Transcription activity of genes taking part in Colorado potato beetle diapause regulation and its changes under the fipronil impact

Full Text

Введение

Успех исследований генетической основы адаптациогенеза во многом зависит от выбранного объекта, и мы полагаем, что такой моделью может служить широко известный вид насекомого-фитофага — колорадский картофельный жук Leptinotarsa decemlineata Say [1]. Для этого вида характерна не только способность к быстрому формированию устойчивости к инсектицидам, обеспеченная высоким уровнем генетического полиморфизма, но и значительный уровень полифенизма в отношении форм покоя — диапаузных состояний [2, 3]. Для вида установлено наличие сезонных форм покоя, запрограммированных и обусловленных фотопериодической реакцией (проспективная диапауза), а также способность к быстрому развитию диапаузного состояния при резком неожиданном изменении условий, в частности при интенсивном воздействии инсектицидов — конзекутивная диапауза.

Формирование диапаузы у насекомых может проходить с участием нескольких различных механизмов, что выражается как разнообразие экспрессионных профилей генов, ассоциируемых с диапаузными состояниями у разных видов насекомых [3, 4]. Мониторинг экспрессии ряда генов, в число которых входят гены, кодирующие запасные белки (DP1), белки, обеспечивающие устойчивость к отдельным неблагоприятным факторам среды (DAT2, DAT3), позволил установить глубину диапаузных состояний в популяциях колорадского жука на территории Северной Америки [3]. Такие данные дают основание для долгосрочного прогноза развития и динамики численности популяций и, соответственно, для выбора стратегии и тактики контроля численности фитофага.

Наступление глубокого длительного покоя в период зимней гибернации у колорадского жука предваряется периодом репродуктивной диапаузы. Как в природных условиях, так и в лабораторных культурах у взрослых насекомых может сохраняться двигательная активность, у колорадского жука даже отмечено неоднократное спаривание, однако откладка яиц не наступает. Наши исследования [5] показали, что для популяций колорадского жука на территории Южного Урала наступление репродуктивной диапаузы у самок характеризуется остановкой развития ооцитов на стадии превителлогенеза, несмотря на присутствие в семяприемниках запаса спермы.

В лабораторных условиях на протяжении зимнего периода имаго способны формировать диапаузное состояние, при котором прекращается питание и снижается подвижность, т. е. внешние поведенческие реакции соответствуют фазе поддержания диапаузы [2, 3, 6]. Регуляция индукции диапаузы у L. decemlineata осуществляется с преимущественным вкладом фоторецепторной сигнальной системы [2]. Неотъемлемой частью фоторецепторной системы являются рецепторы гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК, GABA). Кодирующие их субъединицы гены экспрессируются в органах зрения и в соответствующих зонах центральной нервной системы у всех животных, в том числе и у насекомых [7]. Можно предположить, что у насекомых, жизнь которых регулируется рядом фотопериодических реакций, экспрессия генов, кодирующих компоненты этих рецепторов, возможна не только в фоторецепторных органах, но и в тканях органов, для которых фотопериодический сигнал определяет переход от одного состояния к другому. Нас интересует, имеет ли отношение ГАМК-сигнальная система к регуляции репродуктивной диапаузы у колорадского жука. Для ответа на этот вопрос мы выясняли, как меняется транскрипционная активность генов, участвующих в регуляции диапаузы — запасных белков DP1и ферритина fer [8], белков, ответственных за устойчивость в период диапаузы (DAT1, DAT2), гена рецептора экдизона, регулирующего репродуктивные процессы (EcR), гена, кодирующего фермент ацетилхолинэстеразу (Ldace-1), активность которой характеризует функциональное состояние нейроэндокринной системы насекомых, и гена rdl, кодирующего субъединицу Rdl — компонент рецептора GABA, участвующего в передаче фотосигнала в тканях гонад и мышцах имаго в период инициации диапаузы (ИД) и в середине января, когда у большинства насекомых определяется фаза поддержания диапаузы (ПД). Кроме того, проведено сравнение между контрольными группами самок и самцов и группами особей, в конце сентября перенесших топикальную обработку сублетальной дозой фипронила, неконкурентного ингибитора ионотропного канала, образованного рецептором GABA типа А, связывающегося с аллостерическим сайтом субъединицы Rdl.

Материалы и методы

Лабораторная культура колорадского жука представлена выборкой (общий объем 450 особей) имаго летней генерации 2014 года, собранной на частной плантации картофеля в августе. Насекомых в лабораторных условиях содержали на свежем корме при естественном свете до конца сентября, после чего их поместили в условия полной темноты. Затем в ходе эксперимента с использованием направленного освещения были выделены группы активных и неактивных самок и самцов. Фотосигнал, использованный как фактор инициации таксиса, позволяет выделить в лабораторной культуре группы активных (подвижных) и неактивных (не реагирующих на направленный свет) особей за короткое время — не более 15 минут при яркости 120 лк. Для них (в трехкратной повторности, по 3 особи из каждой группы) определена транскрипционная активность перечисленных генов (оценка числа копий мРНК для каждого гена) относительно референсного гена домашнего хозяйства rp4 [9] методом количественной ПЦР в режиме реального времени [10]. Повторный аналогичный эксперимент проводили в контрольной группе (36 имаго) и в группе особей (38 имаго), обработанных фипронилом в концентрации 0,0001 % (1 мкл/особь, нанесение микрошприцем МШ-1 в выемку на вентральной стороне проторакса), через 4 месяца, в конце января 2015 года.

Выделение РНК проводили на льду из объединенных для трех имаго мышц торакса или гонад, извлеченных и промытых в растворе Рингера, с использованием набора РНК-Экстран («Синтол») в соответствии с протоколом производителя. Оценку активности ацетилхолинэстеразы (АХЭ) по Эллману в гемолимфе, взятой из спинного сосуда имаго, и определение концентрации белка по методу Бредфорда осуществляли для каждой особи в 5 мкл гемолимфы/100 мкл трис-НСl экстрагирующего буфера рН 7,2 по вышеописанным методикам [11]. Статистическую обработку с применением теста Манна – Уитни для оценки значимости различий данных по экспрессии генов между группами особей и критерия Стьюдента для оценки биохимических данных, а также графическую обработку данных проводили с использованием программ Excel. Для удобства сопоставления экспрессии генов на графических иллюстрациях показано не просто рассчитанное относительно референсного гена число копий мРНК (поскольку оно сильно различается для отдельных генов), а отношение расчетного числа копий мРНК в тканях гонад к аналогичному показателю для тканей мышц либо отношение этих показателей между группами, обработанных фипронилом, и необработанных особей.

Результаты и обсуждение

Детальные исследования группы американских ученых под руководством профессора Джорджа Йокума позволили разработать способ определения фазы диапаузного состояния для особей колорадского жука, успешно апробированный на природных популяциях США [3, 6]. Ими предложена таблица по уровню экспрессии нескольких генов, ассоциированных с диапаузой, — генов пищеварительных протеиназ DG1 и DG2 и нескольких запасных белков (DP1, DAT1, DAT2, DAT3). Наши результаты позволяют расширить представление об изменениях в транскрипционной активности генов диапаузных белков и генов, участвующих в регуляции фотопериодической реакции, на разных этапах диапаузы имаго колорадского жука в лабораторных условиях.

К сожалению, полное сопоставление с данными G. Yocum et al. [3, 6] невозможно, поскольку в работе американских коллег не было проведено разделение по полу, а для выделения РНК были использованы тотальные гомогенаты. Тем не менее наши результаты во многом согласуются с результатами этой группы. Содержание мРНК генов DP1, DAT1, DAT2, DAT3 и Ld EcR в гонадах самок и самцов колорадского жука выше, чем в мышечной ткани, и в фазе инициации диапаузы оно повышается относительно референсного гена rp4 в сравнении с активными в данное время особями. Однако копийность мРНК перечисленных выше генов отличается на порядки, и поэтому в качестве показателя, характеризующего транскрипционную активность диапаузирующих и активных особей и в то же время удобного для его графической демонстрации, мы приняли отношение числа копий мРНК в гонадах и мышцах.

Соотношение уровня содержания мРНК гена DP1 в тканях гонад и мышц насекомых, определенного в начале диапаузы, оказалось выше для самок (рис. 1). Согласно определительной таблице наступления фаз диапаузы [3] неактивные самки уже находились к моменту эксперимента в фазе инициации диапаузы, тогда как в остальных группах этот процесс только начинался (у самок) либо еще не начался (у самцов вне зависимости от двигательной активности).

Гены DAT заметно сильнее экспрессированы в гонадах самок, особенно у неактивных особей, вступивших в период формирования диапаузы. Сравнивая наши результаты с предложенной для мониторинга диапаузного состояния таблицей экспрессии генов [3], мы подтвердили то, что проходящие период подготовки к диапаузе особи находились в фазе ИД независимо от степени их активности. В середине периода покоя в соответствии с данными G. Yocum et al. [3, 6] неактивные особи находились в фазе ПД, тогда как у подвижных особей отмечалась незавершенная фаза ИД. Следует отметить, что во всех случаях разница между самками и самцами очень существенна. По-видимому, именно эти различия лежат в основе многообразия паттернов экспрессии генов, ассоциируемых с диапаузой колорадского жука, выявленного ранее [3, 6]. Сопоставление транскрипционной активности генов, ассоциируемых с наступлением диапаузы (рис. 2, а), в группах обработанных фипронилом особей показало повышенное содержание мРНК, особенно заметное у неактивных имаго. Интересные данные получены для гена EcR, не включенного G. Yocum et al. [3, 6] в число ассоциируемых с диапаузой (рис. 2, b). Тест Манна – Уитни позволил выявить достоверное повышение содержания мРНК гена EcR у обработанных особей. Следует подчеркнуть, что для самок в обеих группах отмечено значимо более высокое содержание мРНК в гонадах. Для самцов различия между тканями не были существенными. Усиленная транскрипционная активность в тканях репродуктивных органов позволяет предположить, что такое изменение — компонент стрессового ответа на воздействие ксенобиотика. Сходные изменения экспрессии гена экдизонового рецептора при токсическом стрессе, вызванном действием ряда ароматических инсектицидов, были обнаружены у представителя отряда двукрылых, Chironomus riparius [12, 13]. Фипронил, нарушающий работу всей нейроэндокринной системы не только у насекомых, но и у позвоночных [14–16], способен в малых дозах давать эффекты повышения плодовитости у комнатной мухи [11]. Такое проявление стресс-реакции позволяет считать выявленные нами изменения дифференциальной экспрессии гена EcR закономерным проявлением токсического стресса.

При сравнении реакции на направленное освещение в сентябре в группе самок доля неактивных особей составляла 40,6 %, а в группе самцов — 50 %. В январе в контрольных группах доля неактивных особей достигла 85 %, тогда как среди обработанных фипронилом особей неактивные особи составляли не более 38 %.

При переходе к глубокой диапаузе на фазе ее поддержания интенсивность метаболизма снижается. Меняется тип газообмена, подавляются процессы обмена, секреции и экскреции, снижается интенсивность работы нейроэндокринной системы, что было показано для многих видов насекомых, в том числе и для колорадского жука [4, 17–19]. Признанным маркером этих процессов является активность фермента ацетилхолинэстеразы — важного компонента холинергических синапсов и одновременно участника метаболизма стероидов [20]. Содержание мРНК гена Ldace-1у диапаузирующих особей колорадского жука из контрольных групп также понижено.

Внешние признаки диапаузы у неактивных имаго после обработки фипронилом сохранились, однако при оценке активности ацетилхолинэстеразы у всех обработанных особей зарегистрирована индукция (рис. 3) с превышением значений для контрольных групп в 1,5–5 раз. Транскрипционная активность гена Ldace-1 у этих имаго также превышала значения для контрольных групп. Эти результаты свидетельствуют о повышенной функциональной активности нейроэндокринной системы, что не соответствует представлению о состоянии глубокой диапаузы.

До последнего времени о рецепторах GABA было известно, что в основном они экспрессируются в нейронах оптических долей мозга насекомых [14] аналогично их роли в ЦНС позвоночных [21], принимая участие в циркадианной регуляции нейронной активности. Экспрессия гена rdl в репродуктивных органах имаго колорадского жука, выявленная нами как повышенное содержание мРНК rdl в гонадах активных особей, еще не вступивших в фазу формирования диапаузы (рис. 4, а), резко снижается при переходе к фазе ИД, в сентябре наступившей у неактивных особей. В фазе поддержания диапаузы у активных самцов в гонадах содержание мРНК rdl снижается более чем в 40 раз, у активных самок — в 12 раз, у неактивных особей это снижение не так заметно. Изменения транскрипционной активности гена rdl у особей, обработанных фипронилом, имеют четко выраженные гендерные особенности (рис. 4, b). У самцов отмечено резкое снижение содержания мРНК, тогда как для самок этого не наблюдалось. Эти данные позволяют нам предположить, что такие различия могут быть обусловлены особенностями гормонального баланса самок и самцов, обусловливающими различия в ответе генома на нарушения работы ионных каналов [22].

Снижение транскрипционной активности гена rdl в ответ на действие фипронила может быть вызвано связыванием субъединицы Rdl с фипронилом, сопровождающимся конформационными изменениями рецептора, в результате чего активируется гипотетический супрессор, ингибирующий транскрипцию гена. Эта реакция характерна не только для фипронила. Показано, что и другие ксенобиотики также связываются с субъединицей рецептора, снижая уровень экспрессии как у насекомых, так и у теплокровных [23]. В частности, установлено, что у Anopheles gambiae эта субъединица является мишенью также для пиретроидов и неоникотиноидов [24], а кроме того, отмечено связывание с этим аллостерическим сайтом как у насекомых, так и у теплокровных барбитуратов и стероидов [14, 25]. Полученные результаты позволяют выдвинуть предположение о том, что фипронил, ингибируя связывание GABA с рецептором, тем самым значительно изменяет регуляторные процессы, сопровождающие развитие диапаузных состояний. Повышенная экспрессия целого ряда генов является, по-видимому, компенсаторной реакцией на действие фипронила. Высокая активность АХЭ в гемолимфе у обработанных особей маркирует чрезмерную активность нейроэндокринной системы, не соответствующую состоянию диапаузы. Повышенная транскрипционная активность генов может привести к чрезмерному расходованию энергетических ресурсов и понизить жизнеспособность в период диапаузы, что подтверждается полученными нами ранее данными [26].

Благодарности. Работа поддержана грантом РФФИ № 15-04-04801-а.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

Yuri M. Nikonorov

Ufa Scientific Center of RAS

Author for correspondence.
Email: nikonorov@anrb.ru
Senior researcher, Laboratory of molecular biology and nanobiotechnology. Institute of Biochemistry and Genetic Russian Federation

Liana A. Syrtlanova

Ufa Scientific Center of RAS

Email: slian4ik@mail.ru
Post-graduate student, Laboratory of physiological genetics. Institute of Biochemistry and Genetics Russian Federation

Konstantin A. Kitaev

FGBU Bashkirskiy referentniy centr Rosselhoznadzora

Email: cordek@ya.ru
Entomologist, Laboratory of phytosanitary research Russian Federation

Galina V. Benkovskaya

Ufa Scientific Center of RAS

Email: bengal2@yandex.ru
Leading researcher, Laboratory of physiological genetics. Institute of Biochemistry and Genetics Russian Federation

References

Supplementary files