Features of the microenvironment of oncourological tumors

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

В последнее десятилетие отмечается рост числа людей, страдающих онкологическими заболеваниями. Несмотря на то что по многим патологиям благодаря внедрению новых подходов достигнуты существенные успехи, на поздних стадиях увеличивается доля пациентов с опухолями, резистентными ко многим вариантам лечения [1, 2]. Стратегическая задача, которая стоит перед онкологами — превратить рак в длительно текущее хроническое заболевание, которое хорошо контролируется низкотоксичными методами. В реализации этой задачи прослеживается три направления исследований: 1) поиск ключевых мишеней для создания таргетных препаратов; 2) индивидуализация лечебных программ, основанная на молекулярно-биологических характеристиках опухоли и прогнозе заболевания; 3) разработка новых вариантов лечения, обеспечивающих повышение эффективности за счет увеличения концентрации действующих веществ в очаге и снижения токсичности. Канцерогенез — многоступенчатый многокомпонентый процесс, затрагивающий изменения апоптоза, пролиферации, энергетики клетки, что приводит к формированию патологического микроокружения [3, 4]. Мультимодальность канцерогенеза обусловливает необходимость применения комбинированных методов лечения, направленных на разные мишени. Ограничения подобного подхода связаны с большой частотой побочных эффектов, высокой стоимостью, а также достаточно коротким периодом времени, в течение которого указанная комбинация остается эффективной. Последнее обстоятельство связано с динамикой микроокружения опухоли, подробно описанной G.P. Dunn в 2004 г. [5]. Согласно предложенной им модели, существует три этапа взаимодействия опухолевых клеток и иммунной системы: элиминация, равновесие и ускользание. Каждый из них характеризуется определенным соотношением компонентов микроокружения и, в определенной степени, коррелирует с прогнозом заболевания. Опухолевое микроокружение состоит из экстрацеллюлярного матрикса и его продуцентов (фибробласты, мезенхимальные стромальные клетки, перициты, адипоциты, эндотелиоциты), эффекторных и супрессорных компонентов иммунной системы. Даже малое количество опухолевых клеток, особенно если они представлены стволовыми или покоящимися, формирует микроокружение, резистентное к лучевой и лекарственной терапии [6–8].

Онкоурологические опухоли (рак почки, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы) существенно различаются по составу, структуре и влиянию различных компонентов микроокружения и представляют собой хорошую модель для оценки его прогностической значимости. Большинство гистологических образцов почечно-клеточного рака относится к так называемым горячим опухолям, которые чувствительны к ингибиторам контрольных точек иммунного ответа и цитокинам [9, 10]. В процессе канцерогенеза рака предстательной железы подавляются эффекторные механизмы иммунного ответа и активируется иммуносупрессорное звено. Основной вклад в формирование микроокружения вносят Т-регуляторные клетки (Treg) и супрессорные клетки миелоидного происхождения (MDSC). Эти опухоли практически не чувствительны к иммуноонкологическим препаратам [11, 12]. В образцах рака мочевого пузыря, как поверхностных, так и инвазивных форм, часто встречаются B-лимфоциты, Тh1,2 (Т-хелперы 1-го и 2-го типа), макрофаги и нейтрофилы обоих поляризаций (M1, M2; N1, N2), а также MDSC. Эти опухоли чаще относятся к «иммуносупрессивному» типу, что создает условия для реверсии их в «горячие» путем терапевтических манипуляций [9, 13, 14].

Формирование микроокружения происходит под влиянием стволовых опухолевых клеток. Его тип определяется активностью, составом иммуносупрессорных и эффекторных компонентов, их соотношением, а также гуморальной микросредой, создаваемой цитокинами, хемокинами и факторами роста.

Стволовые опухолевые клетки

С каждым днем появляется все больше свидетельств того, что наличие CSC (cancer stem cells, стволовые опухолевые клетки) обусловливает высокий риск метастазирования и резистентность к лекарственной терапии. CSC — один из перспективных биомаркеров прогноза при различных опухолях, а дефектные сигнальные пути являются мишенями для таргетных препаратов. CSC представляют собой небольшую субпопуляцию клеток с поверхностным фенотипом CD44⁺CD24^–, высоким уровнем экспрессии альдегиддегидрогеназы (ALDH), повышенным пролиферативным потенциалом, инвазивностью и EMT (epithelial-mesenchymal transition, эпителиально-мезенхимальный переход). До сих пор не ясно, образуются ли они из опухолевых или в результате мутации резидентных стволовых клеток. В клинических исследованиях продемонстрировано, что экспрессия CD44⁺CD24^–/low коррелирует с низкой эффективностью химиотерапии, высокой частотой отдаленного метастазирования, поражения лимфатических узлов, появлением рецидивов, в то время как ALDH является независимым прогностическим фактором в отношении отдаленных результатов лечения [15].

Самообновление CSC и как следствие другие свойства, обеспечивающие инвазивность, резистентность к терапии и высокий метастатический потенциал, обусловлены гиперактивацией ряда сигнальных путей: Notch, Wnt/β — катенин, HH, STAT3, TGF-β, JAK/STAT.

Notch — сигнальный каскад, включающий семейство трансмембранных лигандов и рецепторов. Их функционирование критично для пролиферации, дифференцировки клеток и поддержания гомеостаза. Дефекты этого сигнального пути выявляются у больных раком легкого, предстательной железы, колоректальным раком, раком молочной железы и гемобластозами. У человека описано 4 типа Notch-рецепторов (Notch 1–4), экспрессированых на поверхности мембраны, и 5 лигандов — Delta-like (DLL)-1,3,4; Jaged (JAG)-1,2. При их взаимодействии за счет металлопротеиназ (ADAM 17, ADAM 10) происходит отщепление внутриклеточного Notch-домена (NICD), инактивирующего супрессор CBF-1 (в норме он инактивирован комплексом SMART), что приводит к дерепрессированию экспрессии генов-мишеней Hes1 и Hey1. Рецепторы и лиганды сигнального каскада Notch контролируют ключевые процессы, обеспечивающие злокачественный потенциал опухоли: Notch-1 участвует в регуляции пролиферации, формировании инвазивности и химиорезистентности; Notch-2 — в инициации опухолевой трансформации; Notch-3 — в регуляции пролиферации и миграции клеток, формировании химиорезистентности; Notch-4 стимулирует EMT и формирование резистентности к эндокринной терапии; DLL-1 регулирует процессы межклеточного взаимодействия; DLL-3 предотвращает апоптоз; DLL-4 активирует сигнальный путь NF-κB, обеспечивая экспрессию VEGF; JAG-1 способствует активации ангиогенеза; JAG-2 при взаимодействии с Notch-2 активирует пролиферацию опухолевых клеток. Ген-мишень Hes-1 запускает каскад реакций, участвующих в регуляции пролиферации и дифференцировки, а Hey-1 — неоангиогенеза [16].

Wnt/β-катенин — сигнальный путь, имеющий ключевое значение в опухолевой инициации, EMT, формировании пула CSC и метастазировании. В опухолевых клетках нарушено нормальное функционирование как канонического, так и неканонического Wnt/β-катенин пути. Канонический путь связан со стабилизацией β-катенина. У человека он включает 19 Wnt рецепторов, корецепторы [10 Frizzled (FZD)], белок, связанный с липопротеином низкой плотности (LRP 5/6), а также ряд лигандов (WNT5A, WNT11, WNT3A), регулирующих миграцию и инвазию. В отсутствие рецепторов β-катенин быстро разрушается мультипротеиновым «деструктирующим комплексом». Связывание Wnt c рецепторами и корецепторами приводит к деструкции этого комплекса, что стабилизирует β-катенин, способствует его транслокации в ядро и активации транскрипционного фактора TCF/LEF. В дополнение к каноническому описано два неканонических β-катенин независимых сигнальных пути, играющих существенную роль в процессе гаструляции. Один из них обеспечивает полярность клеток (PCP, planar cell polarity), а другой (Wnt/Ca²⁺) — внутриклеточный транспорт Ca²⁺, а также участвует в миграции клеток, адгезии и сепарации тканей в процессе эмбриогенеза [17].

HH (Hedehog) — сигнальный путь, контролирующий самообновление популяции CSC. Семейство HH включает три секреторных лиганда: SHH (Sonic), экспрессируемый в эмбриональных клетках; IHH (Indian), выявляемый преимущественно в гемопоэтических стволовых клетках; DHH (Desert) — в клетках периферической нервной системы и яичках. HH, помимо лиганда, включает трансмембранный рецептор (PTCH), корецептор (SMO), а также три транскрипционных фактора (GL1-3), регулирующих экспрессию генов-мишеней, вовлеченных в формирование химиорезистентности и регуляцию ангиогенеза. В отсутствие лиганда SMO активирует фосфорилирование GL1 протеин-киназой А (PKA), киназой гликоген-синтазы 3 (GSK3), киназой казеина 1 (CK1), в результате чего образуется репрессор (GLIR), подавляющий экспрессию генов-мишеней. При взаимодействии лиганда с PTCH происходит фосфорилирование корецептора PKA и CK1, в результате чего образуется активатор (GLIA), запускающий экспрессию генов-мишеней. Гиперэкспрессия компонентов HH (SHH, GLI1/2, SMO) связана с инвазией, EMT, ангиогенезом и химиорезистентностью. Клинические данные демонстрируют также их связь с плохим прогнозом. Компоненты этого сигнального пути, особенно SMO и GLI — мишени для препаратов, находящихся на разных этапах доклинических и клинических исследований [18].

TGF-β — член суперсемейства цитокинов, включающего более 30 функционально связанных факторов роста, в том числе 3 изоформы TGF-β (TGF-β1-3), принимающих участие в регуляции процессов пролиферации, адгезии, апоптоза и дифференцировки. Он ингибирует секрецию и регуляцию функций IFN-γ, TNF-α, IL-2. Роль TGF-β при канцерогенезе заключается в стимуляции EMT, пролиферации, ангиогенеза, а также в формировании иммуносупрессии. TGF-β секретируется клетками микроокружения, поддерживая CSC и запуская патологические процессы в злокачественных клетках, которые, в свою очередь, способствуют альтернативной поляризации незрелых предшественников лимфоидных и миелоидных элементов [19].

Сигнальный путь JAK/STAT играет важную роль во многих биологических процессах, связанных с канцерогенезом. Он включает киназы, активаторы транскрипции и различные лиганды. JAK — семейство безрецепторных тирозин-киназ, состоящее из четырех компонентов: JAK1, JAK2, JAK3 и TYK2. JAK1, JAK2 и TYK2 экспрессируются во многих типах клеток; JAK3 — в гематопоэтических стволовых клетках. STAT (signal transducer and activator of the transcription) — семейство активаторов транскрипции: STAT1–4, 5α, 5β, 6. В канцерогенезе наиболее изучена роль компонента STAT3. Он состоит из N-концевого домена, спирального участка, ДНК-связывающего домена, SH2 и трансактивационного доменов. Спиральный участок обеспечивает взаимодействие с другими транскрипционными факторами. Фосфорилирование тирозина в его составе, происходящее при контакте с лигандами, необходимо для димеризации, транслокации в ядро и связывания ДНК. JAK-киназы активируются при лиганд-рецепторном взаимодействии различных цитокинов (IL-6, IL-11, IL-27, IL-31), хемокинов (IL-8, CXCR12, CXCR7), факторов роста (TGF-β, EGF, IGF, PDGF-C), пептидных гормонов (гастрин). Под действием цитокинов и факторов роста (IL-6, IL-8, TGF-β, IGF, EGF) происходит активация комплекса JAK/STAT3, который стимулирует экспрессию ряда генов, обеспечивающих EMT [20].

Компоненты микроокружения опухоли с противоопухолевыми и проопухолевыми эффектами

Клеточные элементы в микроокружении могут способствовать иммунологической деструкции или пролиферации злокачественных клеток. Под действием факторов опухоли и микроокружения изменяются функциональные свойства ряда иммунокомпетентных клеток, наиболее изученными из которых на данный момент являются макрофаги (МФ), супрессорные клетки миелоидного происхождения (MDSCs), нейтрофилы (НФ), дендритные клетки (DC) и врожденные лимфоидные клетки (ILC) (табл. 1).

 

Таблица 1. Противоопухолевые и проопухолевые миелоидные и лимфоидные элементы с альтернативной поляризацией в микроокружении опухоли

Table 1. Antitumor and protumor myeloid and lymphoid elements with alternative polarization in the tumor microenvironment

Клетка		Функция	Активаторы в микроокружении	Секретируемые цитокины и хемокины	Маркеры	Рост опухоли
МФ [28]	М1	Th1-ответ, фагоцитоз	IFN-γ	IL-1, IL-6, IL-12, IL-23, CCL2–5, CCL 8–11	CD64, CD68, CD80, CD86, IDO, CXCL10	–
	М2a	Th2-ответ, аллергия, заживление ран	IL-4, IL-10, IL-13, CCL2, CCL3, CCL14	IL-4, IL-10, TGF-β, CCL17, CCL22, CCL24, PGE2	CD23, CD163, CCL-2	+
	М2b	Th2-ответ	TLR агонисты	IL-1, IL-6, IL-10, TNF-α, CCL1	CD86	+
	М2c	Репарация тканей, ремоделирование матрикса	IL-10, TNF-α, ГКС	IL-10, TGF-β	CD163	+
	М2d	Ангиогенез	TLR, аденозин	IL-10, TGF-β, IL-12, VEGF-A	VEGF	+
DC [30]	iDC	Распознавание антигенов, фагоцитоз, генерация Th2, Tрег	–	–	CD11c, HLA-DR	±
	cDC1	АПК для CD8+, кросс-презентация, секреция IL-12	–	IL-12, TNF-α, IFN-γ	CD11c, HLA-DR, CD13 CD26, CD33, CD40, CD80, CD86, CD103, CD226, BTLA, CXCR3, CXCR4	±
	cDC2	АПК для CD4+	–	IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-23, TNF-α, TGF-β	CD11c, HLA-DR, CD1c, CD11b, CD2, CD33, CD40, CD80, CD86, CD62L, DCIR	±
	pDC	Понижена секреция IFN-γ	–	IFN-α, TNF-α, IL-6	CD11c, HLA-DR, CD303, CD123, CD304, CD62L, BTLA, CD45 RA	±
	mDC	Продукция IL-6, IL-12, TNF-α	–	IL-1, IL-12, IL-23, TNF-α	CD11c, CD14, Factor XIIIA, HLA-DR, CD62L, CXCR3, CD209, CD1c, CD80, CD86, CD64, MAR-1	–
	TDC	Генерация Th2, Tрег, индукция толерантности	IL-10, TNF-α, TGF-β, VEGF-A, PGE2	TGF-β	C1QA, C3AR1, CD163, CD300LF, CFH, ZBT16	+
НФ [33]	N1	Фагоцитоз, продукция провоспалительных цитокинов, индукция апоптоза опухолевыми клетками	–	TNF-α, IFN-α, IFN-γ, MMP-8	TNF-α, FAS, ROS, ICAM-1	–
	N2	Стимуляция ангиoгенеза, клеточной миграции и инвазии	TGF-β, ангиотензин-2	Онкостатини-М, MMP-9, CXCL1, CXCL6, CXCL8, CCL3, эластаза, гепариназа, коллагеназа IV, TGF-β, PGE2	Аргиназа, CCL2, CCL5	+
NK [32]	CD56bright CD16-	Продукция провоспалительных цитокинов	TGF-β, PGE2, IL-10, IDO	TNF-α, IFN-γ	NKp46, NK1.1, CD122	±
	CD56dim CD16+	Антитело-зависимая клеточная цитотоксичность	TGF-β, PGE2, IL-10, IDO	IL-10, IL-22	–	±
MDSC [29]	mMDSC	Супрессия врожденного и приобретенного иммунитета	CSF-1, CCL2, CCL7, CXCL1	NO, CCL3–5, IL-4, Arg1, PGE2	CD11b+, CD14+, HLADR-	+
	gMDSC			IL-4, Arg1, PGE2	CD11b+, CD14–, CD15+, HLADR-	+
ILC [39]	ILC1	Активация макрофагов, хроническое воспаление	–	TNF-α, IFN-γ	NKp46, CD56, NKp44, DNAM1, ICOS	–
	ILC2	Стимуляция Т-клеточного ответа	IL-25, IL-33	IL-5, IL-13	CD117, CD127, ICOS, CD294, IL1R, CD161, PD-1, NKp30	±
	ILC3	Хроническое воспаление, формирование лимфоидных органов	IL-1, IL-23	IL-17, IL-22, GM–CSF	CD117, CD127, CD25, ICOS, IL1R, IL23R, CCR6, NKp30, NKp44, NKp46, CD161	+
Примечание. МФ — макрофаги; НФ — нейтрофилы; DC — дендритные клетки; NK — натуральные киллеры; MDSC — супрессорные клетки миелоидного происхождения; ILC — врожденные лимфоидные клетки; TNF-α — фактор некроза опухоли альфа; TGF-β — трансформирующий фактор роста бета; VEGF — сосудистый эндотелиальный фактор роста; IDO — индоламин-2,3-диоксигеназа; Arg1 — аргиназа 1-го типа; PGE2 — простагландин Е2; CХСL — хемокины; АПК — антиген-презентирующие клетки; TLR — толл-подобные рецепторы; Th — Т-хелперы.

 

В микроокружении опухоли и периферической крови существует две субпопуляции МФ — М1 и М2. М1 — классически активируемые МФ, поляризация которых из предшественников происходит под действием липополисахарида, IFN-γ и TNF-α. М2 — сборное название группы клеток макрофагального ряда (M2a, M2b, M2c, M2d), индуцирующихся под влиянием IL-4, IL-13, IL-10, TGF-β, Fc-рецепторов, комплемента и глюкокортикоидов. М2 образуются из моноцитов периферической крови, рекрутированных в очаг хемокиновыми лигандами (CCL-2, MCP-1), колониестимулирующими факторами (M-CSF, CSF-1) и сосудистым эндотелиальным фактором роста (VEGF), концентрация которых повышена в зонах с низким давлением кислорода. В зонах хронический гипоксии в макрофагах синтезируются гипоксия-индуцированные факторы (HIF-1 и HIF-2). Они дерепрессируют синтез ряда белков, повышающих инвазивный потенциал, стимулирующих ангиогенез (VEGF, bFGF, PDGF), метастазирование и ЕМТ (MMP, CCL2, CCL18). Кроме того, в них отмечается избыточная экспрессия аргиназы (Arg) и индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO), снижающих концентрацию аргинина и триптофана, необходимых для нормального функционирования Т-лимфоцитов и NK (натуральных киллеров) [28].

MDSC (супрессорные клетки миелоидного происхождения) представляют собой гетерогенную группу клеток, образующихся из кроветворного предшественника — незрелых миелоидных клеток (iMC, CD31⁺CD11b⁺CD15⁺). В норме их созревание происходит в костном мозге и селезенке. В микроокружении под действием гуморальных факторов (VEGF, IL-3, IL-4, IL-6) и лигандов хемокинов (CXCL 2, 5, 12; CCL 2, 5) блокируется их дальнейшая дифференцировка, в результате чего они накапливаются в первичных и метастатических очагах. У человека выявляется две субпопуляции MDSC: гранулоцитарные MDSC (gMDSC, CD11b⁺CD14^–CD15⁺CD33⁺) и моноцитарные MDSC (mMDSC, CD11b⁺CD14⁺CD15^–CD33⁺HLADR^–/low). MDSC — ключевые компоненты в индукции иммуносупрессии на фоне хронического воспаления. За счет активных метаболитов кислорода и азота они индуцируют анергию эффекторных клеток, способствуя рекрутингу Treg (Т-регуляторных клеток) в опухоль и поляризации предшественников МФ в сторону М2. Кроме того, MDSC стимулируют ангиогенез и способствуют поддержанию популяции CSC [29].

DC (дендритные клетки) — это высокоспециализированная субпопуляция, основной функцией которой является поглощение, процессинг и презентация антигенов в составе главного комплекса гистосовместимости I и II типа (MHC I и II) в комбинации с костимулирующими молекулами Th (Т-хелперы, CD4⁺) непосредственно, и опосредованно — CTL (цитотоксические лимфоциты). В настоящее время в литературе описано как минимум шесть субпопуляций DC с разным биологическим потенциалом. Их активация происходит под действием «сигналов опасности», исходящих от опухолевых клеток, включающих хемокины и неоантигены. «Созревание» DC, помимо презентации антигенов, сопровождается экспрессией костимулирующих молекул (CD40, ICAM I, CD80/86, СD83), секрецией широкого спектра цитокинов (IFN-γ, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13) и миграцией в лимфатические узлы, где происходит запуск программы активации Тh. У человека морфологически и функционально различают две субпопуляции DC: миелоидные (mDC) и плазмацитоидные (pDC). mDC — классические DC, имеющие фенотип CD11c⁺CD4⁺CD45RO⁺, экспрессирующие MHC I, II и запускающие иммунный ответ при контакте с растворимыми антигенами. pDC с фенотипом CD11c^–CD4⁺CD45RA⁺CD123⁺ и экспрессией MHC I поглощают клеточно-ассоциированные антигены [30].

Трег-субпопуляция, составляющая примерно 5–10 % общего числа периферических лимфоцитов здорового человека и примерно 50 % популяции лимфоцитов с маркерами CD4⁺CD25⁺, впервые описана S. Sakaguchi с соавторами в 1995 г. [31]. В настоящее время им отводят ключевую роль в предотвращении развития аутоиммунных реакций в физиологических процессах и иммуносупрессии в канцерогенезе. Среди CD4⁺CD25⁺FoxP3 выделяются две субпопуляции. Одна из них имеет фенотип CD4⁺CD25^hiCTLA^hiFoxP3 и образуется в тимусе из недифференцированных лимфоцитов, другая, с фенотипом CD4⁺CD25^variable CTLA^hi FoxP3, возникает из периферических Th под действием избыточной концентрации глюкокортикоидов, эстрогенов, IL-2 и TGF-β. Однако по функциям они идентичны. Механизм действия их связан с контактным ингибированием, секрецией супрессорных цитокинов (IL-10, IL-35, TGF-β), а также прямым лизисом иммунокомпетентных клеток [32].

Ключевая роль в деструкции опухоли принадлежит макрофагам (M1), натуральным киллерам (NK), цитотоксическим лимфоцитам (CTL, CD8⁺).

NK (натуральные киллеры) образуются из общего лимфоидного предшественника в костном мозге, откуда в дальнейшем распространяются в первичные и вторичные лимфоидные органы, а также в легкие и печень. У человека выявляются две субпопуляции NK: CD56^brightCD16^– (цитокин-продуцирующая) и CD56^dimCD16⁺ (цитотоксическая). Кроме того, выделяют несколько групп NK в зависимости от степени зрелости, определяемой экспрессией маркеров CD27 и CD11b. Незрелые NK их не экспрессируют. В процессе созревания сначала появляется CD27, затем CD11b. NK с фенотипом CD27⁺ обладают наилучшей способностью к секреции цитокинов, с фенотипом CD11b⁺CD27^– максимальной цитолитической активностью. NK могут элиминировать клетки, не экспрессирующие MHC I, а этот механизм используют зрелые опухоли клетки и CSC для предотвращения атаки со стороны цитотоксических лимфоцитов. Потенциально NK являются наиболее эффективными звеном в борьбе с опухолью, но под действием факторов микроокружения (TGF-β, аденозин) они приобретают фенотип CD56^brightCD16^– и начинают экспрессировать проангиогенные регуляторы: матриксные металлопротеиназы (MMP9) и сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF-А), что повышает инвазивный потенциал злокачественных клеток и приводит к истощению Т-лимфоцитов. Под влиянием CSC на мембране NK снижается экспрессия активирующих (NKp30, NKG2D, DNAM1) и повышается экспрессия ингибирующих (NKG2A, CD85j) рецепторов [33].

Прогностическая значимость субпопуляций Т-лимфоцитов [Th1,2 (CD4⁺); CTL (CD8⁺)] у больных с разными нозологическими формами отражена во многих публикациях. Авторы отмечают выраженность молекулярных дефектов этих клеток, приводящих к снижению цитолитической функции и ухудшению распознавания чужеродных антигенов. Преобладание в периферической крови зрелых форм по сравнению с недифференцированными и клетками памяти у больных с отдаленными метастазами является благоприятным фактором прогноза в отношении общей выживаемости.

In vitro и на экспериментальных моделях описано контактное и дистантное взаимодействие Th1 c CTL и Th2 с В-лимфоцитами, что необходимо для реализации эффекторных функций. Однако в канцерогенезе описано также прямое противоопухолевое действие Th. На ранних этапах, в фазе элиминации, а также после лучевой или химиотерапии часть злокачественных клеток, не подвергаясь апоптозу, формирует пул покоящихся клеток (senescent cells). Они не делятся, но приобретают секреторный фенотип (SASP, senescence-associated secretory phenotype), характеризующийся повышенной экспрессией цитокинов и низкомолекулярных регуляторов, способствующих аттракции иммунокомпетентных клеток. На этом этапе эрадикация опухолевых элементов происходит с участием Th и МФ. При этом участия CTL в этом процессе не требуется. Недифференцированные CD4⁺-лимфоциты под влиянием IL-12 поляризуются в Th1, IL-4 — в Th2, а при высоких концентрациях TGF-β и IL-6, а также под действием циклофосфамида — в Th17. Ключевую роль в противоопухолевой защите играют Th1. Они способствуют созреванию и активации DC, а за счет секреции IL-4 — рекрутированию эозинофилов, макрофагов и формированию длительной иммунологической памяти. В эксперименте продемонстрировано, что Th2 способствуют элиминации опухолевых клеток с помощью механизмов, не связанных с CTL, NK, B-лимфоцитами и IFN-γ, но в кооперации с М2-макрофагами они индуцируют хроническое воспаление, провоцируя тем самым опухолевую прогрессию [34].

Данные о роли Th17 в противоопухолевом иммунитете противоречивы. О них известно значительно меньше, чем о других CD4⁺-лимфоцитах. В большом количестве их выявляют в периферической крови больных раком предстательной железы и при синдроме Сезари. Две основных характеристики Th17 — способность продуцировать значительные количества IL-17 и экспрессировать связанный с ретиноевой кислотой орфанный рецептор гамма t (ROR_γt, retinoic acid-related orphan receptor gamma t), хотя в эксперименте показано, что некоторые субпопуляции Treg также обладают такими свойствами. Семейство IL-17 включает в себя 6 структурно сходных молекул (IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E, IL-17F). В индукции иммунологической толерантности у онкологических больных основная роль принадлежит IL-17A. Основным регулятором синтеза IL-17 является IL-23, ингибитором — IL-12. Воздействуя на клетки микроокружения опухоли, IL-17 стимулирует продукцию цитокинов (IL-6, G-CSF), хемокинов (IL-8) и низкомолекулярных регуляторов (PGE₂), вовлеченных в канцерогенез. В МФ он усиливает продукцию TNF-α, IL-1β, PGE₂, G-CSF, IL-6, IL-10, IL-12. Таким образом, суммарное влияние IL-17 на цитокиновую сеть выражается в увеличении продукции компонентов, способствующих опухолевой прогрессии. Кроме того, в эксперименте показана его способность стимулировать ангиогенез за счет экспрессии VEGF. Было высказано предположение о возможности конверсии Th17 в Treg в микроокружении опухоли. В ряде работ продемонстрировано, что Th17 в кооперации с Th1 ингибируют ангиогенез и блокируют пролиферацию злокачественных клеток. В то же время, у пациентов с опухолями головы и шеи, раком молочной железы и гепатоцеллюлярным раком выявление этих клеток в микроокружении и периферической крови является неблагоприятным прогностическим фактором [35, 36].

Дважды негативные Т-лимфоциты (DN, double-negative, CD3⁺CD4^–CD8^–) — небольшая субпопуляция, составляющая 3–5 % общего числа этих клеток в периферической крови. Они характеризуются отсутствием корецепторов CD4 и CD8, маркеров NK и экспрессией одного из вариантов TCR (Т-клеточного рецептора): альфа/бета (αβ) в 95 % и гамма/дельта (γδ) в 5 % случаев. В норме эти клетки образуются из тимоцитов. У онкологического больного их источником могут быть Т-лимфоциты, утратившие способность к экспрессии специфических маркеров в результате влияния опухолевых клеток. В тимусе на поздней стадии дифференцировки DN разделяются на TCRγδ⁺ и TCRαβ⁺. TCRγδ⁺ не подвергаются дальнейшей трансформации, а TCRαβ⁺ могут либо остаться дубль-позитивными, либо трансформироваться в Th1,2 (CD4⁺), CTL (CD8⁺) или дубль-позитивные Т-лимфоциты (CD4⁺CD8⁺), а под влиянием гуморальных факторов опухоли — в Treg (CD4⁺CD25⁺Foxp3). В дальнейшем, при переходе в фазу ускользания, происходит обратный процесс — дифференцированные клетки утрачивают маркеры, снова трансформируясь в DN, при этом DN Treg, в отличие от эффекторных субпопуляций, сохраняют способность подавлять иммунный ответ. Биологические свойства DN обусловливают их двойственную роль в канцерогенезе. С одной стороны, они экспрессируют TNF-α и IFN-γ, активируя макрофаги, а с другой стороны, за счет продукции IL-10, IL-17, IL-1, IL-8, CXCL2 и CXCL3 способствуют рекрутингу Treg в опухолевый очаг. Наличие в микроокружении дважды негативных опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов (DN TIL) считается неблагоприятным прогностическим фактором в отношении общей и безрецидивной выживаемости у пациентов с гепатоцеллюлярным раком, раком предстательной железы, немелкоклеточным раком легкого, глиобластомой [37].

Помимо прямого влияния субпопуляций, подавляющих нормальный иммунный ответ, описан еще один механизм иммуносупрессии — истощение. Th1,2 и CTL теряют способность элиминировать опухолевые клетки, пролиферировать и, в ряде случаев, подвергаются апоптозу. В этом состоянии наблюдается гиперэкспрессия ингибирующих рецепторов (PD-1/L1, TIM-3, LAG-3, TIGIT) и снижение продукции эффекторных цитокинов (IFN-γ, TNF-α). В экспериментах показано, что состояние истощения потенциально обратимо [38].

Данные о предиктивной и прогностической роли различных субпопуляций В-лимфоцитов (CD19⁺, CD20⁺, CD38⁺) противоречивы. До сих пор остаются неясными детали взаимодействия В-лимфоцитов с опухолевыми клетками. Высокая плотность CD38⁺ в микроокружении и высокая концентрация в периферической крови — благоприятный прогностический фактор в отношении безрецидивной выживаемости. Но среди них имеется недавно описанная субпопуляция клеток с регуляторным потенциалом — B_reg. Они продуцируют IL-10 и TGF-β, способствуя генерации пула Treg [39].

Существует еще одна популяция лимфоидных клеток, влияющих на канцерогенез и формирование иммуносупрессивного микроокружения — врожденные лимфоидные клетки (ILCs). ILCs возникают из общего лимфоидного предшественника с другими лимфоцитами. К настоящему времени выделяют три типа ILCs: ILC1s, ILC2s, ILC3s. Под действием IL-12, IL-15 и IL-18 изменяется профиль экспрессии: ILC1s секретируют IFN-γ, стимулируя МФ и DC; ILC2s секретируют IL-5, IL-9, IL-13 и амфирегулин, усиливая секреторную активность Treg; ILC3s стимулируют стромальные клетки. ILC1s обладают противоопухолевой активностью. ILC3s вместе со стромальными клетками способствуют формированию лимфогенных метастазов. Высокая концентрация ILC2s связана с высокой частотой возникновения метастазов в легких и печени [40].

Гуморальные факторы, влияющие на созревание и функции миелоидных и лимфоидных компонентов микроокружения опухоли

В микроокружении опухоли продуцируется ряд гуморальных факторов, модифицирующих функции ее компонентов. Cреди них существенная роль принадлежит цитокинам (IL-6, IL-10), хемокинам (IL-8), факторам роста (TGF-β), матриксным металлопротеиназам (MMP) и ганглиозидам (табл. 2).

 

Таблица 2. Проканцерогенные гуморальные факторы в микроокружении опухоли [4, 41]

Table 2. Procarcinogenic humoral factors in the tumor microenvironment [4, 41]

Фактор		Механизм действия	Мишени	Влияние на опухоль
Цитокины	TNF-α	Индукция апоптоза и сигнальных путей NF-κB и TGF-β	Опухолевые и стромальные клетки	Пролиферация, ангиогенез, инвазия
	IL-6	Индукция JAK/STAT	Опухолевые и эндотелиальные клетки	ЕМТ, пролиферация и ингибирование апоптоза
	IL-8	Миграция лимфоцитов и эндотелиоцитов	Лимфоцты и эндотелиальные клетки	Пролиферация, ангиогенез
	IL-10	Альтернативная поляризация клеток	Дендритные клетки, незрелые Т-лимфоциты	Пролиферация, ангиогенез, иммуносупрессия
	IL-17	Индукция экспрессии IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α	Опухолевые, стромальные клетки, лимфоциты, моноциты	Пролиферация, ангиогенез, инвазия, иммуносупрессия
Факторы роста	TGF-β	Иммуносупрессия, EMT	Опухолевые и стромальные клетки	Инвазия и метастазирование
	VEGF	Миграция и пролиферация эндотелиоцитов	Эндотелиальные клетки	ЕМТ, ангиогенез, инвазия
	EGF	Рост, рекрутинг опухолевых клеток, ЕМТ	Опухолевые и стромальные клетки	Пролиферация, ЕМТ, инвазия
	FGF	Пролиферация и ангиогенез	Эндотелиальные клетки	ЕМТ, ангиогенез
	PDGF	EMT, стимуляция экспрессии VEGF и EGF	Опухолевые клетки, фибробласты, эндотелиоциты, перициты	Ангиогенез, инвазия, выживание опухолевых клеток
	HGF	EMT	Опухолевые клетки	ЕМТ
Хемокины	CXCL12, CXCR4	Рекрутинг стромальных клеток	Опухолевые и стромальные клетки	Пролиферация, миграция опухолевых и стромальных клеток
Протеазы	MMP	Деградация матрикса, базальной мембраны и связей клеток и матрикса	Экстрацеллюлярный матрикс	Инвазия, метастазирование, ангиогенез
	uPA	Образование плазмина	Эндотелиальные клетки	Интравазация
Примечание. TNF-α — фактор некроза опухоли альфа; IL — интерлейкины; TGF-β — трансформирующий фактор роста бета; VEGF — сосудистый эндотелиальный фактор роста; EGF — эпидермальный фактор роста; FGF — фактор роста фибробластов; PDGF — тромбоцитарный фактор роста; HGF — фактор роста гепатоцитов; CХСL — хемокины; MMP — матриксные металлопротеиназы; uPA — активатор плазминогена урокиназного типа; EMT — эпителиально-мезенхимальный переход.

 

Цитокины, хемокины и факторы роста продуцируются злокачественными клетками и микроокружением. Они выступают в качестве аутокринных и паракринных регуляторов. В канцерогенезе их роль заключается в стимуляции аттракции клеток иммунной системы, увеличении степени злокачественности за счет модулирования экспрессии интегринов, индукции адгезии и стимуляции миграции, а также в формировании микрометастазов за счет неоангиогенеза. MMP — семейство циклин-зависимых эндопептидаз, включающее более 20 ферментов. В процессе канцерогенеза большинство опухолей секретируют MMP в межклеточное пространство, причем степень экспрессии коррелирует со стадией, инвазивностью и прогнозом заболевания. MMP регулируют процессы ангиогенеза, клеточной пролиферации, апоптоз, иммуносупрессию, а также инвазивность и метастатический потенциал опухолей. Механизм иммуносупрессорного действия ганглиозидов связан с ингибированием сигнальной трансдукции в CTL и подавлением продукции цитокинов Th1. Высокая концентрация ганглиозидов в периферической крови коррелирует с неблагоприятным прогнозом у пациентов с нейробластомой, меланомой и почечно-клеточным раком [4, 41].

Третичные лимфоидные органы в микроокружении опухоли

В классическом варианте генерация эффективного адаптивного иммунного ответа, включающая все этапы созревания DC и презентацию антигенов в составе MHC эффекторным клеткам, происходит во вторичных лимфоидных органах (селезенке, лимфатических узлах). Детальное изучение микроокружения позволило выявить, что непосредственно в опухоли образуются третичные лимфоидные органы (TLO), в которых дублируются эти процессы. TLO состоят из Т-зон, содержащих в большом количестве DC и В-герминогенные центры. В составе TLO выявляются лимфоциты с маркерами CD19 и/или CD20; фолликулярные DC, локализующиеся в герминогенных центрах и экспрессирующие CD21, CD35, CD23; DC с маркерами CD83 и CD86; плазматические клетки с маркерами CD138 и CD269; различные субпопуляции Т-лимфоцитов: Th1, Th2, Treg; НФ (CD66) и МФ (CD68). Стимулятор формирования TLO — хроническое воспаление. Локальная продукция иммунокомпетентными и стромальными клетками CXCL13 и IL-17 приводит к рекрутингу специализированных клеток-индукторов формирования лимфоидной ткани (LTi), функции которых могут также выполнять Th17, B-клетки и М1. LTi экспрессируют лимфотоксин α₁β₂ (LT α₁β₂), связывающийся с LTβ рецептором (LTβR) на мембране стромальных клеток, что приводит к продукции VEGF-C, экспрессии молекул адгезии (ICAM1, MADCAM1) и формированию HEV (венулы с высоким эндотелием). Комбинированный сигнал от IL-17 и LTα₁β₂-LTβR приводит к секреции хемокинов и лигандов (CXCL12, CXCL13, CCL9, CCL21), которые в свою очередь стимулируют экспрессию LTα₁β₂ на поверхности лимфоцитов, к их рекрутингу через HEV и формированию Т- и В-зон. В большинстве проведенных исследований авторы приходят к выводу, что TLO является благоприятным прогностическим фактором при различных вариантах опухолей [42].

Типы микроокружения опухоли

Наличие лимфоидной инфильтрации, составляющей 50–60 % объема стромы, говорит о хорошем прогнозе и потенциальной чувствительности к иммуноонкологическим препаратам и химиотерапии. В 2016 г. Х. Yu c соавторами провели метаанализ 17 публикаций с участием 12 968 пациентов и пришли к заключению, что наличие TIL оказался благоприятным прогностическим фактором в отношении безрецидивной выживаемости и предиктором ответа на неоадъювантную терапию. Выявление PD-1⁺ TIL и Foxp3⁺ TIL является неблагоприятным прогностическим фактором в отношении общей выживаемости, а CD8⁺TIL — благоприятным в отношении общей и безрецидивной выживаемости [43].

В истории изучения чувствительности опухоли к иммунотерапии предложено несколько классификаций, основанных на составе, плотности и локализации иммунокомпетентных клеток. Единственная классификация, которая вошла в широкую клиническую практику — иммунологический индекс, который используется для прогнозирования у больных колоректальным раком. Сущность его заключается в подсчете субпопуляций CD3⁺ и CD8⁺ в центре и инвазивном крае опухоли. Индекс варьирует от 0 (низкая плотность и отсутствие обоих типов клеток в обоих регионах) до 14 (высокая плотность и локализация обоих типов клеток в обоих регионах). В литературе эти два крайних варианта получили название «горячая» и «холодная» опухоль. Позднее тем же автором была предложена более совершенная классификация, включающая 4 подтипа опухолей с разными клеточными и молекулярно-биологическими характеристиками: 1) «горячие» опухоли: высокая степень инфильтрации Т-клетками, гиперэкспрессия костимулирующих и коингибирующих молекул: CTLA-4, TIM-3, LAG-3; 2) «измененные иммуносупрессивные»: инфильтрация Т-лимфоцитами низкая или отсутствует, присутствуют растворимые иммуносупрессивные медиаторы (IL-10, TGF-β), присутствуют MDSC, гиперэкспрессированы CTLA-4, TIM-3, LAG-3; 3) «измененные иммуно-исключенные»: инфильтрация Т-лимфоцитами отсутствует, выражены гипоксия и неоангиогенез, гиперэкспрессированы онкогены; 4) «холодные» опухоли: отсутствует инфильтрация Т-лимфоцитами, нет признаков реализации иммунного ответа [44, 45].

Особенности микроокружения опухоли при почечно-клеточном, уротелиальном и раке предстательной железы

Почечно-клеточный рак, уротелиальный рак и рак предстательной железы представляют собой гетерогенные опухоли с точки зрения молекулярных механизмов канцерогенеза. Несмотря на это, соотношение компонентов микроокружения имеет ряд общих особенностей для каждой патологии (табл. 3).

 

Таблица 3. Ключевые характеристики микроокружения при раке почки, предстательной железы, уротелиальном раке, и связанные с ними особенности опухолевых клеток

Table 3. Key characteristics of the microenvironment in kidney cancer, prostate cancer, urothelial cancer, and related features of tumor cells

Параметр		Почечно-клеточный рак [46, 47]	Рак предстательной железы [48, 49]	Уротелиальный рак [50, 51]
Опухолевые клетки	Классические HLA-I	↓	↓↓↓	↓
	Неклассические HLA-I	↑↑	↑	↑
	COX-2	↑	↑↑	↑
	IDO	↑↑	↑↑	↑
	Arg1	↑	↑↑↑	↑
Клетки микроокружения	Ключевые эффекторные клетки	NK↑, CTL↑, МФ1↑	NK↑	NK↑↑, NKT↑↑, CTL↑↑, МФ1↑↑, НФ↑↑, γδ-T↑, B-лимфоциты, тучные клетки
	Ключевые иммуносупрессивные клетки	Treg↑↑, MDSC↑, МФ2↑, Breg↑	CAF↑↑↑, Treg↑↑↑, MDSC↑↑↑, МФ2↑↑, Th17↑↑	МФ2↑, Treg↑, Th17↑
	Экспрессия ко-ингибирующих молекул	PD-1↑, PD-L1↑, CTLA-4↑, CD28↑, LAG-3↑, TIM-3↑	PD-1↑↑↑, CTLA-4↑↑, TIM-3↑↑, TIGIT↑↑	PD-1↑, TIM-3↑
	Продукция иммуносупрессивных цитокинов	IL-10↑, IL-6↑↑, IL-4↑↑	IL-10↑↑↑, IL-6↑↑, IL-23↑↑б IL-1↑↑↑, IL-7↑↑, IL-17↑↑	IL-6↑, IL-10↑, IL-17↑, IL-4↑
	Продукция факторов роста	VEGF↑↑	VEGF↑↑, TGF-β↑↑↑, EGF↑↑	VEGF↑
	Продукция хемокинов	IL-8↑	IL-8↑↑, CCL-2↑↑↑, CХСL-1↑↑↑, CХСL-8↑↑↑, CХСL-16↑↑↑ CХ3СL-1↑↑, CХСL-12↑↑↑	IL-8↑, CCL-2↑, CХСL-9↑, CХСL-10↑
	Продукция низкомолекулярных регуляторов	PGE2↑	PGE2↑, аденозин↑↑	–
	Феномен «истощения»	↑↑↑	↑↑↑	↑
Примечание. HLA-I — молекулы главного комплекса гистосовместимости; COX-2 — циклооксигеназа 2-го типа; IDO — индоламин-2,3-диоксигеназа; Arg1 — аргиназа 1-го типа; PGE2 — простогландин Е2; NK — натуральные киллеры; NKT — натуральные киллеры с Т-клеточным рецептором; CTL — цитотоксические лимфоциты; МФ — макрофаги; НФ — нейтрофилы; γδ-T — гамма/дельта-Т-лимфоциты; Treg — Т-регуляторные клетки; MDSC — супрессорные клетки миелоидного происхождения; Breg — B-регуляторные клетки; CAF — опухоль-ассоциированные фибробласты; VEGF — сосудистый эндотелиальный фактор роста; CХСL — хемокины; ↑ — степень выраженности признака.

 

Молекулярно-биологические дефекты, лежащие в основе канцерогенеза почечно-клеточного рака, создают предпосылки для использования препаратов целенаправленного действия, блокирующих определенные этапы жизнедеятельности опухолевой клетки. В 90 % случаев светлоклеточный вариант характеризуется инактивацией супрессорного гена von Hippel-Lindau (VHL), что приводит к нарушениям в сигнальных путях, связанных с ангиогенезом и апоптозом. Это создает условия для успешного использования ингибиторов ангиогенеза и препаратов из группы mTOR (мишень рапамицина млекопитающих). Кроме того, клетки почечно-клеточного рака характеризуются способностью к противодействию иммунологической деструкции за счет индукции системных нарушений в генерации адекватного иммунного ответа и внутриклеточных сигналах TIL. Большинство гистологических образцов почечно-клеточного рака по структуре можно отнести к группе «горячих» опухолей. Они характеризуются высокой частотой лимфоидной инфильтрации, низким содержанием в инфильтратах иммуносупрессивных компонентов, а также наличием нескольких типов эффекторных клеток. Состав третичных лимфоидных органов имеет прогностическое значение. Локализацию DC и CTL в них можно рассматривать как индикатор благоприятного прогноза в отношении общей и безрецидивной выживаемости. Часто выявляется феномен истощения Th и CTL. При анализе экспрессии генов часто обнаруживаются паттерны, связанные с активацией иммунного ответа, воспаления и ангиогенеза [52–54].

Рак предстательной железы по составу микроокружения относится чаще всего к «холодным» или «измененным иммуноисключенным» опухолям. Лимфоидная инфильтрация встречается редко. При ее наличии в составе микроокружения в большой концентрации образуются иммуносупрессорные компоненты (Treg, MDSC, МФ2, Th17). Ключевая роль в формировании клеточного состава принадлежит опухоль-ассоциированным фибробластам (CAF). Часто выявляется гиперэкспрессия Arg1 и IDO. Злокачественные клетки и микроокружение продуцируют в большом количестве иммуносупрессивные цитокины, факторы роста и хемокины. Третичные лимфоидные органы при раке предстательной железы часто становятся «центрами иммуносупрессии». В них концентрируются Тreg и MDSC. Редко выявляются Th1 и CTL. В этом случае наличие третичных лимфоидных органов можно считать благоприятным прогностическим фактором в отношении рецидива [55–57].

Большинство изученных гистологических образцов уротелиального рака относятся к «горячим» или «измененным иммуносупрессивным» опухолям. Причем это относится как к поверхностным, так и к инвазивным формам. Часто выявляются лимфоидные инфильтраты, содержащие разнообразные эффекторные клетки, включая NKT, CTL, МФ1, НФ, γδ-T, B-лимфоциты и тучные клетки. Иммуносупрессивный компонент представлен, в основном, MDSC. В ряде случаев продуцируются иммуносупрессивные цитокины (IL-6, IL-10, IL-17, IL-4) и хемокины (IL-8, CCL-2, CХСL-9, CХСL-10). В микроокружении часто выявляются третичные лимфоидные органы различного состава. Прогностического значения они не имеют [58, 59].

В ФГБУ «РНЦРХТ им. акад. А.М. Гранова» Минздрава России проведено исследование, в котором оценивалось содержание субпопуляций лимфоцитов и миелоцитов, а также спонтанной и индуцированной продукции лимфоцитов в микроокружении опухоли и в периферической крови (табл. 4–6).

 

Таблица 4. Относительные показатели системного и локального иммунитета у больных раком почки, мочевого пузыря и предстательной железы

Table 4. Relative indices of systemic and local immunity in patients with kidney, bladder and prostate cancer

Показатель	Почечно-клеточный рак		Мышечно-инвазивный рак мочевого пузыря		Рак предстательной железы
	микроокружение опухоли [Мe; RQ]	сыворотка [Мe; RQ]	микроокружение опухоли [Мe; RQ]	сыворотка [Мe; RQ]	микроокружение опухоли [Мe; RQ]	сыворотка [Мe; RQ]
CD3+CD16–	71,1 [71; 87, 1]	74,2 [69; 84, 2]	68,9 [65; 87, 1]	72,2 [67; 84, 7]	71,2 [69; 80, 1]	65,9 [62; 70, 7]
	p > 0,05		p > 0,05		p > 0,05
CD3+CD8+	23,1 [19; 30, 1]	41,4 [32; 52, 6]	26,2 [22; 30, 2]	29,4 [24; 32, 1]	22,2 [19; 27, 9]	34,2 [29; 37, 3]
	p < 0,05		p > 0,05		p < 0,05
CD3+CD4+	32,1 [27; 40, 1]	34,2 [28; 42, 2]	33,6 [29; 37, 6]	34,6 [29; 35, 7]	30 [27, 6; 35]	31,8 [29; 33, 7]
	p > 0,05		p > 0,05		p > 0,05
CD4+CD8+	0,2 [0; 1]	0,4 [0, 1; 1, 4]	0,4 [0, 3; 1, 2]	0,5 [0, 4; 1, 7]	0,2 [0; 2, 9]	1,3 [0, 7; 2, 1]
	p > 0,05		p > 0,05		p < 0,05
CD3–CD16+ CD56+	10,2 [7, 6; 11, 1]	12,4 [9, 1; 14, 2]	9,2 [8, 6; 11, 3]	10,4 [9, 2; 10, 8]	10,2 [8, 4; 11, 2]	11,7 [10, 1; 13]
	p > 0,05		p > 0,05		p > 0,05
CD16+CD56+ HLA DR+	2,7 [0; 3, 2]	9,2 [7, 4; 12, 1]	3,6 [2, 2; 4, 7]	4,2 [2, 3; 4, 9]	2,9 [1, 5; 3, 7]	10,4 [7, 8; 11, 1]
	p < 0,05		p > 0,05		p < 0,05
CD3+CD16+ CD56+	2,4 [1, 2; 3, 2]	2,2 [1, 1; 3, 6]	3,3 [3, 1; 4, 6]	4,1 [3, 6; 4, 7]	3,7 [2, 2; 4, 1]	3,3 [3, 2; 4, 9]
	p > 0,05		p > 0,05		p > 0,05
CD3–CD19+	7,4 [5, 2; 8, 2]	8,6 [6, 2; 9, 4]	9,6 [8, 2; 10, 4]	8,2 [7, 8; 9, 4]	8,7 [7, 9; 9, 4]	8,9 [8, 1; 10, 1]
	p > 0,05		p > 0,05		p > 0,05
CD4+CD25+CD127–	12,4 [9, 2; 14, 1]	7,1 [6, 1; 9, 4]	11,4 [10, 2; 13]	9,9 [9, 2; 12, 1]	16,1 [14, 2; 18]	10,2 [19, 8; 12]
	p < 0,05		p > 0,05		p < 0,05
αβ-Т	64,1 [59; 77, 1]	68,2 [60, 4; 72]	65,2 [60, 7; 74]	70,2 [69, 6; 77]	63,7 [61; 69, 1]	68,4 [61, 4; 69]
	p > 0,05		p > 0,05		p > 0,05
γδ-Т	7,7 [5, 9; 8, 1]	6,7 [5, 9; 9, 2]	8,4 [6, 9; 8, 7]	5,2 [5, 9; 8, 1]	8,1 [7, 6; 8, 9]	7,7 [6, 9; 8, 1]
	p > 0,05		p < 0,05		p > 0,05
LIN–HLADR–CD33+CD66b+ CD14–CD15+	0,22 [0, 04; 0, 4]	0,19 [0, 1; 0, 32]	0,12 [0; 0, 32]	0,1 [0; 0, 45]	0,032 [0, 025; 0, 15]	0,041 [0, 032; 0, 251]
	p > 0,05		p > 0,05		p > 0,05
LIN–HLADR–CD33+CD66b– CD14+CD15–	0,74 [0, 62; 1, 4]	0,48 [0, 62; 1, 4]	0,62 [0, 49; 1, 8]	0,58 [0, 32; 1, 12]	0,96 [0, 45; 1, 65]	0,62 [0, 32; 1, 2]
	p < 0,05		p > 0,05		p < 0,05
Примечание. Me — медиана; RQ — межквартильный размах; p — достоверность различий показателя в сыворотке и в микроокружении опухоли; CD3+CD16− — зрелые Т-лимфоциты; CD3+CD8+ — цитотоксические лимфоциты; CD3+CD4+ — Т-хелперы; CD4+CD8+ — дубль-позитивные Т-клетки; CD3−CD16+CD56+ — натуральные киллеры; CD16+CD56+HLADR+ — активированные натуральные киллеры; CD3+CD16+CD56+ — TNK-клетки; CD3–CD19+ — В-лимфоциты; CD4+CD25+CD127– — Т-регуляторные клетки; αβ-Т — альфа/бета-Т-клетки; γδ-Т — гамма/дельта-Т-клетки; LIN–HLADR–CD33+CD66b+CD14–CD15+ — гранулоцитарные супрессорные клетки миелоидного происхождения; LIN–HLADR–CD33+CD66b–CD14+CD15– — моноцитрные супрессорные клетки миелоидного происхождения.

 

Таблица 5. Спонтанная продукция цитокинов у больных раком почки, мочевого пузыря и предстательной железы

Table 5. Spontaneous production of cytokines in patients with kidney, bladder and prostate cancer

Показатель	Почечно-клеточный рак		Мышечно-инвазивный рак мочевого пузыря		Рак предстательной железы
	микроокружение опухоли, Мe	сыворотка, Мe	микроокружение опухоли, Me	сыворотка, Me	микроокружение опухоли, Me	сыворотка, Me
IL-1, пг/мл	25	27	32	29	29	27
	p > 0,05		p > 0,05		p > 0,05
IL-2, пг/мл	4	3	2	4	3	3
	p > 0,05		p > 0,05		p > 0,05
IL-4, пг/мл	32,1	27,6	45,9	16,5	35,4	31,8
	p > 0,05		p < 0,05		p > 0,05
IL-6, пг/мл	26000	120	12000	92	40000	170
	p < 0,05		p < 0,05		p < 0,05
IL-8, пг/мл	22000	492	4000	172	32000	670
	p < 0,05		p < 0,05		p < 0,05
IL-10, пг/мл	150,4	10,8	12,8	4,2	75,5	6,2
	p < 0,05		p < 0,05		p < 0,05
IL-12, пг/мл	22	27	31	34	40	37
	p > 0,05		p > 0,05		p > 0,05
IFN-α, пг/мл	21,4	19	12,8	9	36,4	9,8
	p > 0,05		p > 0,05		p < 0,05
IFN-γ, пг/мл	170,2	12	32	18	127,4	10,2
	p < 0,05		p > 0,05		p < 0,05
TNF-α, пг/мл	12	14	9	10	15	17
	p > 0,05		p > 0,05		p > 0,05
TGF-β, пг/мл	100,4	82,9	52,7	34,5	812,4	62,6
	p > 0,05		p > 0,05		p < 0,05
VEGF, пг/мл	1835,5	72,4	543,5	57,3	2820,4	55,7
	p < 0,05		p < 0,05		p < 0,05
Примечание. Me — медиана; p — достоверность различий показателя в сыворотке и в микроокружении опухоли.

 

Таблица 6. Индуцированная продукция цитокинов у больных раком почки, мочевого пузыря и предстательной железы

Table 6. Induced production of cytokines in patients with kidney, bladder and prostate cancer

Показатель	Почечно-клеточный рак		Мышечно-инвазивный рак мочевого пузыря		Рак предстательной железы
	микроокружение опухоли, Мe	сыворотка, Мe	микроокружение опухоли, Me	сыворотка, Me	микроокружение опухоли, Me	сыворотка, Me
IL-1, пг/мл	3227	4128	5321	4832	3458	4225
	p > 0,05		p > 0,05		p > 0,05
IL-2, пг/мл	7,8	14,2	9,4	1,8	3,2	17,4
	p > 0,05		p > 0,05		p < 0,05
IL-4, пг/мл	168,2	212,5	234,1	278,5	181,2	243,1
	p > 0,05		p > 0,05		p > 0,05
IL-6, пг/мл	10231	15280	12000	13655	12672	11758
	p < 0,05		p > 0,05		p > 0,05
IL-8, пг/мл	27000	25345	7823	8654	48000	32568
	p > 0,05		p > 0,05		p < 0,05
IL-10, пг/мл	212,1	453,1	128,3	231,2	112,7	765,1
	p < 0,05		p < 0,05		p < 0,05
IL-12, пг/мл	453,6	317,9	312,5	289,1	765,1	612.9
	p > 0,05		p > 0,05		p > 0,05
IFN-α, пг/мл	413,9	512,3	312,6	452,3	389,6	414,1
	p > 0,05		p > 0,05		p < 0,05
IFN-γ, пг/мл	728,3	3274,1	674,9	2134,2	125,5	3564
	p < 0,05		p < 0,05		p < 0,05
TNF-α, пг/мл	529,1	1127	112,5	543,1	96,8	1369
	p < 0,05		p < 0,05		p < 0,05
TGF-β, пг/мл	100,4	82,9	52,7	34,5	812,4	62,6
	p > 0,05		p > 0,05		p < 0,05
Примечание. Me — медиана; p — достоверность различий показателя в сыворотке и в микроокружении опухоли.

 

Сравнительный анализ относительного содержания субпопуляций лимфоцитов в микроокружении опухоли и крови выявил следующие закономерности: а) содержание CTL достоверно ниже в микроокружении у больных ПКР и РПЖ; б) содержание дубль-позитивных Т-клеток (CD4⁺CD8⁺) достоверно ниже в микроокружении у больных РПЖ; в) содержание активированных NK в микроокружении достоверно ниже у больных ПКР и РПЖ; г) содержание Тreg достоверно выше в микроокружении всех исследуемых групп пациентов, за исключением РМП; д) содержание γδ-Т-лимфоцитов достоверно выше в микроокружении больных РМП. Таким образом, у больных раком почки и предстательной железы отмечается превалирование иммуносупрессивных компонентов. Такой закономерности не наблюдается у больных раком мочевого пузыря.

Сравнительный анализ спонтанной продукции цитокинов в микроокружении опухоли и крови выявил следующие закономерности: а) спонтанная продукция IL-4 достоверно выше в микроокружении больных РМП; б) спонтанная продукция IL-6, IL-8, IL-10 и VEGF достоверно выше в микроокружении у больных всех исследуемых групп; в) спонтанная продукция IFN-α достоверно выше в микроокружении больных РПЖ; г) спонтанная продукция IFN-γ достоверно выше в микроокружении больных ПКР и РПЖ; д) спонтанная продукция TGF-β достоверно выше в микроокружении больных РПЖ.

Сравнительный анализ индуцированной продукции цитокинов в микроокружении опухоли и крови выявил следующие закономерности: а) индуцированная продукция IL-2 достоверно ниже в микроокружении больных РПЖ; б) индуцированная продукция IL-6 достоверно ниже в микроокружении больных ПКР; в) индуцированная продукция IL-8 достоверно выше в микроокружении больных РПЖ; г) индуцированная продукция IL-10, IFN-γ и TNF-α достоверно ниже в микроокружении больных всех исследованных групп; д) индуцированная продукция IFN-α достоверно ниже в микроокружении больных РПЖ; е) индуцированная продукция TGF-β достоверно выше в микроокружении больных РПЖ; ж) индуцированная продукция VEGF достоверно выше в микроокружении больных всех исследуемых групп.

Микроокружение опухоли у больных ПКР характеризуется: а) низким содержанием CTL и активированных NK; б) высоким содержанием Тreg; в) высокой спонтанной продукцией IL-6, IL-8, IL-10 и VEGF; г) низкой индуцированной продукцией IL-6, IL-10, IFN-γ и TNF-α; д) высокой индуцированной продукцией VEGF.

Микроокружение опухоли у больных РМП характеризуется: а) высоким содержанием γδ-Т-клеток; б) высокой спонтанной продукцией IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 и VEGF; в) низкой индуцированной продукцией IL-10, IFN-γ и TNF-α; д) высокой индуцированной продукцией VEGF.

Микроокружение опухоли у больных РПЖ характеризуется: а) низким содержанием CTL, активированных NK и дубль-позитивных Т-клеток; б) высоким содержанием Тreg; в) высокой спонтанной продукцией IL-6, IL-8, IL-10, IFN-α, IFN-γ и VEGF; г) низкой индуцированной продукцией IL-2, IL-8, IL-10, IFN-γ, IFN-α и TNF-α; д) высокой индуцированной продукцией TGF-β и VEGF.

Проведенные исследования в целом подтверждают и детализируют данные, полученные другими исследователями.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Оценка количественных и качественных характеристик микроокружения опухоли необходима для решения основных задач, стоящих перед современной онкологией: поиск новых мишеней для разработки препаратов; создание экспертных систем, основанных на прогностических и предсказательных возможностях иммуносупрессивных и эффекторных компонентов; индивидуализация лечебных программ и разработка протоколов комбинированного лечения.

Современные иммуноонкологические препараты блокируют какой-либо важный сигнальный или метаболический путь клеток-мишеней. Этот подход довольно сложно реализовать в отношении микроокружения опухоли вследствие ограниченного числа мишеней. Конъюгаты на основе химических компонентов или терапевтических радиофармпрепаратов, где макромолекулы выполняют лишь функции транспортных систем, являются идеальными средствами для элиминации иммуносупрессивных компонентов.

Компонентный состав микроокружения меняется с течением времени, а также при различных терапевтических вмешательствах. Кроме того, его структура может различаться в разных метастатических очагах. Поэтому для разработки прогностических систем и индивидуализации лечения необходимо использовать диагностические радиофармпрепараты, которые в режиме реального времени могут показывать распределение мишеней, а также иммунологические показатели, концентрация которых коррелирует с их содержанием в микроокружении. Некоторые авторы предлагают использовать для этой цели системы искусственного интеллекта [7, 9].

Мультимодальность канцерогенеза и многокомпонентность микроокружения приводит к необходимости использовать лечебные воздействия, реализующие различные механизмы элиминации опухоли. Кроме препаратов, непосредственно направленных на элиминацию иммуносупрессивных компонентов, необходимо применять лучевую терапию, а также препараты, направленные на трансформацию «холодных» и «иммуноисключенных» опухолей в «горячие». Лучевая терапия обеспечивает «обскопальный» эффект, заключающийся в повышении эффективности иммунотерапии при комбинации с облучением. Он реализуется за счет гибели иммуносупрессивных клеток и генерации «сигналов» опасности, включающих неоантигены и низкомолекулярные компоненты. Для коррекции микроокружения опухоли с целью повышения эффективности лечебных мероприятий в настоящее время предлагают использовать клетки с химерным антигенным рецептором и биспецифические антитела, способствующие рекрутингу иммунокомпетентных клеток [8, 60].

Изучение компонентов микроокружения и особенностей взаимодействия между ними — ключевой компонент повышения эффективности лечения онкологических больных в ближайшей перспективе.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Вклад каждого автора: О.Е. Молчанов — анализ полученных данных, написание текста; Д.Н. Майстренко — концепция исследования, правка текста; Д.А. Гранов — концепция исследования, редакция окончательного варианта текста; И.Ю. Лисицын — сбор и обработка материалов; А.А. Романов — сбор и обработка материалов.

Источник финансирования. Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства здравоохранения Российской Федерации (Государственное задание Э.03-2021; 121040200136-0).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

ADDITIONAL INFORMATION

Author contribution. Thereby, all authors made a substantial contribution to the conception of the study, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the article, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the study. The contributions of each author: O.E. Molchanov — analysis of the received data, writing the text; D.N. Maistrenko — research concept, text editing; D.A. Granov — research concept, revision of the final version of the text; I.Yu. Lisitsyn — collection and processing of materials; A.A. Romanov — collection and processing of materials.

Funding source. The work was carried out with the financial support of the Ministry of Health of the Russian Federation (State assignment Э.03-2021; 121040200136-0).

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

About the authors

Oleg E. Molchanov

A.M. Granov Russian Research Center of Radiology and Surgical Technologies

Author for correspondence.
Email: molchanovo@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3882-1720
SPIN-code: 5557-6468
Scopus Author ID: 25637650600
ResearcherId: AAX-2364-2020

Dr. Sci. (Med.), Head of Department of Fundamental Investigations

Russian Federation, Pesochnyi village, Saint Petersburg

Dmitriy N. Maistrenko

A.M. Granov Russian Research Center of Radiology and Surgical Technologies

Email: may64@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8174-7461
SPIN-code: 7363-4840
Scopus Author ID: 57193120885
ResearcherId: AAA-9446-2020

Dr. Sci. (Med.), Director

Russian Federation, Pesochnyi village, Saint Petersburg

Dmitriy A. Granov

A.M. Granov Russian Research Center of Radiology and Surgical Technologies

Email: da_granov@rrcrst.ru
ORCID iD: 0000-0002-8746-8452
SPIN-code: 5256-2744

Dr. Sci. (Med.), Professor, Academician of the Russian Academy of Sciences, Scientific Adviser

Russian Federation, Pesochnyi village, Saint Petersburg

Igor Yu. Lisitsin

A.M. Granov Russian Research Center of Radiology and Surgical Technologies

Email: urologlis@mail.ru

Cand. Sci. (Med.), Urologist, Head of the Outpatient Consultation Center

Russian Federation, Pesochnyi village, Saint Petersburg

Alexandr A. Romanov

A.M. Granov Russian Research Center of Radiology and Surgical Technologies; Sortavala Central District Hospital

Email: tiffozi@mail.ru

Research Associate; Chief Physician

Russian Federation, Pesochnyi village, Saint Petersburg; Sortavala Republic of Karelia

References

Supplementary files