New approaches to the estimation of endometrial dysfunction

Cover Page

Abstract


Introduction. The application of modern methods for assessing the morphofunctional state of the endometrium to verify and study the expression of sex steroid hormones, proinflammatory markers and markers of angiogenesis using confocal laser scanning microscopy will allow an objective study of the role of studied markers in the pathogenesis of the endometrial dysfunction.

The aim of the study was to evaluate the expression of ER and PR receptors in endometrium in patients with endometrial dysfunction.

Material and methods. Endometrial biopsy specimens obtained with the aid of a pile-biopsy or a scraping from the uterine cavity are used to conduct the method of immunofluorescent confocal laser scanning microscopy. It is possible to use both cryostat material and paraffin blocks to provide the immunohistochemical analysis. Monoclonal antibodies to ER (1 : 60, Dako, Denmark) and PR (1 : 50, Dako, Denmark) are used as primary antibodies, antibodies conjugated with fluorochrome Alexa Fluor 647 (1 : 1000, Abcam, England) are used as secondary antibodies). Hoechst 33258 (Sigma, USA) is used for staining of cell nuclei.

Results. A method of confocal laser scanning microscopy makes it possible to conduct qualitative and quantitative evaluation of the studied markers in different structures of the endometrium.


Показатель рождаемости является главным интегральным критерием социально-экономического благополучия государства. Несмотря на положительную динамику демографических показателей в Российской Федерации, проблема бесплодия остается одной из главных аспектов современной гинекологий. В последнее десятилетие наметилась тенденция к поздней реализации репродуктивной функции у женщин, которая становится главным вызовом современному обществу, поскольку доказано, что у женщин с возрастом отмечается высокая встречаемость как соматической, так и гинекологической патологии. Следует отметить, что бесплодие является коморбидным состоянием, когда совокупность нескольких факторов формирует показания для применения методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ).

Общеизвестно, что лидирующее место в структуре гинекологических заболеваний занимают воспалительные заболевания органов малого таза (ВЗОМТ), миома матки и эндометриоз, приводя к опосредованному и/или непосредственному влиянию заболевания на репродуктивную функцию женщины.

Эндометрий является «зеркалом», отражающим патологические процессы в органах малого таза, и частота встречаемости нарушения морфофункционального состояния эндометрия при бесплодии, ассоциированном с ВЗОМТ, наружным генитальным эндометриозом (НГЭ) и миомой матки, довольно высока. Кроме этого в диагностике эндометриальной дисфункции решающее значение приобретают методы оценки патологических изменений. Внедрение иммуногистохимического метода исследования в гинекологическую практику позволило расширить понимание патогенеза заболеваний многих репродуктивных органов.

Результаты наших многолетних исследований показали, что у пациенток с бесплодием, ассоциированным с ВЗОМТ, у пациенток с НГЭ и пациенток с миомой матки имеет место общность морфологических проявлений патологии эндометрия, в том числе нарушение секреторной трансформации, связанное с хроническим воспалительным процессом в эндометрии [1, 2].

Внедрение конфокальной лазерной сканирующей микроскопии в клиническую практику, наряду с общепринятыми методиками, позволит оценить значение половых стероидных гормонов, провоспалительных маркеров, маркеров молекул клеточной адгезии и других биологически активных веществ в патогенезе эндометриальной дисфункции.

Материал и методы исследования

Биоптаты эндометрия были получены от пациенток с бесплодием, ассоциированным с ВЗОМТ, от пациенток с бесплодием, ассоциированным с НГЭ, и пациенток с неэффективными циклами экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Образцы эндометрия обезвоживали в 10 % нейтральном забуференном растворе формалина (рН 7.2), проводка материала осуществлялась с помощью станции автоматической проводки материала и станции заливки Leica (Германия). Изготовленные на микротоме парафиновые срезы толщиной 4–6 мкм помещали на предметные стекла, покрытые пленкой из поли-L-лизина (Sigma, Япония). Инкубацию с первичными антителами к ER (1 : 60, Dako, Дания) производили во влажной камере в течение 30 минут при комнатной температуре, к PR (1 : 50, Dako, Дания) — в течение часа при температуре 37 °C. Далее срезы инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с флуорохромом Alexa Fluor 647 (1 : 1000, Abcam, Англия), при комнатной температуре в течение получаса в темноте. Ядра клеток докрашивали Hoechst 33258 (Sigma, США) в течение 1 минуты. Готовые препараты заключали под покровные стекла в монтирующую среду Dako Fluorescent Mounting Medium (Dako, США). Трехмерную визуализацию срезов образцов осуществляли с помощью конфокального микроскопа FlueView 1000 (Olympus, Япония) при увеличении ×100, ×200, ×400. Для верификации экспрессии исследуемых маркеров использовали лазеры с длиной волны 650, 500 и 405 нм. Срезы толщиной 120 мкм сканировали послойно с шагом 1,5–2 мкм. Реконструкция трехмерного изображения ткани проводилась в программе Imaris (Bitplane, Switzerland).

Результаты исследования и их обсуждение

В последние годы конфокальная лазерная сканирующая микроскопия активно внедряется в клиническую практику в таких областях медицины, как дерматология, гастроэнтерология, офтальмология, гинекология и др. Метод конфокальной микроскопии был разработан для преодоления одного из недостатков обычного светового микроскопа — наличия внефокусных лучей, которые снижают контраст изображения.

Первый патент на конфокальный микроскоп был получен М. Мински в 1957 г. В течение длительного времени конфокальные микроскопы существовали в виде экспериментальных образцов, и только в середине 80-х начался серийный выпуск этих приборов такими фирмами, как BioRad, Zeiss, Leica, Nikon, Olympus. В современных приборах в качестве источников света широко используются лазеры, обладающие высокой интенсивностью и монохроматичностью излучения. Поэтому сейчас такие приборы называют конфокальными лазерными сканирующими микроскопами (КЛСМ). Для управления системой формирования и хранения изображений, а также обработки результатов применяются компьютеры. Основные характеристики КЛСМ подробно описаны в статьях и руководствах по конфокальной лазерной сканирующей микроскопии [3–5].

КЛСМ позволяет получить изображение с объекта толщиной от 1,3 мкм. Благодаря возможности сканирования серии оптических срезов можно провести объемную реконструкцию объекта и получить его трехмерное изображение, не используя трудоемкую методику изготовления и фотографирования серийных гистологических срезов.

Современные конфокальные микроскопы могут работать в мультиспектральном режиме, при котором можно получать изображение одного и того же объекта, окрашенного несколькими красителями в разных спектральных областях. Типичным и наиболее распространенным применением мультиспектрального режима работы КЛСМ является исследование в клетке или ткани колокализации двух и более веществ, например белков.

В наших исследованиях мы изучали локализацию рецепторов эстрогена и прогестерона с помощью непрямого иммуногистохимического метода, визуализация проводилась с использованием вторичных антител, конъюгированных с флуорохромом. Такое исследование позволяет понять, существует ли причинно-следственная связь между выявляемыми белками. Кроме того, в случае существенной толщины среза при анализе с помощью обычного светового микроскопа трудно корректно определить локализацию выявляемых белков в объеме.

Исследования, проведенные в НИИ АГиР им. Д.О. Отта, показали высокую диагностическую значимость данного метода при изучении репаративных процессов в зоне послеоперационного рубца после кесарева сечения, при оценке экспрессии фактора роста нервов в очагах эндометриоидных гетеротопий, а также при изучении эндометриальной дисфункции у пациенток с бесплодием [2, 6, 7].

В статье представлены основные результаты осуществленных нами исследований эндометриальной дисфункции у пациенток с нарушением репродуктивной функции, ассоциированной с ВЗОМТ, у пациенток с бесплодием, ассоциированным с НГЭ, и пациенток с неэффективными циклами ЭКО.

Одним из ключевых механизмов эндометриальной дисфункции является нарушение экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона на фоне хронического воспаления в эндометрии. Однако особая роль в патологии репродуктивной функции принадлежит не самому воспалительному процессу в слизистой оболочке тела матки, а его непосредственному или опосредованному патологическому влиянию на рецепторный статус эндометрия. Именно рецепторный дисбаланс является детерминантой нарушения репродуктивной функции.

Ранее было показано, что наиболее диагностически значимым периодом исследования эндометрия является средняя стадия фазы секреции, поэтому оценка экспрессии рецепторов половых стероидных гормонов при эндометриальной дисфункции была проведена именно в период «окна имплантации». Иммуногистохимическое исследование экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона в зависимости от фазы цикла эндометрия подробно представлено в книге «Молекулярная морфология», в главе, посвященной молекулярным аспектам эндометриальной дисфункции [8].

Нами было показано, что у здоровых пациенток, имеющих нормальный овариальный цикл, с началом средней стадии фазы секреции экспрессия рецепторов ER в железах и строме эндометрия начинает повышаться (до 35–40 %) и носит неравномерный характер распределения. При этом экспрессия рецепторов PR в эпителии желез снижается и может достигать нулевых значений, однако в строме эндометрия экспрессия характеризуется максимальными значениями (100 %) и равномерным распределением рецепторов (рис. 1, а, b).

 

Рис. 1. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия: a — неравномерное распределение экспрессии ЕR (желтая флуоресценция) в строме эндометрия, в железистом компоненте экспрессия снижена до 0; b — равномерное распределение экспрессии PR (зеленая флуоресценция) в строме эндометрия, в железистом компоненте экспрессия снижена до 0; c — снижение экспрессии рецепторов PR при хроническом эндометрите. Для окраски ядер использовали Hoechst: а — синяя флуоресценция; b, c — красная флуоресценция. ×200

 

У пациенток с бесплодием, ассоциированным с ВЗОМТ и с НГЭ на фоне высокой частоты встречаемости хронического эндометрита, отмечается нарушение секреторной трансформации эндометрия в период «окна имплантации». Воспалительные изменения в органах малого таза приводят к нарушению морфофункционального состояния эндометрия и рецепторному дисбалансу (рис. 1, с). На фоне локальной воспалительной реакции в эндометрии происходит нарушение соотношения рецепторов ER и PR в строме эндометрия. Следует отметить, что хронический воспалительный процесс способствует гиперпластической трансформации эндометрия (рис. 2).

 

Рис. 2. Конфокальная лазерная ска нирующая микроскопия: a, b — неравномерное распределение и снижение экспрессии PR (зеленое окрашивание) в эндометрии у пациенток с бесплодием, ассоциированным с НГЭ; c — неравномерное снижение экспрессии PR в зоне фибропластических изменений стромы. 3D-реконструкция. Для окраски ядер использовали Hoechst (красная флуоресценция). ×200

 

Гиперпластическая трансформация эндометрия под влиянием абсолютной и относительной гиперэстрогенемии у пациенток с нарушением репродуктивной функции служит одним из факторов бесплодия. Нарушение синхронизации эстрогена и прогестерона приводит к дисбалансу половых стероидов, что служит причиной гиперпластических и пролиферативных процессов в эндометрии, наличие которых повышает риск возникновения онкологических трансформаций в репродуктивных органах у женщин разных возрастных групп [9, 10].

При гиперплазии эндометрия экспрессия рецепторов ER и PR в гистогенетических структурах эндометрия характеризуется неравномерным распределением и высокими цифрами экспрессии обоих маркеров 80–100 % (рис. 3). Известно, что эстрадиол усиливает синтез собственных рецепторов, рецепторов прогестерона и рецепторов андрогенов. Андрогены могут усиливать синтез собственных рецепторов. Прогестерон не только не усиливает синтез собственных рецепторов, но и подавляет их, также подавляет и синтез рецепторов эстрадиола [11–15].

 

Рис. 3. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. Неравномерное распределение экспрессии PR (зеленая флуоресценция) в строме эндометрия при гиперплазии эндометрия: а — при увеличении ×200, 3D-реконструкция; b, c — при увеличении ×200. Для окраски ядер использовали Hoechst (красная флуоресценция)

 

 

 

Обратной стороной гиперпластической трансформации эндометрия является его гипоплазия (рис. 4). В настоящее время нет единого мнения о причинах гипоплазии эндометрия. В то же время следует отметить, что гипопластический эндометрий или атрофический эндометрий может быть следствием хронического эндометрита, что было подробно описано еще К.П. Улезко-Строгановой в 1926 г. По мнению автора, причинами атрофического эндометрия является расстройство кровоснабжения и рубцующаяся межжелезистая соединительная ткань [16].

 

Рис. 4. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия: a, b — экспрессия рецепторов ЕR (желтая флуо ресценция), PR (зеленая флуоресценция) в железах и стромальном компоненте эндометрия у пациенток с неэффективными циклами ЭКО (гипопластичный эндометрий); с — экспрессия CD34+ в гипопластичном эндометрии. Для окраски ядер использовали Hoechst: a, c — синяя флуоресценция, b — красная флуоресценция. ×100

 

Морфологические особенности гипопластического эндометрия выражаются в недостаточном формировании железистого аппарата эндометрия и изменениях в маточном кровотоке, а также снижении экспрессии фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и патологии ангиогенеза, что крайне негативно влияет на рецептивность эндометрия [17].

В исследовании Е.Ю. Волковой (2014) показано, что формирование «тонкого» эндометрия у женщин с нарушением репродуктивной функции ассоциировано с высокой частотой ранее перенесенных хронических воспалительных заболеваний органов малого таза, невынашиванием беременности и внутриматочными вмешательствами. Показано, что иммуноморфологическая картина «тонкого» эндометрия в большинстве случаев характеризуется остаточными явлениями хронического эндометрита и изменением имплантационных свойств эндометрия [18].

Таким образом, разработка и внедрение новых перспективных методов диагностики морфофункционального состояния эндометрия является одним из важных факторов, способствующих более детальному изучению процессов, детерминирующих имплантацию и формирование плаценты на тканевом, клеточном и молекулярном уровнях. Оценка экспрессии рецепторов половых стероидных гормонов у пациенток с бесплодием, ассоциированным с ВЗОМТ, НГЭ, миомой матки и неэффективными циклами ЭКО, а также с гиперпластическими процессами, служит качественной характеристикой процессов трансформации эндометрия.

Своевременная ранняя диагностика патологических изменений в органах малого таза с учетом объективных данных лабораторных методов исследования, включая КЛСМ, позволит провести адекватную этиопатогенетическую терапию, нацеленную на сохранение и восстановление репродуктивной функции.

В заключение стоит отметить, что, несмотря на несомненные преимущества применения конфокальной микроскопии в клинической практике, в проведении подобных исследований существуют определенные сложности, сопряженные с высокой стоимостью оборудования и его эксплуатации, а также невозможностью повторного исследования в связи с нестабильностью флуорохромов.

Edvard K. Aylamazyan

FSBSI “The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott”

Author for correspondence.
Email: iagmail@ott.ru

Russian Federation, 3, Mendeleevskaya line, Saint Petersburg, 199034

chief, academician, professor

Gulrukhsor Kh. Tolibova

FSBSI “The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott”

Email: gulyatolibova@mail.ru

Russian Federation, 3, Mendeleevskaya line, Saint Petersburg, 199034

PhD, MD

Tatyana G. Tral

FSBSI “The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott”

Email: TTG2008@bk.ru

Russian Federation, 3, Mendeleevskaya line, Saint Petersburg, 199034

PhD, MD, Pathologist, Head of Pathologist Laboratory, Department of Pathomorphology

Igor U. Kogan

FSBSI “The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott”

Email: ikogan@mail.ru

Russian Federation, 3, Mendeleevskaya line, Saint Petersburg, 199034

PhD, AM RAM, Scientific secretary

Mariya I. Yarmolinskaya

FSBSI “The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott”

Email: m.yarmolinskaya@gmail.com

Russian Federation, 3, Mendeleevskaya line, Saint Petersburg, 199034

professor of Russian Academy of Sciences, leading research assistant of department of endocrinology of reproduction, Doctor of medical sciences, head of center “Diagnostics and treatment of endometriosis”

Anna A. Tsipurdeeva

FSBSI “The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott”

Email: tsypurdeeva@mail.ru

Russian Federation, 3, Mendeleevskaya line, Saint Petersburg, 199034

MD, Head of Department of Operative Gynecology

Valeriia R. Rodichkina

FSBSI “The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott”

Email: rolerus@mail.ru

Russian Federation, 3, Mendeleevskaya line, Saint Petersburg, 199034

junior research scientist of the Pathomorphology department

Igor M. Kvetnoy

FSBSI “The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott”

Email: igor.kvetnoy@yandex.ru

Russian Federation, 3, Mendeleevskaya line, Saint Petersburg, 199034

MD, professor. Head of the Pathomorphology Department

  1. Айламазян Э.К., Толибова Г.Х., Траль Т.Г., и др. Клинико-морфологические детерминанты бесплодия, ассоциированного с воспалительными заболеваниями органов малого таза // Журнал акушерства и женских болезней. – 2015. – № 6. – С. 17–25. [Ailamazyan EK, Tolibova GKh, Tral TG, et al. Clinical and morphological determinants of infertility associated with inflammatory diseases of the pelvic organs. Journal of Obstetrics and Women’s Diseases. 2015;(6):17-25. (In Russ.)]
  2. Толибова Г.Х. Сравнительная оценка морфологических критериев эндометриальной дисфункции у пациенток с первичным бесплодием, ассоциированным с воспалительными заболеваниями малого таза, наружным генитальным эндометриозом и миомой матки // Журнал акушерства и женских болезней. – 2016. – № 6. – C. 52–60. [Tolibovа GKh. Comparative evaluation of morphological criteria of endometrial dysfunction in patients with infertility associated with pelvic inflammatory disease, external genital endometriosis and uterine myoma. Journal ofObstetrics and Women’s Diseases. 2016;(6):52-60. (In Russ.)]. doi: 10.17816/JOWD65652-60.
  3. Штейн Г.И. Руководство по конфокальной микроскопии. – СПб.: ИНЦ РАН, 2007. [Shtejn GI. Rukovodstvo po konfokal’noj mikroskopii. Saint Petersburg: INC RAN; 2007. (In Russ.)]
  4. Лукашева Н.Н., Ткаченко С.Б., Потекаев Н.Н., и др. Прижизненная отражательная конфокальная лазерная сканирующая микроскопия: история создания, принцип работы, возможности применения в дерматологии // Клиническая дерматология и венерология. – 2008. – № 5. – C. 10–15. [Lukasheva NN, Tkachenko SB, Potekaev NN, et al. Prizhiznennaja otrazhatel’naja konfokal’naja lazernaja skanirujushhaja mikroskopija: istorija sozdanija, princip raboty, vozmozhnosti primenenija v dermatologii. Klinicheskaja dermatologija i venerologija. 2008;(5):10-5. (In Russ.)]
  5. Пальцев М.А., Кветной И.М., Полякова В.О., и др. Нейроиммуноэндокринные межклеточные взаимодействия в норме и при патологии. Образцы конфокальной микроскопии: Атлас. – М.: ШИКО, 2015. – 160 с. [Pal’cev MA, Kvetnoj IM, Poljakova VO, et al. Nejroimmunojendokrinnye mezhkletochnye vzaimodejstvija v norme i pri patologii. Obrazcy konfokal’noj mikroskopii: Atlas. Moscow: ShIKO; 2015. 160 p. (In Russ.)]
  6. Андреева В.Ю. Оптимизация репаративных процессов в миометрии после кесарева сечения (клинико-экспериментальное исследование): aвтореф. дис. … канд. мед. наук. – СПб., 2016. [Andreeva VJu. Optimizacija reparativnyh processov v miometrii posle kesareva sechenija (kliniko-jeksperimental’noe issledovanie). [dissertation] Saint Petersburg; 2016. (In Russ.)]
  7. Ефименко Т.О. Клинико-лабораторные детерминанты эффективности комбинированного лечения хронической тазовой боли при различных формах генитального эндометриоза: aвтореф. дис. … канд. мед. наук. – СПб., 2016. [Efimenko TO. Kliniko-laboratornye determinanty jeffektivnosti kombinirovannogo lechenija hronicheskoj tazovoj boli pri razlichnyh formah genital’nogo jendometrioza. [dissertation] Saint Petersburg; 2016. (In Russ.)]
  8. Толибова Г.Х., Траль Т.Г., Коган И.Ю., и др. Молекулярные аспекты эндометриальной дисфункции. Методологические и прикладные аспекты нейроиммуноэндокринологии. Молекулярная мор фо логия. – М.: ШИКО, 2015. – C. 239–252. [Tolibova GH, Tral’ TG, Kogan IJu, et al. Molekuljarnye aspekty jendometrial’noj disfunkcii. Metodologicheskie i prikladnye aspekty nejroimmunojendokrinologii. Molekuljarnaja morfologija. Moscow: ShIKO; 2015. P. 239-252. (In Russ.)]
  9. Шешукова Н.А., Макаров О.И., Фомина М.Н. Гиперпластические процессы эндометрия: этиопатогенез, клиника, диагностика, лечение // Акушерство и гинекология. – 2011. – № 4. – C.16–21. [Sheshukova NA, Makarov OI, Fomina MN. Giperplasticheskie processy jendometrija: jetio patogenez, klinika, diagnostika, lechenie. Obstetrics and Gynecology. 2011;(4):16-21. (In Russ.)]
  10. Craig AM, Hou JY, Goldberg GL, Kuo D. Angiogenesis and its modulation in the pathophysiology and treatment of endometrial carcinoma. Oncol Rev. 2011;5:43-48. doi: 10.4081/oncol.2011.43.
  11. Bouchard P, Marraoui J, Massai MR, et al. Immunocytochemical localization of oestradiol and progesterone receptors in human endometrium: a tool to assess endometrial maturation. Baillieres Clin Obstet Gynaecol. 1991;5(1):107-15. doi: 10.1016/S0950-3552(05)80073-2.
  12. Fung HY, Wong YL, Wong FW, Rogers MS. Study of oestrogen and progesterone receptors in normal human endometrium during the menstrual cycle by immunocytochemical analysis. Gynecol Obstet Invest. 1994;38(3):186-90. doi: 10.1159/000292476.
  13. Snijders MP, de Goeij AF, Debets-Te Baerts MJ, et al. Immunocytochemical analysis of oestrogen receptors and progesterone receptors in the human uterus throughout the menstrual cycle and after the menopause. J Reprod Fertil. 1992;94(2):363-71. doi: 10.1530/jrf.0.0940363.
  14. Mertens HJ, Heineman MJ, Theunissen PH, et al. Androgen, estrogen and progesterone receptor expression in the human uterus during the menstrual cycle. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2001;98(1):58-65. doi: 10.1016/S0301-2115(00)00554-6.
  15. Смирнов А.Н. Молекулярная биология прогестерона // Рос. хим. журн. – 2005. – № 1. – C. 64–74.[Smirnov AN. Molekuljarnaja biologija progesterona. Ros him zhurn. 2005;(1):64-74. (In Russ.)]
  16. Улезко-Строганова К.П. Микроскопическая диагностика в гинекологии. – Л.: Практическая медицина, 1926. [Ulezko-Stroganova KP. Mikroskopicheskaja diagnostika v ginekologii. Leningrad: Prakticheskaja medicina; 1926. (In Russ.)]
  17. Miwa I, Tamura H, Takasaki A, et al. Pathophysiologic features of “thin” endometrium. Fertil Steril. 2009;91(4): 998-1004. doi: 10.1016/j.fertnstert.2008.01.029.
  18. Волкова Е.Ю. Прегравидарная подготовка женщин с нарушением репродуктивной функции и «тонким» эндометрием: автореф. дис. … канд. мед. наук. – М., 2014. [Volkova EJu. Pregravidarnaja podgotovka zhenshhin s narusheniem reproduktivnoj funkcii i “tonkim” jendometriem. [dissertation] Moscow; 2014. (In Russ.)]

Supplementary files

There are no supplementary files to display.

Views

Abstract - 313

PDF (Russian) - 278

Cited-By


PlumX


Copyright (c) 2017 Aylamazyan E.K., Tolibova G.K., Tral T.G., Kogan I.U., Yarmolinskaya M.I., Tsipurdeeva A.A., Rodichkina V.R., Kvetnoy I.M.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies