Заместительная уретропластика тканеинженерными конструкциями в эксперименте

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Основным методом лечения патологий мочеиспускательного канала является хирургический, в том числе в ряде случаев требующий нестандартных подходов в планировании и технике выполнения операции [1, 2]. Существует множество вариантов заместительных и аугментационных уретропластик, выбор которых зависит от локализации патологического процесса, этиологии и протяженности поражения. В качестве имплантируемого материала используют собственные ткани: кожные лоскуты из крайней плоти, кожи полового члена, мошонки, промежности, лоскуты влагалищной оболочки яичка, трансплантаты из слизистой щеки, слизистой мочевого пузыря [3].

Помимо традиционных лоскутов и трансплантатов для заместительной уретропластики в настоящее время разрабатываются альтернативные материалы с использованием тканевой инженерии, целью которых является исключение возникающих в ходе традиционных оперативных вмешательств сложностей, связанных с недостаточной длиной графта, а также с осложнениями в донорской зоне и увеличением длительности вмешательства [4].

Собственный опыт применения для замещения дефектов мочевого пузыря тканеинженерных конструкций, содержащих мезенхимальные стволовые клетки (МСК), показывает способность МСК к формированию структур, сходных с уротелием [5, 6], что позволяет расширить область их применения.

Наше исследование посвящено разработке новых тканеинженерных конструкций для пластики уретры с использованием клеток различного тканевого происхождения и биополимеров, что является актуальной проблемой современной медицины.

Цель работы — экспериментальное обоснование возможности применения тканеинженерных конструкций для замещения дефектов уретры.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование двухэтапное, экспериментальное, контролируемое. На первом этапе in vivo в исследование было включено 10 половозрелых нелинейных белых крыс-самцов массой тела 393,7 ± 29,97 г (350–444 г) в рамках изучения биодеградации скаффолдов.

На втором этапе созданные тканеинженерные конструкции (ТИК) имплантировали на модели острой травмы уретры экспериментальным животным (кроликам). В данный этап исследования включены 31 половозрелый кролик-самец породы шиншилла массой тела 3919,1 ± 378,01 г (3366–5145 г).

Животные содержались в стандартных условиях согласно действующим нормативным документам и вошли в исследование после двухнедельного карантина, при отсутствии внешних признаков патологии, изменений в общеповеденческих реакциях.

Приготовлено два типа скаффолдов. Для засевания МСК использовали пористую матрицу, состоящую из поли-(D, L)-лактида (ПЛ) и поликапролактона (ПК) (рис. 1, а).

 

Рис. 1. Образцы приготовленных скаффолдов: а — пористый двуслойный из ПЛ + ПК; b — плоский двуслойный из ПЛГ + ПЛК

Fig. 1. Samples of prepared scaffolds: a – porous two-layer scaffold based on PL + PC; b – flat two-layer scaffold based on PLG + PLC

 

Пористый слой двухслойной матрицы, состоящий из поли-(D, L)-лактида, создает благоприятные условия для последующего культивирования МСК.

Для уретропластики с использованием клеток буккального эпителия (КБЭ) изготовлен двухслойный скаффолд на основе полигидроксиэфиров (рис. 1, b). Внутренний слой, который контактирует с мочой, сформировали из поли-L-лактид-капролактона (ПЛК) (70/30) (h = 3,8 дл/г, Purac). Сплошная и непроницаемая для жидкости структура обеспечивает барьерную функцию (от мочи) и механическую прочность всей конструкции. Второй слой, на который засевали клетки буккального эпителия, приготовлен на основе поли-L-лактид-гликолида (ПЛГ) (85/15) (h = 3,13 дл/г, Purac), который наиболее благоприятен для культивирования КБЭ. Стерилизацию скаффолдов выполняли методом озонирования.

Изучение биодеградации скаффолдов произведено на 10 нелинейных белых крысах-самцах. Подкожно крысам были имплантированы скаффолды ПЛ + ПК и ПЛК-ПЛГ.

Протокол хирургического вмешательства

Под общей анестезией с использованием препаратов тилетамина гидрохлорид / золазепама гидрохлорид (Zoletil, Virbac SA, Франция) в дозе 25 мг/кг массы тела внутримышечно и ксилазина гидрохлорид (Bioveta, Чехия) в виде 2 % раствора в объеме 1,0–1,5 мл внутримышечно в области спины с обеих сторон от вертебральной линии выполнены 10 поперечных разрезов (по 5 с каждой стороны) протяженностью 1,0 см каждый (рис. 2). Первая пара разрезов была для контроля, во вторую и третью пары разрезов подкожно были имплантированы скаффолды ПЛ + ПК, а в четвертую и пятую — скаффолды ПЛК-ПЛГ. Затем раны были ушиты, выполнена обработка послеоперационных ран раствором антисептика, асептическая повязка.

 

Рис. 2. Подкожная имплантация скаффолдов в область спины крысы

Fig. 2. Subcutaneous implantation of scaffolds in the rat back

 

Крысы выводились из эксперимента через 1 и 4 нед. (по 5 крыс в каждый срок соответственно) с использованием препаратов тилетамина гидрохлорид / золазепама гидрохлорид (Золетил, Virbac SA, Франция) и миорелаксанта ксилазина гидрохлорид (Рометар, Bioveta, Чехия) в дозах, в 5 раз превышающих терапевтические. Проводилась макроскопическая оценка результатов.

Второй этап исследования — создание и имплантация ТИК на модели острой травмы уретры экспериментальным животным. Кролики были разделены на три группы в зависимости от используемого графта:

• в группу 1 вошли 9 кроликов, которым в уретру дорсолатерально был имплантирован скаффолд на основе ПЛ + ПК с МСК;
• группу 2 составили 15 кроликов, которым был имплантирован скаффолд на основе ПЛГ + ПЛК с КБЭ;
• в группу 3 вошли 4 кролика, которым была выполнена буккальная пластика уретры.

Для последующей идентификации клеток в эксперименте in vivo МСК и КБЭ мечены суперпарамагнитными наночастицами оксида железа (Fe₃О₄, SPION).

Ход хирургического вмешательства представлен на рис. 3.

 

Рис. 3. Уретропластика с имплантацией тканеинженерной конструкции, состоящей из ПЛ + ПК с мезенхимальными стволовыми клетками: a — уретра выделена дорсо-латерально; b — вскрыт просвет уретры; c — тканеинженерная конструкция с мезенхимальными стволовыми клетками; d — сопоставление тканеинженерной конструкции и краев дефекта уретры

Fig. 3. Urethroplasty with implantation of the TEC, based on PL + PC with MSCs: a – the urethra is exposed dorso-laterally; b – the lumen of the urethra is opened; c – TEC with MSC; d – comparison of the TEC and the edges of the urethral defect

 

Под общей анестезией (Золетил, Virbac SA, Франция, в дозе 25 мг/кг массы тела внутримышечно и Рометар, Bioveta, Чехия, в виде 2 % раствора в объеме 1,0–1,5 мл внутримышечно) катетер Фолея № 6 по уретре заведен в полость мочевого пузыря. Продольный разрез кожи полового члена 3 см по ветральной поверхности, тупым и острым путем слева выделена уретра со спонгиозным телом, по дорсальной поверхности создан дефект слизистой 7 × 2 мм. Кроликам группы 3 произведена гидропрепаровка слизистой щеки, взят графт слизистой размерами 1,5 × 0,5 см, который очищали от подлежащей клетчатки и фиксировали к белочной оболочке кавернозных тел и краям дефекта уретры узловыми швами (викрил 6/0). Животным групп 1 и 2 скаффолд фиксировали к краям дефекта и белочной оболочке кавернозных тел отдельными узловыми швами (викрил 6/0). Рану ушивали послойно. Уретральный катетер фиксировали к головке полового члена узловым швом и отсекали на уровне меатуса. Антибиотикопрофилактику проводили Цефазолином в дозировке 10 мг/кг внутримышечно за 1 ч до операции, в послеоперационном периоде также применяли Цефазолин 10 мг/кг 3 раза в сутки в течение 5 дней внутимышечно.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В задачи нашего исследования входило изучение механических характеристик скаффолдов, которые описаны в табл. 1.

 

Таблица 1 / Table 1 Механические свойства скаффолдов Mechanical properties of scaffolds
Скаффолд	Ширина, мм	Толщина, мм	Прочность, МПа	Удлинение при разрыве, %	Модуль упругости, MПа
ПЛ + ПК	3	1,2	0,19 ± 0,09	15,9 ± 3,4	1,68 ± 0,09
ПЛГ + ПЛК	3	0,2	0,22 ± 0,07	19,1 ± 4,1	2,16 ± 0,18
Примечание. p > 0,05.

 

Из данных таблицы следует, что скаффолд на основе ПЛГ + ПЛК более упругий и прочный. При выполнении хирургических вмешательств ни в одном случае не было прорезывания швов. Полученные в результате проведенного исследования механо-прочностные характеристики скаффолдов сопоставимы с соответствующими характеристиками нативной уретры кролика, описанными C. Feng и соавт. [7].

Для оценки токсичности используемых в основе скаффолдов материалов — поли-L-лактид-капролактона (ПЛК, 70/30) и поли-L-лактид-гликолида (ПЛГ, 85/15) — in vitro определяли жизнеспособность мезенхимальных стволовых клеток в условиях их культивирования на синтезированных полимерных пленках (рис. 4).

 

Рис. 4. Мезенхимные стромальные клетки костного мозга человека через 1 сутки культивирования на полимерных пленках (световая микроскопия, ×4; конфокальная микроскопия, ×40)

Fig. 4. Human bone marrow mesenchymal stem cells after 1 day of cultivation on polymer films (light microscopy ×4; confocal microscopy ×40)

 

Фотографии, выполненные через 1 сут. культивирования МСК, представленные на рис. 4, показывают, что клетки сохраняют целостность, одинаково хорошо распластываются и адгезируются как на исследуемых материалах, так и на контрольном материале (стекло). Данные критерии свидетельствуют о жизнеспособности клеток и отсутствии токсичности материалов.

При изучении биодеградации скаффолдов при их подкожной имплантации крысам через 1 нед. определялась частичная биодеградация имплантатов, через 4 нед. — полная (рис. 5). При этом макроскопически через 1 нед. большей деградации подвергся скаффолд на основе ПЛГ + ПЛК.

 

Рис. 5. Процесс биодеградации скаффолдов — подкожно крысам имплантированы исследуемые скаффолды (1, 2 — ПЛ + ПК; 3, 4 — ПЛК + ПЛГ): а — через 1 нед. после имплантации определяется зона вмешательства; b — через 4 нед. макроскопически зона вмешательства не визуализируется

Fig. 5. The process of scaffold biodegradation — the studied scaffolds (1, 2 – PL + PC; 3, 4 – PLC + PLG) were implanted subcutaneously in rats: a – 1 week after implantation, the intervention zone is determined; b – after 4 weeks, the intervention zone is not visualized macroscopically

 

Таким образом, изучение новых скаффолдов на основе поли-L-лактид-капролактона и поли-L-лактид-гликолида показало, что эти матрицы имеют хорошие механические характеристики. Однако при их сравнении скаффолды на основе ПЛГ + ПЛК обладают большей прочностью и упругостью. Изучение биодеградации показало, что все скаффолды к 4-й неделе полностью рассасываются. При их сравнении процесс биодеградации быстрее происходит у скаффолдов на основе ПЛГ + ПЛК.

Для оценки состояния уретры в послеоперационном периоде всем кроликам после аутопсии была выполнена ретроградная уретрография (рис. 6). У животных всех трех групп проходимость уретры была сохранена.

 

Рис. 6. Ретроградные уретрограммы: а — просвет уретры сохранен; b — экстравазация контрастного вещества за пределы просвета уретры

Fig. 6. Retrograde urethrograms: a – the lumen of the urethra is preserved; b – the extravasation of the contrast agent outside the lumen of the urethra

 

На рис. 6 продемонстрирована полная проходимость уретры, сужений и дивертикулов не выявлено. У двух кроликов, которым ранее был диагностирован уретро-кожный свищ (группа 2), визуализировалась экстравазация контрастного вещества за пределы просвета уретры (рис. 6, b).

Таким образом, независимо от типа имплантированного для заместительной уретропластики материала, один из самых важных показателей — просвет уретры — был сохранен.

После подготовки макропрепаратов уретры произведена оценка зоны имплантации, результаты которой представлены в табл. 2.

 

Таблица 2 / Table 2 Макроскопическая характеристика зоны имплантации Macroscopic characteristics of the implantation zone
Группа (n)	Сроки аутопсии, мес.	Визуализация зоны имплантации абс. (%)	Отторжение имплантата, абс. (%)	Визуализация имплантата, абс. (%)	Дивертикул, абс. (%)	Сужение, абс. (%)	Свищ, абс. (%)
№ 1 (9)	1	3 (100)	0	0	0	0	0
	2	3 (100)	0	0	0	0	0
	3	2 (66,7)	0	0	0	0	0
№ 2 (15)	1	3 (100)	0	0	0	0	0
	2	3 (100)	0	0	0	0	0
	3	8 (88,9)	0	0	0	0	2 (22,2)
№ 3 (4)	3	4 (100)	0	4 (100)	0	0	0

 

Данные, представленные в табл. 2, демонстрируют, что к 3-му месяцу наблюдения у части животных, которым имплантировали тканеинженерные конструкции происходило полное восстановление ткани уретры. Так, зону имплантации можно было визуализировать лишь у 66,7 и 88,9 % экспериментальных животных групп 1 и 2 соответственно.

При макроскопической оценке зоны имплантации ни в одной группе не было выявлено отторжения имплантата, сужений и дивертикулов уретры (рис. 7).

 

Рис. 7. Макропрепараты уретры кролика: a — визуализация зоны имплантации тканеинженерной конструкции (группа 1); b — зона имплантации не визуализирована (группа 2); c — визуализация буккального графта; d — уретро-кожный свищ (стрелка)

Fig. 7. Macro preparations of the rabbit urethra: a – visualization of the TEC implantation zone (group 1); b – the TEC implantation zone is not visualized (group 2); c – visualization of the buccal graft; d – urethrocutaneous fistula (arrow)

 

В 1-й и 2-й группах через 1 и 2 мес. после хирургического вмешательства у всех кроликов визуализировали зону имплантации (рис. 7, а). Однако через 3 мес. в 1-й и 2-й группах зона имплантации была визуализирована в 66,7 и 88,9 % соответственно (рис. 7, b). Буккальный графт отчетливо визуализировался у всех животных (рис. 7, c). Два ранее описанных уретро-кожных свища выявлены в группе кроликов, которым были имплантированы ТИК на основе ПЛГ + ПЛК с клетками буккального эпителия (рис. 7, d). При статистическом анализе, значимой корреляции между имплантированными материалами и возможностью формирования свищевого хода не выявлено (уровень значимости p точного критерия Фишера при межгрупповом сравнении > 0,05).

С целью выявления присутствия в биоптате клеток, помеченных наночастицами, были приготовлены криосрезы. Производилась оценка SPION-меченных МСК в стенке мочеиспускательного канала на разных сроках после хирургического вмешательства (кролики группы 1). Интактная уретра использовалась в качестве контроля (рис. 8). Ядра окрашивали DAPI (синий) и выявляли с использованием диодного лазера (405 нм). SPIONs визуализировались как красное свечение при отраженном лазерном сканировании (504 нм). Дополнительно препараты были окрашены специфическими антителами (цитокератин AE1/AE3) с вторичными антителами, меченными FITC (зеленый) (рис. 8, уротелий) и антителами против αSMA (рис. 8, мышечный слой).

 

Рис. 8. Конфокальная микроскопия, визуализация наночастиц в слизистом слое на разных сроках после имплантации тканеинженерной конструкции с мезенхимальными стволовыми клетками. Масштабные отрезки соответствуют 100 мкм

Fig. 8. Confocal microscopy, visualization of nanoparticles in the mucous layer at different time after implantation of TECs with MSCs. The scale bars correspond to 100 μm

 

Рис. 9. Конфокальная микроскопия, визуализация наночастиц в слизистом слое через 12 недель после имплантации тканеинженерной конструкции (ТИК) с клетоками буккального эпителия (КБЭ). Масштабные отрезки соответствуют 100 мкм

Fig. 9. Confocal microscopy, visualization of nanoparticles in the mucous layer 12 weeks after implantation of TECs with buccal epithelial cells . The scale bars correspond to 100 μm

 

На рис. 7 показана солокализация меченных наночастицами МСК с окрашенным цитокератином AE1/AE3 уротелием, что доказывает возможность дифференцировки МСК в неоуротелиальные клетки. В мышечном слое обнаружено присутствие меченных наночастицами МСК, однако солокализации их с окрашенными антителами против αSMA гладкомышечными клетками не наблюдалось. Такое расположение меченных клеток свидетельствует, что МСК, входящие в состав ТИК, имплантированной в уретру, принимают участие в формировании мышечного слоя, но не подвергаются дифференцировке в гладкомышечном направлении.

Оценка присутствия в биоптате меченных наночастицами КБЭ у животных 2-й группы проводилась с использованием тех же методик, что и у животных 1-й группы (рис. 9).

Солокализация окрашенных цитокератином AE1/AE3 и содержащих наночастицы КБЭ в группе 2 на сроке 12 нед. также свидетельствует о возможной их дифференцировке в неоуротелиальные клетки. Подобной солокализации в мышечном слое не обнаружено. В биоптатах группы 3 и в интактных тканях клеток, помеченных наночастицами, не обнаружено.

Таким образом, полученные при конфокальной микроскопии данные убедительно показывают не только сохранение жизнеспособности клеток, используемых в составе ТИК на протяжении 3 мес., но и приобретение ими свойств, характерных для уротелия.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенного исследования убедительно показана возможность использования для заместительной уретропластики в экспериментальных условиях тканеинженерных конструкций на основе биополимеров, содержащих аутологичные мезенхимальные стволовые клетки или клетки буккального эпителия. Данные тканеинженерные конструкции можно использовать в качестве альтернативы буккальной уретропластике в эксперименте.

Получение суперпарамагнитных наночастиц оксида железа производилось при поддержке РФФИ (проект № 19-58-55001 Китай_а). Эксперименты in vitro (культивирование клеток, разработка и приготовление тканеинженерной конструкции) выполнялись в рамках государственного задания № 0103-2019-0012.

Об авторах

Анна Андреевна Горелова

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации; Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский государственный университет»

Автор, ответственный за переписку.
Email: gorelovauro@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-7010-7562

аспирант; ассистент кафедры госпитальной хирургии

Россия, Санкт-Петербург

Александр Николаевич Муравьев

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации; Частное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский медико-социальный институт»

Email: urolog5@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-6974-5305

канд. мед. наук, руководитель направления «Урология, гинекология и абдоминальная хирургия»; доцент кафедры хирургических болезней

Россия, Санкт-Петербург

Татьяна Ивановна Виноградова

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: vinogradova@spbniif.ru
ORCID iD: 0000-0002-5234-349X

д-р мед. наук, профессор, главный научный сотрудник

Россия, Санкт-Петербург

Андрей Игоревич Горелов

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский государственный университет»; Санкт-Петербургское государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Городская Покровская больница»

Email: gorelov_a_i@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2858-5317

д-р мед. наук, профессор кафедры госпитальной хирургии; заведующий отделением урологии

Россия, Санкт-Петербург

Наталия Михайловна Юдинцева

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии Российской академии наук

Email: yudintceva@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7357-1571

канд. биол. наук, старший научный сотрудник

Россия, Санкт-Петербург

Юлия Александровна Нащекина

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии Российской академии наук

Email: ulychka@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4371-7445

канд. биол. наук, научный сотрудник

Россия, Санкт-Петербург

Игорь Алексеевич Самусенко

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. А.М. Никифорова» Министерства Российской Федерации по делам гражданской обороны, чрезвычайным ситуациям и ликвидации последствий стихийных бедствий

Email: egors_2000@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0622-3515

канд. мед. наук, врач-патологоанатом

Россия, Санкт-Петербург

Петр Казимирович Яблонский

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации; Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский государственный университет»

Email: glhirurgb2@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4385-9643

д-р мед. наук, профессор, директор; заведующий кафедрой госпитальной хирургии

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы