ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ ИНАКТИВАЦИЯ УРОПАТОГЕННОЙ МИКРОФЛОРЫ В БИОПЛЕНКАХ: ПИЛОТНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Полный текст

            Современная урология характеризуется бурным развитием эндоскопической хирургии. Однако сложная конструкция применяемого оборудования и инструментов, а также человеческий фактор на всех этапах работы являются составляющими риска развития послеоперационных осложнений. К компонентам риска следует отнести необходимость дренирования мочевыделительных органов, растущую неэффективность антибиотикопрофилактики мочевой инфекции вследствие антибиотикорезистентности уропатогенов. Инфекции, вызванные резистентными штаммами, характеризуются более тяжелым течением, чаще требуют госпитализации больного, увеличивают продолжительность его пребывания в стационаре. Все это приводит к увеличению затрат на лечение, ухудшает прогноз для здоровья и жизни пациентов. Появилась категория так называемых «проблемных» микроорганизмов, среди которых особенно часто встречаются штаммы, резистентные к тем или иным, либо нескольким классам антибиотиков [1]. К таким микроорганизмам относятся Staphylococcus spp., Enterococcus spp., P. aeruginosa, ряд штаммов бактерий семейства Enterobacteriaceae [2]. Современное понимание биологии персистенции микроорганизмов позволяет иначе относительно представлений прошлого века рассматривать процессы, лежащие в основе течения инфекции. Установлено, что форма существования микроорганизмов в виде биопленок – это выгодный способ организации условно-патогенных прокариот при колонизации макроорганизма [3]. Одновременно биопленки играют важную роль и в персистенции актуальных патогенов в условиях стационара. Возникает проблема, связанная с микробными биопленками в больничной среде, которая сопряжена с высокими расходами на здравоохранение, длительным пребыванием пациента в стационаре, приводя в дальнейшем к вторичным микробным инфекциям и различным осложнениям. На сегодняшний день достоверно установлена роль биопленок как минимум в 60% случаев всех хронических или рецидивирующих инфекций [4]. Формирование биопленок на различных биотических и абиотических поверхностях может привести к инфицированию большого числа пациентов, а биопленки, сформировавшиеся на различных катетерах, дренажах, эндопротезах и так далее, являются очагом хронического инфекционного процесса в организме больного. Имеются сведения, что около 80% всех патогенных штаммов, инфицирующих человека, связаны с медицинским оборудованием, в том числе и мочевыми катетерами [5]. При этом отмечается, что сложность борьбы с биопленочными инфекциями обусловлена тем, что бактерии в биопленках более устойчивы к антибиотикам, чем планктонные их формы [6]. В настоящей работе применен метод, известный в науке более 100 лет. Метод фотодинамического воздействия основан на применении светочувствительных веществ (фотосенсибилизаторов) и оптического излучения. Первый доклад в области фототоксикологии - о действии фотосенсибилизаторов на микроорганизмы, был сделан немецким исследователем Оскаром Раабом в 1900 году применительно к опухолям кожи, сифилису и туберкулезу. Однако в связи с открытием антибиотиков в начале двадцатого века исследования в области фотодинамики не получили широкого применения в клинической практике, кроме онкологии. В настоящее время фотодинамический эффект используется также в борьбе против широкого спектра бактерий, паразитических простейших, грибов и вирусов [7]. В исследовании M. Tanaka с соавторами (2012) показано, что метод может быть применен для инактивации патогенных микроорганизмов посредством индукции окислительного стресса и за счет фотодинамической терапии - опосредованного усиления иммунного ответа против этих бактерий [8]. Фотодинамический эффект стали успешно внедрять для лечения инфекционных заболеваний в оториноларингологии, стоматологии, гастроэнтерологии и других сферах медицины [9-12].

В 2018 году была продемонстрирована высокая эффективность фотодинамической инактивации Escherichia coli – самого частого возбудителя инфекции в урологии [13]. Обнадеживающие экспериментальные результаты по применению фотодинамического воздействия на патогенную микрофлору, тропную к мочевым путям, были получены в отношении планктонных форм микроорганизмов [14]. При этом проблема разработки новых подходов и методов инактивации микроорганизмов, включая физические методы воздействия с целью разрушения биопленок уропатогенных микроорганизмов в качестве профилактики инфекционно-воспалительных заболеваний в урологии, изучена недостаточно и остается актуальной.

Цель исследования - определить возможность фотодинамической инактивации биопленок, образованных типичными представителями уропатогенной микрофлоры, с использованием антисептического средства с бактериостатическим эффектом метиленового синего, обладающего фотохимическим свойством.

Материалы и методы:

Были использованы культуры уропатогенных бактерий - Staphylococcus aureus и Escherichia coli, выделенные из почечных конкрементов больных при нефрэктомии и нефролитолапаксии, соответственно. Антибиотикорезистентность культур определяли диско-диффузионным методом на среде Мюллера-Хинтон (по EUCAST-2024). Биопленкообразующую способность штаммов оценивали по адгезии к полистироловому планшету по методу O’Toole [15]. Эксперименты по фотодинамической инактивации микрофлоры проводили in vitro на зрелых сформировавшихся биопленках, выращенных по методике, представленной в работе В.С. Кропотова c соавт. [16]. Для получения биопленок штаммы уропатогенных бактерий Staphylococcus aureus и Escherichia coli выращивали на покровных стеклах в чашке Петри с питательным агаром, залитым питательным бульоном, в течение трех суток с ежедневной заменой бульона на свежий. Затем стекла извлекали, отмывали физиологическим раствором, заливали в стерильной чашке Петри 10 мл 0,1% раствора метиленового синего и через 10 минут проводили облучение диодным лазером «Латус-К» (ООО «Актус»), генерирующим излучение с длиной волны 662 нм. Раствор фотоактивного препарата 0,1% метиленового синего имел спектр поглощения оптического излучения в диапазоне 618-668 нм, площадь облучения 78,5 см² (диаметр светового пучка 10 см). Использовали два режима непрерывного облучения: с выходной мощностью 0,45 Вт, дозой 1,5 Дж/см², плотностью мощности 5,5 мВт/см², время воздействия 4,5 минуты; а также с настройками мощности 1,1 Вт; дозой 4,75 Дж/см², плотностью мощности 14,4 мВт/см², время воздействия 5,5 минут.  Облучение выполняли при помощи световода с цилиндрическим диффузным рассеивателем длиной 5 мм на конце (ООО «Полироник»). Облучение биопленок выполняли в непрерывном режиме в пяти (три контрольных, два опытных) вариантах:

контроль 1 - отрицательный – вместо фотосенсибилизатора применяли стерильный физиологический раствор, проводилась имитация воздействия лазерного излучения на биопленку контактом с неработающим излучателем;

контроль 2 - воздействие 0,1% раствора метиленового синего, проводилась имитация воздействия лазерного излучения на биопленку контактом с неработающим излучателем;

контроль 3 - воздействие лазера, вместо фотосенсибилизатора применяли стерильный физиологический раствор, доза лазерного излучения 450 мВт, время облучения 4,5 минуты; плотность потока - 5,5 мВт/ см², доза облучения - 1500 мДж/ см²;

опыт 1: облучение через раствор 0,1% метиленового синего, воздействие лазера (мощность 450 мВт, время облучения 4,5 минуты, плотность потока -5,5 мВт/ см², доза -1500 мДж/ см²);

опыт 2: облучение через раствор 0,1% метиленового синего, воздействие лазера (мощность 1100 мВт, время облучения 5,5 минут, плотность потока -14,4 мВт/ см², доза - 4750 мДж/ см²).

Облучение проводили в двух повторах с интервалом 1 час.

По окончании облучения биопленки на покровных стеклах фиксировали в течение трех минут в 96% этаноле, затем извлекали, трижды отмывали водой и закрепляли на предметном стекле с помощью бесцветного лака. Готовые препараты окрашивали раствором акридинового оранжевого, высушивали в темноте и просматривали с использованием микроскопа «Микмед-6 вариант 11» с люминесцентным модулем (ЛОМО, Россия) при увеличении х100 в иммерсионной системе и фотографировали цифровой камерой, для каждого образца делали не менее десяти фотографий в нескольких полях зрения. В дальнейшем проводили цифровую обработку полученных изображений с применением технологий 3D-моделирования при помощи программного комплекса ImageJ ver. 1.52a.

 

Результаты:

Использованные в работе культуры бактерий отличались полирезистентностью: метициллинорезистентный штамм Staphylococcus aureus был устойчив к аминогликозидам и фторхинолонам, а штамм Escheriсhia coli обладал бета-лактамазами расширенного спектра и был устойчив к фторхинолонам, нитрофурантоину, фосфомицину, триметоприм/сульфаметоксазолу. Обе культуры обладали способностью к биопленкообразованию.

В качестве контроля в экспериментах по фотодинамической инактивации микрофлоры было воздействие на сформированную биопленку только фотосенсибилизатора или только лазера. На полученных 3D-моделях изучаемых биопленок выявлено, что в сравнении с отрицательным контролем (контроль 1) (рис. 1) воздействие одного фотоактивного препарата или лазера на биопленку (контроль 2, контроль 3) не привело к каким-либо существенным изменениям или нарушениям ее структуры (рис. 2, 3)

 

 

S. aureus

E. coli

Рис 1. 3D-топографическая модель биопленки уропатогенных бактерий, вариант – контроль 1 (без фотосенсибилизатора, без облучения).

Fig. 1. 3D topographic model of a biofilm of uropathogenic bacteria, control option 1 (without photosensitizer, without irradiation).

S. aureus

E. coli

Рис 2. 3D-топографическая модель биопленки уропатогенных бактерий, вариант – контроль 2 (с фотоактивным препаратом).

Fig. 2. 3D topographic model of a biofilm of uropathogenic bacteria, control option 2 (with a photoactive drug).

S. aureus

E. coli

Рис 3. 3D-топографическая модель биопленки уропатогенных бактерий, вариант – контроль 3 (с воздействием лазера).

Fig. 3. 3D topographic model of the biofilm of uropathogenic bacteria, option – control 3 (with laser exposure).

Воздействие фотосенсибилизатора и лазерного излучения в режиме 450 мВт привело к частичному разрушению биопленки с появлением в ее структуре каверн и открытых раковин неправильной формы, но приблизительно одинакового размера, что свидетельствует о равномерности воздействия (рис. 4).

 

S. aureus

E. coli

Рис 4. 3D-топографическая модель биопленки уропатогенных бактерий, вариант – опыт 1 (с воздействием фотосенсибилизатора и лазера 1500 мДж/см²).

Fig. 4. 3D topographic model of a biofilm of uropathogenic bacteria, variant – experiment 1 (with exposure to a photosensitizer and a 1500 mJ/cm² laser).

 

Комбинированное воздействие фотоактивного препарата метиленового синего и лазерного излучения в режиме 1100 мВт привело к полной деградации многослойной зрелой биопленки до единичных клеток, лишенных внеклеточного матрикса (рис 5).

S. aureus

E. coli

Рис 5. 3D-топографическая модель биопленки уропатогенных бактерий, вариант – опыт 2 (с воздействием фотосенсибилизатора и лазера 4750 мДж/см²).

Fig. 5. 3D topographic model of a biofilm of uropathogenic bacteria, variant – experiment 2 (with the effect of a photosensitizer and a 4750 mJ/cm² laser).

Таким образом, в характере воздействия лазерного излучения прослеживается зависимость «доза–эффект». Математическая обработка полученных изображений средствами программного комплекса ImageJ ver. 1.52a позволила получить следующие данные:

• воздействие фотоактивного препарата метиленового синего и лазерного излучения в режиме 450 мВт приводило к разрушению 41,9% изначальной структуры биопленки для Staphylococcus aureus и 82,4% - для Escheriсhia coli.
• воздействие фотоактивного раствора метиленового синего и лазерного излучения в режиме 1100 мВт приводило к разрушению 97,7% изначальной структуры биопленки для Staphylococcus aureus и 96,5% - для Escheriсhia coli.

Обсуждение. До настоящего времени основным методом лечения и профилактики инфекционно-воспалительных осложнений для элиминации возбудителя в практической урологии является применение антибактериальных препаратов. Однако в мире отмечается стремительный рост антибиотикорезистентности [17]. Недавно проведенные исследования продемонстрировали бактериурию, характеризующуюся множественной лекарственной устойчивостью (резистентная к трем или более вариантам антибиотиков, рекомендованных как российской, так и американской урологической ассоциациями), что несет существенный риск развития инфекционно-воспалительных осложнений [18]. При этом очень важно принимать во внимание феномен биопленки как адаптивной характеристики микроорганизмов и фактор фенотипического ответа на действие антимикробных препаратов. Таким образом, поиск новых механизмов инактивации бактерий, высвобождающихся в полостную систему мочевыводящих путей в процессе транслокации из кишечника человека, заносов во время полового акта, при эндоскопических урологических манипуляциях, является своевременным и необходимым. Наиболее перспективным путем решения проблемы в складывающихся условиях являются разработка новых и оптимизация существующих физических подходов к лечению и к снижению инфицирования мочевыводящей системы. Альтернативой системной антибиотикотерапии или дополнением к ней в урологической практике может быть фотодинамическое воздействие на микроорганизмы, так как оно обладает выраженным бактерицидным эффектом [19, 20].

Существуют работы, которые свидетельствуют о фотодинамическом эффекте препарата метиленовый синий [21-23]. Особенностью метиленового синего является то, что он является сильнодействующим катионным красителем [24]. Известно, что использование в качестве светочувствительного агента положительно заряженного иона позволяет обеспечить его захват грамотрицательной микробной клеткой с внутриклеточной сорбцией на функциональных структурах и финальную летальную фотосенсибилизацию [25]. В работах отечественных и зарубежных исследователей ранее показано, что именно для катионных фототосенсибилизаторов - производных групп мезо-замещенных порфиринов и производных фталоцианина - фотодинамическая активность проявляется в отношении как грамположительных, так и грамотрицательных микроорганизмов и грибов. В настоящей работе впервые была показана высокая эффективность метода фотодинамической инактивации в отношении биопленочных форм уропатогенных штаммов грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. При этом установлено, что воздействие лазера и фотоактивного препарата на микробные биопленки по отдельности не оказывает на последние значимого деструктивного воздействия и только их сочетанное применение приводит к полной (~96,6%) деградации многослойной зрелой биопленки уропатогенных штаммов, причем данное комбинированное воздействие имеет дозозависимый характер. Подобное масштабное разрушение биопленки сделает даже возможно сохраняющиеся жизнеспособные единичные бактериальные клетки удобной «мишенью» для антибиотикотерапии [26].

Учитывая глобальный характер распространения в мире резистентных и полирезистентных к антимикробным препаратам штаммов патогенных микроорганизмов, продолжается поиск путей преодоления микробной резистентности.  При этом феномен биопленкообразования у патогенных микроорганизмов представляет опасность для пациентов, затрудняя эффективность проводимой химиотерапии и приводя зачастую к росту инфекционной заболеваемости и количеству хронизаций. Таким образом, следует заключить, что выявленная нами бактерицидная активность широкого спектра по отношению к биопленочным формам уропатогенных микроорганизмов будет полезна при эмпирическом лечении инфекционных заболеваний нижних мочевыводящих путей.

Выводы. В работе впервые показана возможность фотодинамической инактивации уропатогенной биопленкообразующей микрофлоры с использованием препарата с фотохимическим эффектом – метиленового синего. Обнадеживающие результаты свидетельствуют о том, что комбинированное воздействие лазерного излучения и метиленового синего может быть использовано как альтернатива или дополнение к системной антибиотикотерапии в урологической практике.

Об авторах

Дмитрий Валерьевич Кряжев

ФБУН "Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной" Роспотребнадзора

Email: micbiol2008@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-0517-8065
SPIN-код: 4399-1375

Д-р биол. наук, ведущий научный сотрудник, зав. лаборатории микробиологии

Россия, 603950, г. Нижний Новгород, ул. Малая Ямская, д.71

Ольга Сергеевна Стрельцова

ФГБОУ ВО "Приволжский исследовательский медицинский университет" Минздрава РФ

Автор, ответственный за переписку.
Email: strelzova_uro@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9097-0267
SPIN-код: 9674-0382

Д-р мед. наук, профессор кафедры урологии им. Е.В. Шахова

Россия, 603950, г. Нижний Новгород, пл. Минина и Пожарского, д. 10/1

Артем Эдуардович Антонян

ФГБОУ ВО "Приволжский исследовательский медицинский университет" Минздрава РФ

Email: 5x5x5@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0001-6494-7277

Аспирант кафедры урологии им. Е.В. Шахова

Россия, 603950, г. Нижний Новгород, пл. Минина и Пожарского, д. 10/1

Галия Бариевна Ермолина

ФБУН "Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной" Роспотребнадзора

Email: labnikif@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-0520-2456
SPIN-код: 1937-0629

Канд. биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории микробиологии

Россия, 603950, г. Нижний Новгород, ул. Малая Ямская, д.71

Елена Вячеславовна Беляева

ФБУН "Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной" Роспотребнадзора

Email: labnikif@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8889-8801
SPIN-код: 7949-3100

Канд. биол. наук. ведущий научный сотрудник лаборатории микробиологии

Россия, 603950, г. Нижний Новгород, ул. Малая Ямская, д.71

Вадим Вячеславович Елагин

ФГБОУ ВО "Приволжский исследовательский медицинский университет" Минздрава РФ

Email: elagin.vadim@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-2676-5661
SPIN-код: 3539-8728
Scopus Author ID: 16515845600

Канд. биол. наук, научный сотрудник научной лаборатории молекулярных биотехнологий НИИ экспериментальной онкологии  
и биомедицинских технологий

Россия, 603950, г. Нижний Новгород, пл. Минина и Пожарского, д. 10/1

Надежда Ивановна Игнатова

ФГБОУ ВО "Приволжский исследовательский медицинский университет" Минздрава РФ

Email: n.i.evteeva@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-4570-9342
SPIN-код: 2808-5521
Scopus Author ID: 55648183300

Канд. биол. наук, доцент кафедры эпидемиологии, микробиологии и доказательной медицины

Россия, 603950, г. Нижний Новгород, пл. Минина и Пожарского, д. 10/1

Валентин Николаевич Крупин

ФГБОУ ВО "Приволжский исследовательский медицинский университет" Минздрава РФ

Email: vn.krupin@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4887-4888
SPIN-код: 8892-7661
Scopus Author ID: SCOPUS

Д-р мед. наук, профессор, зав. кафедрой урологии им. Е.В. Шахова

Россия, 603950, г. Нижний Новгород, пл. Минина и Пожарского, д. 10/1

Список литературы

Дополнительные файлы