MiRNAs as promising biomarkers in cancer

Full Text

Введение

Если ранее рак был связан с острым процессом, приводящим к быстрой смерти, то сегодня благодаря современным представлениям о биологии опухолевых клеток рак рассматривают как хроническое заболевание, при этом разработка терапевтических мишеней, предназначенных для опухолей, регулярно повышает шансы на выживание онкологических больных. Рак человека включает в себя генетические (врожденные или приобретенные) и эпигенетические модификации. Многие супрессорные гены и онкогены были описаны, и сейчас очень активно открываются новые биомаркеры опухолевых процессов [1]. Недавно была идентифицирована новая группа биологических маркеров — микроРНК (miRNA). Эти молекулы специфичны для раковых клеток, в отличие от большинства других биомаркеров, доступных в настоящее время. miRNA, безусловно, будут занимать важное место в клинической биологии как новые диагностические и прогностические маркеры и индикаторы терапевтического ответа, а также как новые терапевтические мишени. В этом обзоре обобщены современные знания о биогенезе, функциях и методах обнаружения miRNA, а также о роли miRNA при раке, в частности колоректальном раке.

Биогенез и функция miRNA

Первым этапом биогенеза miRNA является транскрипция ДНК, которую, как правило, осуществляет РНК-полимераза II — тот же фермент, который транскрибирует «стандартные» белок-кодирующие гены. Более того, очень часто участки, кодирующие miRNA, находятся внутри белок-кодирующих генов. Таким образом, во многих случаях первичным продуктом может выступать обычная мРНК. Однако, как правило, РНК-транскрипт, служащий предшественником miRNA, обозначают как примикроРНК (pri-miRNA).

МикроРНК чаще закодированы в интронах, но экзон-локализованные miRNA также широко распространены. Единственный обязательный критерий — наличие самокомплементарного участка, способного формировать шпильку на транскрибированной РНК. Такая структура pri-miRNA еще в ядре распознается и отрезается от остального транскрипта ферментным комплексом, включающим белки Drosha и Pasha. В качестве вспомогательных компонентов этого комплекса могут присутствовать хеликазы и гетерогенные ядерные рибонуклеопротеины (hnRNP). Менее распространенный путь — процессинг без участия комплекса, то есть за счет механизма сплайсинга. Это происходит в тех случаях, когда область шпильки совпадает с границами вырезаемого интрона. Результатом процессинга pri-miRNA является фрагмент РНК длиной 60–70 нуклеотидов, называемый пре-микроРНК (pre-miRNA). Этот фрагмент содержит в своем составе двухцепочечный участок: две самокомплементарные области, соединенные петлей (terminal loop), и небольшой одноцепочечный участок на 3ʹ-конце. Совокупность этих элементов распознает белок экспортин-5 в комплексе с малой ГТФазой Ran.

После образования комплекса Ran/ГТФ/экспортин-5/pri-miRNA происходит его перенос через поры ядерной мембраны в цитоплазму. Здесь после гидролиза ГТФ-комплекс распадается с высвобождением молекулы РНК [2]. Экспорт из ядра представляет собой важный этап биогенеза miRNA. В цитоплазме структурные элементы pri-miRNA представлены двухцепочечной шпилькой и коротким неспаренным участком на ее конце. pri-miRNA распознает фермент Dicer. Он имеет в своем составе домен PAZ (распознает неспаренный конец шпильки), двухцепочечный РНК-связывающий домен, хеликазный домен и два домена с активностью РНКазы III. После связывания и правильного позиционирования Dicer на молекуле pri-miRNA РНКазные домены вносят два разрыва в РНК возле петли, отрезая ее от шпильки. Образованный двухцепочечный РНК-продукт длиной около 22 нуклеотидов связывается белком Ago2 из семейства Argonaute. Ago2 сам по себе также обладает эндонуклеазной активностью и в случае некоторых miRNA может осуществлять процессинг pri-miRNA без участия Dicer. Из двух цепей РНК, образовавшихся после отщепления петли, только одна, называемая ведущей, остается связанной с Ago2, в то время как другая («пассажирская») диссоциирует от комплекса и, как правило, деградирует. Выбор ведущей цепи определяется структурой самого дуплекса: бoльшую вероятность остаться в комплексе с Ago2 имеет цепь, несущая неспаренный участок на своем 5ʹ-конце. Комплекс Ago2 с единичной цепью РНК, а также с белком GW182 обозначают как miRISC (miRNA-induced silencing complex).

RISC-комплекс в цитоплазме обеспечивает главный эффект miRNA — подавление экспрессии генов, мРНК которых имеет участок, комплементарный последовательности miRNA. Такие гены называются мишенями для данной miRNA. Важнейшим этапом в выборе мишени является распознавание в мРНК последовательности, которая была бы комплементарна со 2-го по 8-й нуклеотиды miRNA. Последние образуют так называемую ключевую последовательность miRNA. Комплементарность между ключевой последовательностью miRNA и последовательностью мРНК обеспечивает посадку RISC-комплекса на мРНК-мишень. Чаще всего такие участки комплементарности в мРНК (сайты связывания miRNA) находятся в 3ʹ-нетранслируемой области, то есть после белок-кодирующей части. Посадка RISC-комплекса на мРНК-мишень может иметь разные последствия, которые зависят в том числе и от степени комплементарности между miRNA и мРНК. В случае полной комплементарности включается РНКазная активность Ago2, который разрезает мРНК в месте посадки. Такая мРНК быстро расщепляется клеточными рибонуклеазами. Прочие механизмы подавления трансляции не требуют полной комплементарности. В частности, рекрутирование белков GW182, CCR4-NOT и PAN2-PAN3 обеспечивает отщепление от мРНК поли-А-сигнала, а привлечение белков DCP1/2 ведет к удалению кэпа [3, 4]. В обоих случаях мРНК становится нефункциональной и в дальнейшем деградирует. Наконец, само по себе нахождение RISC-комплекса на мРНК препятствует посадке и продвижению рибосомы. Следует отметить, что в отдельных случаях miRNA могут быть не репрессорами, а прямыми активаторами трансляции, однако, насколько часто встречается такое «исключение», пока не совсем ясно [5]. Таким образом, miRNA в составе RISC-комплекса «выключают» экспрессию своих генов-мишеней, причем выбор мишеней определяется последовательностью miRNA, точнее наличием комплементарной ей последовательности в мРНК. Одна и та же miRNA может воздействовать на все мРНК, имеющие в своей последовательности соответствующие сайты связывания. Более того, поскольку для посадки RISC-комплекса не требуется полной комплементарности, эти сайты могут иметь слегка различающиеся последовательности. Фактически miRNA являются исключительно универсальным механизмом подавления экспрессии и поэтому задействованы в регуляции широкого спектра клеточных процессов (по разным оценкам, от 30 до 60 % генов человека служат мишенями miRNA) [6, 7].

Методы обнаружения miRNA

Описаны различные методы обнаружения профилей miRNAs в клетках разных типов: микрочипы ДНК, массивы на гранулах, количественная ПЦР в реальном времени. Принцип чипов основан на спаривании основ Ватсона и Крика. Чипы позволяют одновременно обнаруживать несколько сотен miRNA. Панель зондов захвата олигонуклеотидов прикреплена к предметным стеклам, и образец экстракта РНК, обогащенный малыми молекулами РНК, гибридизуется с этими зондами захвата. Поскольку miRNA короткие, может быть трудно нормализовать температуры плавления (ТП) зондов для того же эксперимента, сохраняя при этом достаточные чувствительность и специфичность. Эта проблема была решена за счет использования locked nucleic acids (заблокированных нуклеиновых кислот — LNAs). LNA содержат по меньшей мере один мономер LNA, то есть аналог нуклеиновой кислоты, в котором 2ʹ-атом кислорода и 4ʹ-атом углерода рибозы «заблокированы» [8]. Каждый включенный мономер LNA увеличивает ТП дуплекса нуклеиновой кислоты на 2–10 °C [9]. Таким образом, все зонды одного и того же эксперимента, регулируя количество мономеров LNA, включенных в зонд захвата, можно нормализовать на уровне значения их ТП, несмотря на короткую miRNAs. Таким образом, были обнаружены многочисленные ассоциации с патологиями.

Массивы с использованием шариков, такие как матрицы Luminex® Flex-miR, также позволяют одновременно определять несколько сотен miRNA [10]. Зонды Exiquon с LNA связаны с карбоксилированными полистирольными микросферами, которые содержат различные смеси двух флуоресцентных красителей, что дает возможность идентифицировать каждую микросферу (до 100) с помощью проточного цитометра, потому что каждая микросфера имеет уникальный цвет. Каждая микросфера связана с молекулой LNA, которая специфична для miRNA. С помощью зонда можно дифференцировать miRNA одного и того же семейства. Общую РНК извлекают из образца, биотинилируют, а затем гибридизуют с микросферами. Микросферы промывают, инкубируют с фикоэритрином – стрептавидином и анализируют с применением Luminex®. Анализатор может определять специфическую флуоресценцию микросферы и измерять интенсивность флуоресценции фикоэритрина – стрептавидина, благодаря чему удается выделить miRNA, присутствующую в образце. Этот тест позволяет также получить количественные результаты, если калибровочная кривая проводится с использованием соответствующих калибровочных материалов, таких как синтетические олигонуклеотиды.

Для обнаружения miRNA можно также использовать количественную ПЦР в реальном времени (RT-qPCR). Количественная оценка зрелых miRNA обычно требует обратной транскрипции miRNA с помощью праймера со стволовой петлей [11]. Затем кДНК используют в реакции RT-qPCR. Смесь праймеров и дважды меченного зонда (TaqMan^©) применяют для амплификации и обнаружения желаемой кДНК. Зонд имеет 5ʹ-краситель и 3ʹ-гаситель. Во время ПЦР зонд связывается с этой целевой последовательностью. На стадии удлинения цикла ПЦР краситель высвобождается в силу экзонуклеазной активности Taq-полимеразы; поскольку краситель и гаситель были разделены, происходит флуоресценция красителя. Первичные РНК и/или pre-miRNA могут быть количественно определены теми же методами, но такие анализы требуют точного выбора как праймеров, так и зондов [11].

MiRNA и колоректальный рак

Во всем мире колоректальный рак занимает третье место по распространенности среди всех видов рака у мужчин и второе место у женщин, а также второе место в качестве причины смертности среди онкологических больных. Раннее выявление колоректального рака может привести к снижению показателей заболеваемости и смертности, поскольку используемые в настоящее время методы скрининга позволяют выявить симптомы и признаки, связанные с поздними стадиями заболевания. К сожалению, вероятность благоприятного исхода после появления клинической симптоматики составляет 50 %, в то время как при раннем диагнозе могут быть достигнуты значения, превышающие 80 %. Общепринятыми методами скрининга колоректального рака являются обнаружение скрытой крови в кале, пальцевое исследование прямой кишки, ирригоскопия и колоноскопия. Все перечисленные методы, несмотря на их широкую доступность, не позволяют выявить неопластические изменения в стенках кишечника на ранних этапах развития рака, поэтому поиски более чувствительных методов выявления рака приоритетны для многих исследователей.

Маркеры в кале

В различных исследованиях выявляли ДНК в фекалиях для количественного определения значений различных miRNA. Link et al. обнаружили избыточную экспрессию miRNA-21 и miRNA-106a при колоректальном раке и аденоме толстой кишки по сравнению со здоровыми лицами [12]. Kalimutho et al. выполняли гиперметилирование промотора miRNA-34b/c в кале и показали, что до 75 % пациентов с колоректальным раком имели гиперметилирование их промотора, которое коррелировало со стадией опухоли. Исследователи предложили определять аберрантное метилирование в кале miRNA-34b/c в качестве диагностического маркера. В нормальных условиях miRNA-34b/c подавляет рост опухоли, вызывая апоптоз и останавливая клеточный цикл. Следовательно, аберрантное метилирование miR-34b/c, присутствующего в 97,5 % колоректальных новообразований, позволило бы останавливать пролиферацию клеток [13]. Аналогично была обнаружена избыточная экспрессия miR-20a, miR-21, miR-92, miR-96, miR-106a, miR-203 и miR-326 в кале у пациентов с колоректальным раком, тогда как на поздних стадиях заболевания уровни miR-16, miR-125b, miR-126, miR-143, miR-144, miR-145, miR-320 и miR-484-5p были низкими [14]. Koga et al. установили значения чувствительности (70 и 46 %) и специфичности (81 и 95 %) miRNA-17-92 и miRNA-135 [15]. Хотя различные авторы показывают, что определение miRNA в кале может служить диагностическим маркером при колоректальном раке, необходимы дальнейшие исследования для подтверждения этих новых маркеров. Необходимо также стандартизировать сбор образцов и их обработку [16].

Тканевые маркеры

Было замечено, что почти 300 miRNA изменены в образцах опухолей толстой кишки по сравнению с нормальной слизистой оболочкой [17]. Приблизительно 50 различных miRNA были описаны в клетках колоректального рака. Сверхэкспрессированные miRNA связаны с хромосомными областями, амплифицированными в новообразованиях этого типа, тогда как miRNA, которые экспрессируются в физиологических условиях, связаны с хромосомными областями, которые часто удаляются [16]. В медицинской литературе представлены различные сверхэкспрессированные miRNA в колоректальных новообразованиях: miR-15b, miR-17-5p, miR-19a, miR-20, miR-21, miR-29a, miR- 31, miR-92, miR-96, miR-135b, miR-148a, miR-181b, miR-182, miR-183, miR-191, miR-200b, miR-200c и miR-212. С другой стороны, определены miRNA с пониженной экспрессией: miR-1, miR-9-1, miR-30a-3p, miR-30a-5p, miR-30c, miR-34a, miR-34b, miR-34c, miR-126, miR-129, miR-133a, miR-133b, miR-137, miR-139, miR-143, miR-145, miR-195, miR-342, miR-422a, miR-422b и let-7a-1 [18–20].

Маркеры в периферической крови

В периферической крови miRNA расположены в структурах, называемых экзосомами или микровезикулами. Аберрантную экспрессию miRNA в крови можно использовать в качестве маркера при колоректальном раке [21]. Chen et al. обнаружили существование нескольких miRNA в сыворотке пациентов с колоректальным раком, которых не было у здоровых людей [22]. Ng et al. идентифицировали пять miRNA (miR-17-3p, -92, -95, -135b, -222), которые были сверхэкспрессированы как в сыворотке, так и в опухолевой ткани пациентов с колоректальным раком, и, кроме того, подтвердили, что уровень miR-17-3p и miR-92a в плазме снижался в послеоперационном периоде. Они пришли к выводу, что miR-92 обладает хорошей чувствительностью (89 %) и специфичностью (70 %) при колоректальном раке, поэтому его можно использовать при скрининге этого заболевания [23]. В исследовании, которое включало 100 случаев колоректального рака, 37 аденом толстой кишки и 59 здоровых пациентов, были получены статистически значимые значения для miR-92a и miR-29a с чувствительностью 84 % и специфичностью 71 %. Площадь под кривой для miRNA-92a составила 0,838 (95 % доверительный интервал — 0,775–0,900) при сравнении между здоровыми людьми и пациентами с колоректальным раком. Кроме того, ученые нашли связь между стадией колоректального рака по TNM и уровнем miR-29a [24]. Pu et al. оценивали экспрессию miR-21, miR-221 и miR-222 с помощью qRT-PCR в 103 случаях колоректального рака и у 37 здоровых добровольцев [25]. miRNA оказалась полезной и в отношении распознавания прогрессирующей колоректальной аденомы, что позволяет проводить диагностику заболевания на ранних стадиях: увеличение miR-29a и miR-92a было значительным по сравнению с контролем. В той же линии исследований Kanaan et al., изучая 380 miRNA, обнаружили, что восемь miRNA (miR-532-3p, miR-331, miR-195, miR-17, miR-142-3p, miR-15b, miR-532 и miR-652) были сверхэкспрессированы у пациентов с колоректальными полипами по сравнению со здоровыми людьми [26]. Было подтверждено, что определение miR-141, связанное с выявлением раково-эмбрионального антигена, способствовало бы обнаружению метастазов в печени [27]. Недавно было высказано предположение, что miR-29a можно использовать в качестве маркера для дифференцировки колоректального рака с метастазами в печени [28]. Эти технологические достижения позволили ученым провести разнообразные исследования, направленные на определение различных miRNA. Применение микрочипов показало, что различные miRNA, присутствующие в опухолевых клетках при колоректальном раке, могут служить индикаторами при прогнозировании развития заболевания, улучшения выживаемости после химио- и лучевой терапии [29]. Благодаря ранней диагностике рака ободочной и прямой кишки удается лечить заболевание на начальных стадиях, что делает это новообразование потенциально излечимым, поэтому независимо от метода любая процедура ранней диагностики лучше, чем отсутствие какого-либо скрининга.

Использование miRNA в клинике

Количество доклинических исследований, основанных на определении miRNA, которые показали улучшенный или сходный эффект по сравнению с традиционными методами лечения, все время увеличивается. Использование miRNA может иметь различные технические преимущества.

1. miRNA представляют собой регуляторные элементы, которые могут воздействовать одновременно на несколько мРНК и, следовательно, влиять на разные компоненты одного и того же молекулярного сигнального пути или даже на разные пути. Это сводит к минимуму возможность компенсации другими избыточными путями или другими белками из того же семейства.
2. В отличие от мРНК, зрелые miRNA уже являются непосредственно функциональным продуктом гена и не требуют какого-либо другого типа регуляции транскрипции для осуществления своей функции.
3. Наконец, miRNAs стабильны в замороженной ткани, а также в образцах тканей, фиксированных в формалине и парафине. Это позволяет извлекать их с помощью стандартизированных методов оценки, таких как количественная ПЦР, в любое время во время лечения пациента.

Применение miRNA в клинической практике уже стало реальностью. В области онкологии первой молекулой, вступившей в клиническую фазу, был MIRX34. Это соединение имитирует miR-34, miRNA с функцией подавления опухоли, экспрессия которой снижается во множестве опухолей. Одно из ограничений этих соединений заключается в том, что при введении венозным путем и без какого-либо типа инкапсуляции их распределение сосредоточено в основном в печени, где они очень эффективны, но быстро метаболизируются и выводятся из организма, что ограничивает их терапевтический потенциал в других тканях. Следовательно, для улучшения биораспределения miRNA необходимо расширять исследования: возможно их инкапсулирование в везикулярные наночастицы, изготовленные из биосовместимых материалов, что обеспечит большую стабильность и постоянство в кровотоке.

Заключение

miRNA являются опухолевыми маркерами, вызывающими большой интерес для использования в клинической практике. Биологические роли miRNA обеспечивают реальную физиопатологическую основу для их связи с прогнозом или терапевтического мониторинга опухоли. В этом смысле ингибирование miRNA с помощью «антагомиров» открывает привлекательную терапевтическую перспективу. Однако многие вопросы о применении этих биомаркеров в патологии остаются без ответа. Например, каков уровень экспрессии miRNA в первичных опухолях, вторичных опухолях или метастазах для данного пациента? Исследования в этом направлении могут помочь в будущем в классификации, диагностике и лечении опухолевых патологий.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

Andrian A. Tarmaev

Email: Tarmaevandrian@outlook.com
China, Harbin

Ozal A. Beylerli

Author for correspondence.
Email: obeylerli@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6149-5460
Russian Federation, Ufa

References

Supplementary files