Nanovesicular therapy. Evolution of the conception, the current state and prospectives. Communication 1. Nanovesicular therapy of acute kidney injury

Full Text

Цель настоящей публикации - сжато охарактеризовать эволюцию концепции нановезикулярной терапии, современное состояние метода и его перспективы. Это первое сообщение из серии о нановезикулярной терапии, конкретизирующее данный метод на пример лечения острого повреждения почек[1] (ОПП). Проблема лечения ОПП выходит далеко за пределы собственно нефрологической тематики. Новейшие обзоры (2017) показывают, что ОПП остается серьезным вызовом для многих клинических дисциплин. В качестве примера укажем на пациентов в послеоперационном периоде [24], после введения контрастных препаратов в имиджинговых исследованиях [22], в педиатрии [7], акушерстве [25] и др. В нашей статье, посвященной клеточным технологиям в нефрологии, опубликованной в сентябрьском номере за 2015 г. «Военно-медицинского журнала» [1], отмечалось, что несмотря на полтора десятилетия напряженных исследований и огромные финансовые затраты, применение клеточных технологий для лечения ОПП так и не смогло выйти за пределы доклинической фазы. Из трех клинических исследований в этой области, два американских, под номерами NCT00733876 [2] (фаза 1) и NCT01602328 (фаза 2), закончились констатацией отсутствия клинического эффекта метода, третье, итальянское, под номером NCT01275612, на момент публикации статьи еще продолжалось. Завершить его планировалось в марте 2016 г., однако спустя более полутора лет, по состоянию на 6 декабря 2017 г., данное исследование позиционируется в регистре как незавершенное. В связи с этим далее в той же статье мы указывали на существование разработок некоторых новых технологий в лечении ОПП на основе уже субклеточных структур, введение которых не связано с опасностями, свойственными введению живых, способных к размножению клеток. Ниже в настоящей публикации будет детально охарактеризована одна из таких технологий, связанная с использованием внеклеточных пузырьков[3] (ВП). История вопроса Первое описание ВП датируется 1983 г. и принадлежит сотрудникам отдела биохимии Университета МакГилл, Монреаль, Канада, Бин-Тао Пан (Bin-Tao Pan) и Роуз Джонстоун (Rose M. Johnstone), исследовавшим процесс экстернализации трансферинового рецептора из созревающих ретикулоцитов овцы [23]. За истекшую четверть века проблема ВП подверглась интенсивному изучению. К настоящему времени накоплен значительный объем информации по данной теме с экспоненциальным ростом числа публикаций. По состоянию на 6 декабря 2017 г. в базе данных Национальной медицинской библиотеки США[4], известной под названием Medline и представляющей глобальный массив медико-биологических публикаций, под рубрикой[5] «Микрочастицы клеточного происхождения»[6] уже насчитывается 2151(!) библиографическая запись [6]. В 2012 г. для координации исследований в данной области биологии и медицины в Швеции было основано Международное общество исследования внеклеточных пузырьков[7] (МОИВП). Организация проводит ежегодные конференции[8] и выпускает специализированное издание - Журнал внеклеточных пузырьков[9]. Первый опыт использования ВП in vivo для лечения ОПП в эксперименте у мышей представлен в статье большой группы итальянских и немецких исследователей, опубликованной в 2009 г. [15]. В сентябре 2014 г. в уже упоминавшемся международном регистре клинических испытаний ClinicalTrials.gov под номером NCT02289040 было заявлено первое клиническое исследование применения ВП для лечения ОПП (подробнее см. ниже). Терминология Используемый в данной статье термин ВП настоятельно рекомендуется МОИВП в целях унификации номенклатуры [26]. Следует иметь в виду, что в мировой литературе ВП еще повсеместно продолжают описываться и под другими названиями, например микровезикулы (Microvesicles), микрочастицы( Microparticles), экзосомы (Exosomes) и т. д., 26 (!) из таких «синонимов» представлены в Fig. 1 [26, p. 2]. Определение, происхождение, классификация и строение ВП В самом общем виде ВП определяются как ограниченные оболочкой внеклеточные образования, продуцируемые живыми клетками [2]. В связи с этим к ВП не следует относить безоболочечные внеклеточные образования типа макромолекул и макромолекулярных агрегатов, например, иммунные комплексы, или наоборот, покрытые оболочкой, но строго внутриклеточные образования, типа митохондрий, попадающие во внеклеточное пространство лишь в результате разрушения клетки. Естественно, не относят к ВП и цельноклеточные образования типа зрелых эритроцитов, являющихся конечным результатом развития клеток, а не секретируемыми последними. Также к ВП не следует причислять искусственные емкости наноразмера, например липосомы. ВП вырабатываются и выделяются в среду обитания клетками не только эукариот (растения, грибы и животные), но и прокариот (бактерии). ВП- содержащие среды могут быть представлены не только биологическими жидкостями, такими как кровь, моча, слюна и др., но и естественными неорганическими и искусственными жидкостями. Например показано, что свободно живущие в морской воде цианобактерии Prochlorococcus выделяют в нее ВП, которые они используют для фиксации растворенного в воде углекислого газа, азота, фосфора, горизонтального переноса генетического материала, а также как приманки для защиты от инфицирования фагами [5]. Как пример антропогенной среды, содержащей ВП, можно привести пиво. В нефильтрованном пиве современными методами удается обнаружить высокую концентрацию ВП, продуцируемых пивными дрожжами [29]. К настоящему времени устоявшейся классификации ВП еще нет. Условно ВП подразделяются на три вида: экзосомы, энтосомы (Ectosomes) и апоптотические тела (Apoptotic bodies) [12]. Экзосомы генерируются в специализированных внутриклеточных структурах под названием мультивезикулярные тела (Multivesicular bodies), которые затем выделяют наработанные в них пузырьки за пределы клетки посредством экзоцитоза (наглядно процесс представлен на Fig. 3) [12, p. 6]. Энтосомы формируются вблизи клеточной мембраны и выделяются путем почкования от нее, см. Fig. 4 [12, p. 8]. Апоптотические тела являются конечными продуктами программированной гибели клетки (апоптоза), Fig. 1 [12, p. 2]. Оболочка ВП по своему строению и химическому составу аналогична клеточной мембране. ВП обладают исключительно богатой «начинкой», в которой представлены различные фрагменты ДНК, причем не только ядерной, но и митохондриальной, РНК, как матричной (информационной), так и микроРНК, внутриклеточные белки, липиды, полисахариды и др. Для иллюстрации укажем, что к настоящему времени только белков в ВП идентифицировано более 35 тыс. (!) видов [31]. Методы обнаружения и изучения ВП Тот факт, что ВП, несмотря на их повсеместное присутствие, были идентифицированы как сущность sui generis сравнительно недавно, объясняется их малыми размерами. Все виды ВП не превышают 1 мкм, а многие находятся в нанодиапазоне, т. е. менее 100 нм. Поэтому большинство современных методов морфологического анализа, разработанных для изучения клеток, ВП просто игнорировали, относя их к т. н. клеточному мусору (Cellular dust or garbage) [9]. Некоторые современные методы, такие как молекулярно-ситовая/эксклюзионная/гель-фильтрационная хроматография[10], настраиваемый резистивный импульсный сенсоринг[11], траекторный анализ наночастиц[12] и ряд других, открывают новые возможности в изучении ВП [26]. Получение и стандартизация ВП В связи с большими надеждами, возлагаемыми на лечебные эффекты ВП, в настоящее время развернуты широкие исследования методов получения препаратов ВП, пригодных для клинических испытаний [14]. Существенным шагом в этом направлении можно считать опубликованный в апрельском номере за 2017 г. международного журнала Цитотерапия[13] протокол получения ВП из мезенхимального ростка клеток стромы костного мозга[14] человека, подготовленный большим коллективом австрийских ученых [3]. Документу присвоен уровень стандарта Добротная практика производства (Good Manufacturing Practice). Доклинические исследования возможности использования ВП для лечения ОПП Как уже отмечалось выше, первая публикация о применении ВП для лечения ОПП in vivo датирована 2009 г. [15]. В эксперименте использовались ВП, полученные из мезенхимальных стволовых клеток (МСК) костного мозга человека. Опыт проводился на мышах. ОПП индуцировалось внутримышечной инъекцией глицерина, вызывавшей острый рабдомиолиз с последующими токсическим и ишемическим тубулярным некрозом. Далее экспериментальный контингент мышей (с ОПП) подразделялся на 7 групп: 1) ОПП, 2) ОПП+ВП, внутривенно, 3) ОПП+ВП из МСК, обработанных рибонуклеазой, 4) ОПП+МСК, 5) ОПП+ВП из фибробластов (контроль специфичности ВП), 6) ОПП+ВП из МСК, обработанных гиалуроновой кислотой, 7) ОПП+ВП из МСК, обработанных трипсином. Кроме того, выделялись еще две контрольные группы животных: 1) Интактные (без ОПП) мыши+физиологический раствор внутривенно и 2) Интактные мыши+ВП. Результаты: положительная динамика вплоть до полного выздоровления, подтвержденная морфологически и биохимически (нормализация уровня остаточного азота и креатинина сыворотки крови) наблюдалась только во 2-й и 4-й экспериментальных группах. Эффективность ВП не отличалась от эффективности МСК. ВП накапливались только в клетках мышей с ОПП. Механизм терапевтического воздействия ВП связан с угнетением апоптоза и стимуляцией пролиферации, осуществляемыми человеческой РНК, содержащейся в МСК и полученных из них ВП. Отсутствие эффекта от ВП, обработанных трипсином, свидетельствует о том, что в проникновении РНК из пузырька внутрь клетки критическую роль играют адгезивные молекулы пузырьковой оболочки, что свидетельствует о том, что для оказания лечебного эффекта ВП должны быть интактными. Двумя годами позже, в 2011 г., той же исследовательской ассоциацией была продемонстрирована эффективность ВП в лечении ОПП на крысиной модели ишемического повреждения почки в результате 45-минутной окклюзии почечной артерии единственной почки [18], а в 2012 г. - на мышиной модели токсического ОПП, вызванного введением цис-платина. В последнем исследовании авторы уточнили механизм терапевтического действия ВП. Оказалось, что эффект связан с активацией антиапоптотических генов Bcl-xL, Bcl2 и BIRC8 с одновременным угнетением апоптоз-стимулирующих генов, таких как Casp1, Casp8 и LTA [20]. Далее авторами было установлено, что в модуляции активности генов как на транскрипционном уровне, так и в процессе трансляции, критически важную роль играют микроРНК. ВП, полученные из клеток, лишенных эндонуклеазы Dicer[15], а также из клеток, трансфицированных антагомирами[16], в частности AmiR 126 и AmiR 296, лечебным эффектом не обладают [17]. В 2014 г. на мышиной модели рабдомиолизного ОПП авторы показали лечебный эффект ВП, полученных из стволовых клеток печени человека [11]. При прочих равных условиях более легкие и мелкие ВП обладают большим эффектом. Например, полученная методом дифференциального ультрацентрифугирования фракция ВП 100 тыс. g, содержащая ВП размером 160±72 нм, оказалась в терапевтическом плане более эффективной, чем фракция 10 тыс. g со средним размером ВП 215±110 нм, Fig. 1 [27, p. 3]. Независимо от упомянутой выше итало-немецкой исследовательской группы защитный эффект ВП при ОПП подтвердили: - ученые университета Янгсу, КНР - на крысиной модели цис-платинового ОПП, использовавшие ВП из мезенхимальных стволовых клеток пуповины [8]; - южнокорейские исследователи - на ишемической реперфузионной модели ОПП, применившие ВП, полученные из мезенхимальных стволовых клеток почек [16]; - группа экспериментаторов из научно-исследовательских организаций Шанхая, КНР, работавшая с мезенхимальными клетками стромы вартонова студня человеческой пуповины как источника ВП [19]; - а также канадско-британский исследовательский коллектив - на мышиной ишемической реперфузионной модели ОПП с использованием ВП из культуры человеческих колониеформирующих клеток эндотелия пупочной вены [10]. Клинические исследования Как уже отмечено выше, пока по данной теме проводится единственное клиническое испытание. Официальное название - Острое повреждение почек в педиатрической кардиохирургии[17], NCT02289040. Строго говоря, данное исследование не ставит целью использовать ВП для лечения ОПП. Это в полной мере пилотный проект, задачей которого является получение предварительной информации о том, какова роль ВП и содержащихся в них микроРНК в патогенезе/саногенезе ОПП после операций с использованием искусственного кровообращения у детей с врожденными пороками сердца. Исследование проводится на базе клиники Лестерского университета (University of Leicester), Великобритания. Дизайн: проспективное контролируемое открытое исследование. Планируется обследовать 24 ребенка. Испытание впервые зарегистрировано 13 ноября 2014 г., однако по состоянию на 6 декабря 2017 г. находится в подготовительной стадии и запись пациентов еще не начиналась. Заключение Вышеизложенное указывает на очевидный трансляционный потенциал использовании ВП в лечении ОПП. В планируемой серии статей в аналогичном плане будут рассмотрены и другие нозологические формы, такие как инсульт, инфаркт миокарда, сахарный диабет, критических размеров травматические дефекты костей, спинальная травма и др., при которых применение ВП можно рассматривать как перспективное.

About the authors

A. N Bel'skikh

M. M Galagudza

A. S Golota

A. B Krassii

Email: ramzai2002@mail.ru

O. A Nagibovich

References

Supplementary files