New approaches to the estimation of endometrial dysfunction

Full Text

Показатель рождаемости является главным интегральным критерием социально-экономического благополучия государства. Несмотря на положительную динамику демографических показателей в Российской Федерации, проблема бесплодия остается одной из главных аспектов современной гинекологий. В последнее десятилетие наметилась тенденция к поздней реализации репродуктивной функции у женщин, которая становится главным вызовом современному обществу, поскольку доказано, что у женщин с возрастом отмечается высокая встречаемость как соматической, так и гинекологической патологии. Следует отметить, что бесплодие является коморбидным состоянием, когда совокупность нескольких факторов формирует показания для применения методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ).

Общеизвестно, что лидирующее место в структуре гинекологических заболеваний занимают воспалительные заболевания органов малого таза (ВЗОМТ), миома матки и эндометриоз, приводя к опосредованному и/или непосредственному влиянию заболевания на репродуктивную функцию женщины.

Эндометрий является «зеркалом», отражающим патологические процессы в органах малого таза, и частота встречаемости нарушения морфофункционального состояния эндометрия при бесплодии, ассоциированном с ВЗОМТ, наружным генитальным эндометриозом (НГЭ) и миомой матки, довольно высока. Кроме этого в диагностике эндометриальной дисфункции решающее значение приобретают методы оценки патологических изменений. Внедрение иммуногистохимического метода исследования в гинекологическую практику позволило расширить понимание патогенеза заболеваний многих репродуктивных органов.

Результаты наших многолетних исследований показали, что у пациенток с бесплодием, ассоциированным с ВЗОМТ, у пациенток с НГЭ и пациенток с миомой матки имеет место общность морфологических проявлений патологии эндометрия, в том числе нарушение секреторной трансформации, связанное с хроническим воспалительным процессом в эндометрии [1, 2].

Внедрение конфокальной лазерной сканирующей микроскопии в клиническую практику, наряду с общепринятыми методиками, позволит оценить значение половых стероидных гормонов, провоспалительных маркеров, маркеров молекул клеточной адгезии и других биологически активных веществ в патогенезе эндометриальной дисфункции.

Материал и методы исследования

Биоптаты эндометрия были получены от пациенток с бесплодием, ассоциированным с ВЗОМТ, от пациенток с бесплодием, ассоциированным с НГЭ, и пациенток с неэффективными циклами экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Образцы эндометрия обезвоживали в 10 % нейтральном забуференном растворе формалина (рН 7.2), проводка материала осуществлялась с помощью станции автоматической проводки материала и станции заливки Leica (Германия). Изготовленные на микротоме парафиновые срезы толщиной 4–6 мкм помещали на предметные стекла, покрытые пленкой из поли-L-лизина (Sigma, Япония). Инкубацию с первичными антителами к ER (1 : 60, Dako, Дания) производили во влажной камере в течение 30 минут при комнатной температуре, к PR (1 : 50, Dako, Дания) — в течение часа при температуре 37 °C. Далее срезы инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с флуорохромом Alexa Fluor 647 (1 : 1000, Abcam, Англия), при комнатной температуре в течение получаса в темноте. Ядра клеток докрашивали Hoechst 33258 (Sigma, США) в течение 1 минуты. Готовые препараты заключали под покровные стекла в монтирующую среду Dako Fluorescent Mounting Medium (Dako, США). Трехмерную визуализацию срезов образцов осуществляли с помощью конфокального микроскопа FlueView 1000 (Olympus, Япония) при увеличении ×100, ×200, ×400. Для верификации экспрессии исследуемых маркеров использовали лазеры с длиной волны 650, 500 и 405 нм. Срезы толщиной 120 мкм сканировали послойно с шагом 1,5–2 мкм. Реконструкция трехмерного изображения ткани проводилась в программе Imaris (Bitplane, Switzerland).

Результаты исследования и их обсуждение

В последние годы конфокальная лазерная сканирующая микроскопия активно внедряется в клиническую практику в таких областях медицины, как дерматология, гастроэнтерология, офтальмология, гинекология и др. Метод конфокальной микроскопии был разработан для преодоления одного из недостатков обычного светового микроскопа — наличия внефокусных лучей, которые снижают контраст изображения.

Первый патент на конфокальный микроскоп был получен М. Мински в 1957 г. В течение длительного времени конфокальные микроскопы существовали в виде экспериментальных образцов, и только в середине 80-х начался серийный выпуск этих приборов такими фирмами, как BioRad, Zeiss, Leica, Nikon, Olympus. В современных приборах в качестве источников света широко используются лазеры, обладающие высокой интенсивностью и монохроматичностью излучения. Поэтому сейчас такие приборы называют конфокальными лазерными сканирующими микроскопами (КЛСМ). Для управления системой формирования и хранения изображений, а также обработки результатов применяются компьютеры. Основные характеристики КЛСМ подробно описаны в статьях и руководствах по конфокальной лазерной сканирующей микроскопии [3–5].

КЛСМ позволяет получить изображение с объекта толщиной от 1,3 мкм. Благодаря возможности сканирования серии оптических срезов можно провести объемную реконструкцию объекта и получить его трехмерное изображение, не используя трудоемкую методику изготовления и фотографирования серийных гистологических срезов.

Современные конфокальные микроскопы могут работать в мультиспектральном режиме, при котором можно получать изображение одного и того же объекта, окрашенного несколькими красителями в разных спектральных областях. Типичным и наиболее распространенным применением мультиспектрального режима работы КЛСМ является исследование в клетке или ткани колокализации двух и более веществ, например белков.

В наших исследованиях мы изучали локализацию рецепторов эстрогена и прогестерона с помощью непрямого иммуногистохимического метода, визуализация проводилась с использованием вторичных антител, конъюгированных с флуорохромом. Такое исследование позволяет понять, существует ли причинно-следственная связь между выявляемыми белками. Кроме того, в случае существенной толщины среза при анализе с помощью обычного светового микроскопа трудно корректно определить локализацию выявляемых белков в объеме.

Исследования, проведенные в НИИ АГиР им. Д.О. Отта, показали высокую диагностическую значимость данного метода при изучении репаративных процессов в зоне послеоперационного рубца после кесарева сечения, при оценке экспрессии фактора роста нервов в очагах эндометриоидных гетеротопий, а также при изучении эндометриальной дисфункции у пациенток с бесплодием [2, 6, 7].

В статье представлены основные результаты осуществленных нами исследований эндометриальной дисфункции у пациенток с нарушением репродуктивной функции, ассоциированной с ВЗОМТ, у пациенток с бесплодием, ассоциированным с НГЭ, и пациенток с неэффективными циклами ЭКО.

Одним из ключевых механизмов эндометриальной дисфункции является нарушение экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона на фоне хронического воспаления в эндометрии. Однако особая роль в патологии репродуктивной функции принадлежит не самому воспалительному процессу в слизистой оболочке тела матки, а его непосредственному или опосредованному патологическому влиянию на рецепторный статус эндометрия. Именно рецепторный дисбаланс является детерминантой нарушения репродуктивной функции.

Ранее было показано, что наиболее диагностически значимым периодом исследования эндометрия является средняя стадия фазы секреции, поэтому оценка экспрессии рецепторов половых стероидных гормонов при эндометриальной дисфункции была проведена именно в период «окна имплантации». Иммуногистохимическое исследование экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона в зависимости от фазы цикла эндометрия подробно представлено в книге «Молекулярная морфология», в главе, посвященной молекулярным аспектам эндометриальной дисфункции [8].

Нами было показано, что у здоровых пациенток, имеющих нормальный овариальный цикл, с началом средней стадии фазы секреции экспрессия рецепторов ER в железах и строме эндометрия начинает повышаться (до 35–40 %) и носит неравномерный характер распределения. При этом экспрессия рецепторов PR в эпителии желез снижается и может достигать нулевых значений, однако в строме эндометрия экспрессия характеризуется максимальными значениями (100 %) и равномерным распределением рецепторов (рис. 1, а, b).

 

Рис. 1. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия: a — неравномерное распределение экспрессии ЕR (желтая флуоресценция) в строме эндометрия, в железистом компоненте экспрессия снижена до 0; b — равномерное распределение экспрессии PR (зеленая флуоресценция) в строме эндометрия, в железистом компоненте экспрессия снижена до 0; c — снижение экспрессии рецепторов PR при хроническом эндометрите. Для окраски ядер использовали Hoechst: а — синяя флуоресценция; b, c — красная флуоресценция. ×200

 

У пациенток с бесплодием, ассоциированным с ВЗОМТ и с НГЭ на фоне высокой частоты встречаемости хронического эндометрита, отмечается нарушение секреторной трансформации эндометрия в период «окна имплантации». Воспалительные изменения в органах малого таза приводят к нарушению морфофункционального состояния эндометрия и рецепторному дисбалансу (рис. 1, с). На фоне локальной воспалительной реакции в эндометрии происходит нарушение соотношения рецепторов ER и PR в строме эндометрия. Следует отметить, что хронический воспалительный процесс способствует гиперпластической трансформации эндометрия (рис. 2).

 

Рис. 2. Конфокальная лазерная ска нирующая микроскопия: a, b — неравномерное распределение и снижение экспрессии PR (зеленое окрашивание) в эндометрии у пациенток с бесплодием, ассоциированным с НГЭ; c — неравномерное снижение экспрессии PR в зоне фибропластических изменений стромы. 3D-реконструкция. Для окраски ядер использовали Hoechst (красная флуоресценция). ×200

 

Гиперпластическая трансформация эндометрия под влиянием абсолютной и относительной гиперэстрогенемии у пациенток с нарушением репродуктивной функции служит одним из факторов бесплодия. Нарушение синхронизации эстрогена и прогестерона приводит к дисбалансу половых стероидов, что служит причиной гиперпластических и пролиферативных процессов в эндометрии, наличие которых повышает риск возникновения онкологических трансформаций в репродуктивных органах у женщин разных возрастных групп [9, 10].

При гиперплазии эндометрия экспрессия рецепторов ER и PR в гистогенетических структурах эндометрия характеризуется неравномерным распределением и высокими цифрами экспрессии обоих маркеров 80–100 % (рис. 3). Известно, что эстрадиол усиливает синтез собственных рецепторов, рецепторов прогестерона и рецепторов андрогенов. Андрогены могут усиливать синтез собственных рецепторов. Прогестерон не только не усиливает синтез собственных рецепторов, но и подавляет их, также подавляет и синтез рецепторов эстрадиола [11–15].

 

Рис. 3. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. Неравномерное распределение экспрессии PR (зеленая флуоресценция) в строме эндометрия при гиперплазии эндометрия: а — при увеличении ×200, 3D-реконструкция; b, c — при увеличении ×200. Для окраски ядер использовали Hoechst (красная флуоресценция)

 

 

 

Обратной стороной гиперпластической трансформации эндометрия является его гипоплазия (рис. 4). В настоящее время нет единого мнения о причинах гипоплазии эндометрия. В то же время следует отметить, что гипопластический эндометрий или атрофический эндометрий может быть следствием хронического эндометрита, что было подробно описано еще К.П. Улезко-Строгановой в 1926 г. По мнению автора, причинами атрофического эндометрия является расстройство кровоснабжения и рубцующаяся межжелезистая соединительная ткань [16].

 

Рис. 4. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия: a, b — экспрессия рецепторов ЕR (желтая флуо ресценция), PR (зеленая флуоресценция) в железах и стромальном компоненте эндометрия у пациенток с неэффективными циклами ЭКО (гипопластичный эндометрий); с — экспрессия CD34+ в гипопластичном эндометрии. Для окраски ядер использовали Hoechst: a, c — синяя флуоресценция, b — красная флуоресценция. ×100

 

Морфологические особенности гипопластического эндометрия выражаются в недостаточном формировании железистого аппарата эндометрия и изменениях в маточном кровотоке, а также снижении экспрессии фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и патологии ангиогенеза, что крайне негативно влияет на рецептивность эндометрия [17].

В исследовании Е.Ю. Волковой (2014) показано, что формирование «тонкого» эндометрия у женщин с нарушением репродуктивной функции ассоциировано с высокой частотой ранее перенесенных хронических воспалительных заболеваний органов малого таза, невынашиванием беременности и внутриматочными вмешательствами. Показано, что иммуноморфологическая картина «тонкого» эндометрия в большинстве случаев характеризуется остаточными явлениями хронического эндометрита и изменением имплантационных свойств эндометрия [18].

Таким образом, разработка и внедрение новых перспективных методов диагностики морфофункционального состояния эндометрия является одним из важных факторов, способствующих более детальному изучению процессов, детерминирующих имплантацию и формирование плаценты на тканевом, клеточном и молекулярном уровнях. Оценка экспрессии рецепторов половых стероидных гормонов у пациенток с бесплодием, ассоциированным с ВЗОМТ, НГЭ, миомой матки и неэффективными циклами ЭКО, а также с гиперпластическими процессами, служит качественной характеристикой процессов трансформации эндометрия.

Своевременная ранняя диагностика патологических изменений в органах малого таза с учетом объективных данных лабораторных методов исследования, включая КЛСМ, позволит провести адекватную этиопатогенетическую терапию, нацеленную на сохранение и восстановление репродуктивной функции.

В заключение стоит отметить, что, несмотря на несомненные преимущества применения конфокальной микроскопии в клинической практике, в проведении подобных исследований существуют определенные сложности, сопряженные с высокой стоимостью оборудования и его эксплуатации, а также невозможностью повторного исследования в связи с нестабильностью флуорохромов.

About the authors

Edvard K. Aylamazyan

FSBSI “The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott”

Author for correspondence.
Email: iagmail@ott.ru

chief, academician, professor

Russian Federation, 3, Mendeleevskaya line, Saint Petersburg, 199034

Gulrukhsor Kh. Tolibova

FSBSI “The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott”

Email: gulyatolibova@mail.ru

PhD, MD

Russian Federation, 3, Mendeleevskaya line, Saint Petersburg, 199034

Tatyana G. Tral

FSBSI “The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott”

Email: TTG2008@bk.ru

PhD, MD, Pathologist, Head of Pathologist Laboratory, Department of Pathomorphology

Russian Federation, 3, Mendeleevskaya line, Saint Petersburg, 199034

Igor U. Kogan

FSBSI “The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott”

Email: ikogan@mail.ru

PhD, AM RAM, Scientific secretary

Russian Federation, 3, Mendeleevskaya line, Saint Petersburg, 199034

Mariya I. Yarmolinskaya

FSBSI “The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott”

Email: m.yarmolinskaya@gmail.com

professor of Russian Academy of Sciences, leading research assistant of department of endocrinology of reproduction, Doctor of medical sciences, head of center “Diagnostics and treatment of endometriosis”

Russian Federation, 3, Mendeleevskaya line, Saint Petersburg, 199034

Anna A. Tsipurdeeva

FSBSI “The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott”

Email: tsypurdeeva@mail.ru

MD, Head of Department of Operative Gynecology

Russian Federation, 3, Mendeleevskaya line, Saint Petersburg, 199034

Valeriia R. Rodichkina

FSBSI “The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott”

Email: rolerus@mail.ru

junior research scientist of the Pathomorphology department

Russian Federation, 3, Mendeleevskaya line, Saint Petersburg, 199034

Igor M. Kvetnoy

FSBSI “The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott”

Email: igor.kvetnoy@yandex.ru

MD, professor. Head of the Pathomorphology Department

Russian Federation, 3, Mendeleevskaya line, Saint Petersburg, 199034

References

Supplementary files