The role of clinical metabolomics in the diagnosis of bladder cancer

Full Text

АКТУАЛЬНОСТЬ

Вопросам поиска достоверных и малоинвазивных методов ранней диагностики и прогнозирования течения болезней всегда уделялось много внимания со стороны научного сообщества и врачей-клиницистов. На протяжении многих десятилетий ученые пытаются найти аподиктический биомаркер, обеспечивающий раннее выявление неопластических очагов и, тем самым, способствующий снижению числа пациентов с запущенными и тяжелыми формами рака. Чаще остальных можно наблюдать исследования с описанной прогностической значимостью общедоступных показателей клинического и биохимического анализов крови при разных патологических процессах [1–5]. Однако преобладающим считается мнение, что ни один из них не может быть использован как монокритерий для скрининга онкологического процесса.

В последние годы отмечается повышение числа исследований прогностической значимости белков и различных биохимических процессов при различных патологических состояниях [6, 7]. Преимущественно это связано с новым вектором развития биотехнологий, генетики и биохимии и, в частности, с таким направлением науки, как метаболомика [8–10]. Перспективным представляется использование результатов метаболомических исследований для диагностики онкоурологических заболеваний, в частности рака мочевого пузыря (РМП), что обусловлено его широкой распространенностью и высокой онкоспецифической смертностью. Ряд исследователей полагают, что из всех видов онкопатологии РМП имеет самые высокие затраты на лечение в течение жизни на одного пациента, что обусловлено в том числе необходимостью постоянного мониторинга возникновения его рецидивов [11–14].

Подтверждением актуальности поиска современных методов диагностики РМП служат статистические данные, свидетельствующие не только об отсутствии снижения заболеваемости и смертности от этого вида опухоли за последнее десятилетие, но даже о некотором их приросте. Так, в 2012 г. в США выявили 73 000 новых случаев уротелиального рака, а в 2018 и 2019 гг. уже по 80 000. Смертность от РМП за последние 30 лет существенно не изменилась, что отражает ограниченную эффективность новых протоколов лечения [11, 15]. В последнее десятилетие в нашей стране так же отмечена тенденция к росту заболеваемости уротелиальным раком [6, 16]. По официальным статистическим данным этот показатель вырос с 46 до 69 случаев на 100 тыс. населения. Среднегодовой темп прироста в 2019 г. составил 2,68 % [14, 17]. В абсолютных числах в 2018 г. в Российской Федерации было зарегистрировано 13 479 новых случаев РМП у мужчин и 3947 — у женщин [14].

Большинство авторов отмечает, что в настоящее время невозможно выделить группы пациентов среди больных уротелиальной карциномой, имеющих наибольший риск рецидива болезни и смерти, разработанные биомаркеры труднодоступны, дорогостоящи, а их специфичность и чувствительность ограничивают целесообразность их популяризации [14, 18, 19]. Таким образом, можно говорить о необходимости и целесообразности проведения новых исследований по определению подходящих прогностических показателей для достоверной своевременной верификации РМП и его рецидивов.

Цель исследования состояла в изучении возможности использования содержания различных аминокислот и их метаболитов в сыворотке крови для диагностики рака мочевого пузыря.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Представленное исследование является проспективным, выполненным путем изучения концентраций 28 аминокислот и их метаболитов в сыворотке крови у двух групп пациентов. Общее количество пациентов, включенных в исследование, составило 38 человек. Все они дали добровольное письменное согласие на проведение исследования биоматериала, диагностику и лечение.

В первую группу были включены 18 (47,4 %) пациентов мужского пола европеоидной расы с впервые диагностированным уротелиальным неинвазивным РМП. Диагноз подтвержден на основании результатов инструментальных методов обследования с дальнейшим морфологическим исследованием после выполненной трансуретральной резекции опухоли мочевого пузыря. В 6 (33,3 %) случаях степень дифференцировки опухоли определена как G1, у 8 (44,5 %) — как G2, у 4 (22,2 %) пациентов — как G3. Средний возраст первой группы больных составил 71,5 года при медиане 72,5 года. Во вторую группу были включены 20 (52,6 %) человек европеоидной расы с отрицательным онкологическим анамнезом, средний возраст которых составил 63,3 года при медиане 59,5 года.

Для реализации поставленной цели исследование было разделено на несколько этапов. На первом проводили сбор анамнеза, стандартный онкологический скрининг и забор крови для выполнения лабораторного анализа. Далее выделены средние значения, а также их медианы, которые имели статистически значимые различия. На втором этапе изучали «отфильтрованные» потенциальные биомаркеры и определяли наличие/отсутствие критериев исключения, а также сравнивали средние стандартные отклонения между группами больных. По результатам второго этапа была выведена панель из тех аминокислот и метаболитов, которые потенциально изолированно могут служить прогностическими маркерами уротелиальных карцином.

Все исследования соответствовали протоколу пробоподготовки биологических образцов для определения метаболитов в водной вытяжке. Анализ крови для оценки концентрации аминокислот и их производных в ее сыворотке проводился на хромато-масс-спектрометре в режиме полного ионного тока при температуре ионного источника 200 °C, интерфейса 250 °C, сканирование проводилось в интервале m/z 45–500. Программное обеспечение для обработки хроматограмм позволяло сверять полученные пики с зарегистрированными ранее и тем самым проводить их точное качественное и количественное определение. Одновременно с этим выполнялись снимки масс-спектра, дающие представление о строении компонентов, в том числе и неидентифицированных ранее.

Для выявления статистически значимых различий в уровнях аминокислот и их метаболитов в сыворотке крови и мочи использовали стандартный пакет для статистического анализа на базе Microsoft Office 2013 (15.0).

РЕЗУЛЬТАТЫ

По результатам первого этапа исследования удалось выявить 9 метаболомов, которые потенциально могут являться предикторами уротелиального рака: фенилаланин, аспарагиновая кислота, треонин, глутамин, глутаминовая кислота, глицин, аланин, пролин, аспарагин (см. таблицу).

 

Таблица. Содержание аминокислот и их метаболитов в сыворотке крови у пациентов 1-й и 2-й групп

Table. The content of amino acids and their metabolites in blood serum in patients of the 1^st and 2^nd groups

Наименование лабораторного показателя	Единицы измерения	Референсные значения	Клиническая группа				p
			1-я (n = 18)		2-я (n = 20)
			М	Ме	М	Ме
Фенилаланин	мкг/мл	6,1–14,5	14,75	15,45	7,65	7,98	0,00100*
Тирозин	мкг/мл	4,0–16,5	8,94	9,70	11,63	12,86	0,184753
Таурин	нмоль/мл	39,0–161,0	73,40	81,50	41,93	29,84	0,06459
Аспарагиновая кислота	нмоль/мл	2,0–8,0	12,17	13,40	8,50	7,20	0,04208*
Треонин	нмоль/мл	100,0–166,0	92,28	62,70	53,17	46,20	0,04681*
Серин	нмоль/мл	80,0–120,0	73,87	68,60	53,95	49,40	0,05870
Глутамин	нмоль/мл	500,0–650,0	490,05	484,40	337,83	304,50	0,00429*
Глутаминовая кислота	нмоль/мл	34,0–70,0	54,08	60,80	36,86	37,79	0,02537*
Глицин	нмоль/мл	154,0–250,0	179,73	193,50	95,49	83,48	0,00083*
Аланин	нмоль/мл	300,0–470,0	243,77	232,90	190,52	183,30	0,03932*
Пролин	нмоль/мл	226,0–320,0	118,58	100,9	80,30	76,40	0,03462*
Гидроксипролин	нмоль/мл	5,0–25,0	12,44	9,83	11,92	11,00	0,44245
Валин	нмоль/мл	240,0–320,0	175,86	175,80	199,22	210,20	0,19686
Метионин	нмоль/мл	24,0–33,0	25,87	27,30	22,58	24,40	0,09360
Лейцин + изолейцин	нмоль/мл	185,0–263,0	116,10	104,71	105,98	104,20	0,33433
Бета-аланин	нмоль/мл	0–29,0	1,57	1,60	2,85	2,10	0,06735
Цитруллин	нмоль/мл	24,0–42,0	22,82	20,6	19,21	15,90	0,24245
Альфа-аминомасляная кислота	нмоль/мл	16,0–31,0	13,15	11,42	15,45	16,30	0,31363
Бета-аминоизомасляная кислота	нмоль/мл	0,5–6,7	2,61	2,00	9,45	6,30	0,06544
Тирозин	нмоль/мл	44,0–82,0	57,03	55,00	60,90	71,20	0,36895
Триптофан	нмоль/мл	45,0–65,0	39,30	39,33	39,85	36,50	0,47326
Орнитин	нмоль/мл	53,0–88,0	64,80	78,65	45,59	45,60	0,06402
Аргинин	нмоль/мл	55,0–103,0	41,07	19,85	23,16	22,65	0,09398
Гистидин	нмоль/мл	70,0–105,0	34,68	35,71	43,70	30,10	0,26212
Цистин	нмоль/мл	0–125,0	35,04	19,46	38,49	31,70	0,39392
Аспарагин	нмоль/мл	44,0–72,0	32,27	27,97	16,43	14,00	0,02684*
Лизин	нмоль/мл	150,0–210,0	97,77	91,60	121,49	113,57	0,13170

Примечание. М — среднее значение показателя; Ме — медианное значение показателя. *Различие значений показателей достоверно (p < 0,05).

 

Вторым этапом исследования было проведение сравнительного анализа диапазона отклонений по каждому из выделенных 9 потенциальных метаболомов. На рис. 1 представлены максимальные отклонения полученных значений аспарагиновой кислоты у пациентов обеих групп.

 

Рис. 1. Диапазон отклонений содержания в сыворотке крови аспарагиновой кислоты у пациентов 1-й и 2-й групп

Fig. 1. The range of deviations in the content of aspartic acid in the blood serum in patients of the 1^st and 2^nd groups

 

Из рис. 1 видно, что, несмотря на полученную статистическую разницу между двумя клиническими группами по содержанию аспарагиновой кислоты (p = 0,04208), как среди пациентов с уротелиальным раком (1-я группа), так и среди здоровых людей (2-я группа) встречаются единичные случаи, которые могут быть интерпретированы как ложноположительные или ложноотрицательные. Аналогичная картина была получена при анализе лабораторных значений треонина, глутамина, глутаминовой кислоты, аланина и пролина. Несмотря на то что представленные материалы говорят о слабом потенциале каждой из этих аминокислот или их производных как монобиомаркера РМП, интересным представляется следующее наблюдение. Выявлена значимая разница между средним арифметическим и медианным значением треонина у пациентов 1-й группы, которые составили 92,28 и 62,70 нмоль/мл соответственно. Это объясняется тем, что у пациентов с высоко- и умеренно дифференцированной уротелиальной карциномой лабораторные значения были однородны с полученными у пациентов 2-й группы. В то время как сывороточный уровень треонина повышался более чем в 2 раза в случаях низкодифференцированного РМП (рис. 2).

 

Рис. 2. Диапазон отклонений содержания в сыворотке крови аминокислоты треонин у больных 1-й группы в зависимости от степени дифференцировки опухоли и в контрольной группе

Fig. 2. The range of deviations in the content of the amino acid threonine in the blood serum in patients of the 1^st group, depending on the degree of tumor differentiation and in the control group

 

Диапазон отклонений содержания глицина в сыворотке крови показал отсутствие перекреста значений у представителей 1-й и 2-й групп (рис. 3). Минимальные значения уровня глицина у пациентов 1-й группы составили 128,37 нмоль/мл, при среднеарифметическом значении 179,73 нмоль/мл и медиане 193,5 нмоль/мл. У больных 2-й группы максимальным оказался показатель 123,9 нмоль/мл при среднеарифметическом значении 95,49 нмоль/мл и медиане 83,48 нмоль/мл.

 

Рис. 3. Диапазон отклонений содержания в сыворотке крови глицина у больных 1-й и 2-й групп

Fig. 3. The range of deviations in the content of glycine in the blood serum in patients of the 1^st and 2^nd groups

 

Аналогичные результаты были получены и при изучении показателей содержания фенилаланина и аспарагина. Таким образом, результаты нашего исследования позволили выделить 4 метаболома (глицин, фенилаланин, аспарагин и треонин) в качестве потенциальных сывороточных биомаркеров уротелиального рака. С целью дальнейшего определения возможности и условий применения указанных метаболомов нами продолжается научное исследование, которое позволит исключить иные возможные причины отклонений в лабораторных значениях, а также их взаимосвязь с генетическими аберрациями, возникающими при РМП.

ОБСУЖДЕНИЕ

Основные принципы клинической метаболомики строятся на теории, что биологические жидкости, и в первую очередь кровь и моча, отражают метаболические изменения, специфичные для развития раковой опухоли [15, 20]. Изучение аминокислот и их производных считается одним из наиболее актуальных направлений клинической метаболомики, так как аминокислоты являются основным субстратом белковых молекул и их наличие в микроокружении опухоли необходимо для пролиферации патологически развивающихся клеток [21, 22]. Проведенные ранее исследования показали, что уротелий представлен 3–7 слоями клеток, на каждом уровне которых проходят метаболические процессы [8]. Соответственно, развитие опухолевых клеток в любом из слоев уротелия будет приводить к изменению баланса белковых молекул и, как следствие, к изменению содержания метаболомов. Таким образом, аномальные значения концентрации аминокислот и их производных, а также иных метаболомов в сыворотке крови и моче позволяют связать этот факт с проявлением неопластического процесса. Подтверждением эффективности данного научного направления могут быть примеры из смежных клинических дисциплин, к которым относятся выделение 2-гидроксиглутарата, повышение уровня которого возникает при глиомах, множественной миеломе и раке толстой кишки. Известно, что повышенный уровень саркозина диагностируется у больных колоректальным раком [15]. Перспективным признано исследование концентрации сурвивина — одного из ингибиторов апоптоза. Представленные в литературе результаты обширных рандомизированных исследований показали значимую взаимосвязь уровня экспрессии данного белка в опухоли с частотой прогрессирования неопластического процесса и онкоспецифической выживаемостью [7].

Наряду с этим попытки выделить изолированный метаболом, который может быть использован для ранней диагностики уротелиального рака, до настоящего времени не увенчались успехом. Основные исследования в этом направлении связаны с выделением химического вещества из состава мочи без изучения концентрации веществ в сыворотке крови, что связано с предположением о патологическом изменении концентрации веществ в моче, находящейся в непосредственном контакте с опухолью [13, 14, 23–26]. Этот принцип использовали при изучении диагностической значимости белка ядерного матрикса 22 (Nuclear Matrix Protein 22, NMP22), когда была доказана разница его концентрации у онкологических больных в сравнении с контрольной группой [27]. В то же время отмечена низкая чувствительность и специфичность биомаркера составляющая 80,3 и 72,4 % соответственно при его количественном определении. Частые ложноположительные результаты связаны с верификацией NMP22 из апоптотических клеток у пациентов с гематурией, обусловленной неопухолевыми причинами, а также при наличии инфекции мочевыводящих путей. Недавнее исследование, проведенное в Пекинском госпитале, показало, что тест-система на основе NMP22 имеет более низкую чувствительность для выявления первичного и рецидивирующего уротелиального рака в сравнении с заявленными данными. Чувствительность и специфичность этого метода, по данным авторов, составили 37,9 и 95,8 % соответственно. В диагностике рецидива эти значения оказались еще ниже и составили 31,0 и 88,5 % соответственно [28].

Известное достижение клинической метаболомики — разработанный тест на антиген опухоли мочевого пузыря (bladder tumor antigen, BTA), основанный на выявлении белка, связанного с фактором комплемента H. Однако, аналогично предыдущему исследованию, при использовании этого теста часто встречаются ложноположительные результаты из-за присутствия в крови белка, родственного анализируемому фактору комплемента человека [23, 29]. В литературе можно встретить упоминание о иммуноцитохимическом методе, в котором используются флуоресцентно меченные антитела, направленные против трех антигенов: гликозилированной формы карциноэмбрионального антигена и двух муцинов, специфически обнаруживаемых на злокачественных эксфолиированных уротелиальных клетках. Заявленная производителями чувствительность и специфичность этого метода — по 78 %. Как и при всех предшествовавших попытках авторам не удалось исключить появление ложноположительных реакций у пациентов с признаками инфекции и рядом других болезней. Таким образом, тест был рекомендован исключительно для динамического наблюдения за больными с ранее верифицированной опухолью мочевого пузыря [23]. FISH-тест (fluorescence in situ hybridization test) — один из самых известных в нашей стране методов скрининга рака мочевого пузыря, при котором исследуются флуоресцентно меченные ДНК-зонды для поиска клеток с генетическими изменениями. Авторами заявлена 100 % чувствительность метода и его специфичность 87 % [30]. Альтернативный метаанализ показал, что чувствительность и специфичность FISH-теста при выявлении РМП составляют 63 и 87 % соответственно. Исследование, проведенное коллективом авторов ФГУ «РНЦ радиологии и хирургических технологий им. акад. А.М. Гранова» Минздрава России, показало чувствительность FISH-метода 84,6 % при количественном определении. При этом авторы особо подчеркнули важность соблюдения протокола исследования, поскольку при нарушении последовательности его выполнения значимо снижается достоверность метода [31]. Еще в одной научной работе представлены данные о чувствительности и специфичности этой методики равные 39,1 и 89,7 % соответственно. Подобные результаты, а также отсутствие чувствительности к низкодифференцированным видам опухоли существенно ограничивают возможности использования FISH-теста [32]. Опубликованы результаты нескольких крупных исследований по выделению потенциального метаболома из мочи, позволяющего заподозрить наличие новообразования уротелия. К ним относится метод, основанный на исследовании фактора транскрипции клеток мочи на уротелиальную карциному мочевого пузыря 1 (Bladder Cancer-Specific Antigen-1, BLCA-1) и уротелиальную карциному мочевого пузыря 4 (Bladder Cancer-Specific Antigen-4, BLCA-4). В 2017 г. было показано даже некоторое преимущество использования белков ядерного матрикса в моче в качестве биомаркера в сравнении с рядом других тест-систем, в том числе использующих NMP22 [33]. Еще в одном аналитическом обзоре были описаны метаболиты 13 аминокислот в качестве возможных предикторов РМП. Самыми значимыми, по мнению авторов обзора, для скрининга РМП стали концентрации лейцина, валина, фенилаланина, глутамата, гистидина, аспарагиновой кислоты, тирозина и серина [21]. Наши данные показали потенциал в дальнейшем изучении и применении только фенилаланина, аспарагина и глицина. В другом многоцентровом исследовании предложено проводить анализ концентрации ангиогенина, полипептида, участвующего в ангиогенезе, [13] и липидов, что, возможно, может отражать более высокую скорость пролиферации опухолевых клеток и усиленное ремоделирование липидной мембраны. Интересным новым направлением в диагностике и патогенезе рака являются исследования внутриклеточных везикул и их влияние на различные иммунные клетки, в том числе и на противоопухолевые эффекторные Т-клетки [34]. Коллектив авторов по руководством J. Lin [35] изучал 922 различных метаболита в моче у пациентов с уротелиальными опухолями. По его результатам были определены восемь показателей, которые имели связь между частотой выявления РМП на ранней стадии и метаболизмом сахаров и полиолов. В то же время авторы признают, что полученные данные требуют дальнейшего изучения [35].

Таким образом, можно констатировать, что исследования и поиск достоверного предиктора — метаболома — при РМП продолжается, и в большинстве случаев проводятся попытки выделения химического компонента в моче. Предложенным биомаркерам не хватает чувствительности или специфичности, особенно для уротелиального рака низкой степени злокачественности и на ранних стадиях, и они часто дают ложноположительные результаты. Полученные в настоящей работе данные были направлены на изучение изменения концентрации сывороточных общедоступных для лабораторной диагностики аминокислот и их производных у больных РМП. Несмотря на то что полученные результаты требуют дальнейшего изучения, они представляют явный интерес и перспективный потенциал этого направления.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Клиническая метаболомика — перспективное направление для выявления новых достоверных лабораторных показателей РМП. Выделенные по результатам настоящего исследования аминокислоты (глицин, фенилаланин, аспарагин) в сыворотке крови служат потенциальными изолированными биомаркерами для ранней диагностики РМП и его рецидивов. Повышение клинического значения уровня треонина более чем в два раза от референтных значений говорит о высокой вероятности крупных и низкодифференцированных уротелиальных карцином.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Этическое утверждение. Участники исследования были проинформированы о целях и методологии исследования и добровольно предоставили письменное согласие на свое участие.

ADDITIONAL INFORMATION

Author contribution. Thereby, all authors made a substantial contribution to the conception of the study, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the article, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the study.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Ethics approval. The study participants were informed about the objectives and methodology of the study and voluntarily provided written consent for their participation.

About the authors

Sergey A. Zamyatnin

Priozersky Interdistrict Hospital

Email: elysium2000@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8453-2148
SPIN-code: 7024-0062

Dr. Sci. (Med.), Urologist, Chief Physician

Russian Federation, 35, Kalinina st., Priozersk, Leningrad Region, 188760

Anton V. Malushko

Priozersky Interdistrict Hospital

Email: a-malushko@mail.ru
SPIN-code: 5703-0630

Oncologist, Deputy Chief Physician

Russian Federation, 35, Kalinina st., Priozersk, Leningrad Region, 188760

Irina S. Gonchar

Priozersky Interdistrict Hospital

Author for correspondence.
Email: bonechka@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1702-9849
SPIN-code: 2768-7253

Cand. Sci. (Med.), Urologist

Russian Federation, 35, Kalinina st., Priozersk, Leningrad Region, 188760

References

Supplementary files