 7, 75]) и 11,4 п/зр. (10,5 [7, 25; 13, 8]) выявлены в группе 4 на фоне применения памидроновой кислоты при отсутствии противотуберкулезной терапии, что подтверждает ожидаемый кость-модифицирующий эффект бисфосфонатов.

 

Рис. 5. Площадь костной ткани и толщина костных балок (M)

Fig. 5. Bone area and thickness of the bone trabeculae (M)

 

Рис. 6. Доля активных клеточных элементов

Fig. 6. Proportion of active cellular elements

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Различное соотношение площади костной ткани, толщины костных балок и остеоформирующих клеточных элементов говорит о влиянии как специфического воспалительного процесса, так и медикаментозного воздействия на исходно интактную костную ткань. Снижение доли активных остеоцитов в группах, получавших противотуберкулезную терапию, по сравнению с группами ее не получавших, косвенно указывает на токсическое влияние соответствующих препаратов на процессы остеогенеза в условиях его естественной стимуляции воспалительным и индуцированным бисфосфонатами регенераторным процессом. Отдельно следует отметить отсутствие во всех группах остеокластов, что на первый взгляд, может быть объяснено особенностями клеточного состава костной ткани половозрелых кроликов, но требует дальнейшего осмысления и исследования.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку рукописи статьи. Окончательная версия прочитана и одобрена всеми авторами.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, связанных с публикацией данной статьи.

ADDITIONAL INFORMATION

Author contribution. Thereby, all authors made a substantial contribution to the conception of the study, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the article, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the study.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

^*Патент РФ № 2421823 C1/ 20.06.2011. Бюл. № 17. Васильева С.Н., Кафтырев А.С., Виноградова Т.И., и др. Способ моделирования туберкулезного остита различной степени тяжести. Режим доступа: https://patents.s3.yandex.net/RU2421823C1_20110620.pdf

About the authors

Veronika V. Petukhova

St. Petersburg Research Institute of Phthisiopulmonology

Email: nika_add@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2358-5529

Postgraduate Student

Russian Federation, Saint Petersburg

Alexander Yu. Mushkin

St. Petersburg Research Institute of Phthisiopulmonology; Academician Pavlov First St. Petersburg State Medical University

Email: aymushkin@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1342-3278

MD, PhD, Dr Med Sci, Professor, Chief Researcher; Professor of the Department of Traumatology and Orthopedics

Russian Federation, Saint Petersburg; Saint Petersburg

Mikhail M. Kostik

St. Petersburg State Pediatric Medical University

Email: kostmikhail@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-1180-8086

MD, PhD, Dr Med Sci, Professor of the Department of Hospital Pediatrics

Russian Federation, Saint Petersburg

Tatiana I. Vinogradova

St. Petersburg Research Institute of Phthisiopulmonology

Author for correspondence.
Email: vinogradova@spbniif.ru
ORCID iD: 0000-0002-5234-349X

MD, PhD, Dr Med Sci, Professor, Chief Researcher, coordinator of the direction “Experimental tuberculosis and innovative technologies”

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files