Ultrastructural characteristics of red blood cells in community-acquired pneumonia in young persons

Full Text

Внебольничная пневмония (ВП) отно- сится к наиболее частым заболеваниям человека и занимает шестое место среди причин общей смертности в России [10]. На решение проблемы пневмонии направлены интенсивные исследования в различных областях фундаментальной и клинической медицины [7]. Использование современных био медицинских технологий для оценки физиологических функций на молекулярном и субмолекулярном уровнях открывают новые возможности для выяснения патофизиологических закономерностей формирования клинической картины заболевания у разных категорий больных. Так, применение для этих целей атомно-силовой микроскопии (АСМ) и спектроскопии комбинационного рассеивания (СКР) существенно повышает возможности исследователей в оценке и интерпретации полученных фактов [1, 11]. АСМ регистрирует силу взаимосвязей между атомами образца и атомом зонда (кантилевера) на расстояниях около одного ангстрема и оперирует наноразмерами, что эффективно используется при изучении микрорельефа и структуры поверх ности биологических тканей, фиксирует их трехмерные изображения на атомно-молекулярном уровне и позволяет исследовать наноструктуру объекта. Кроме того, с помощью АСМ измеряют упругие и адгезивные свойства клеточных мембран, тесно взаимосвязанных с интра- и экстра целлюлярными взаимодействиями [1, 5]. АСМ позволяетсоздавать как геометрический «образ» поверхности клетки, так и ее физико-механический (биомеханический) «образ», составленный из набора АСМ-параметров. Известно, что современные техно логии позволяют провестиструктурный и композиционный анализ объекта.В частности, методом СКР индуцируется возбуждение молекул исследуемого образца лазерным излучением, переводя их из основного квантового состоянияв колебательное, с последующим возвращением в исходное. Возникающий при этом энергетический сдвиг между падающим и рассеянным светом, являющийся уникальной характеристикой каждой молекулы, реализует возможность химической идентификации соединений в исследуемом объ екте [11]. В современной научной литературе имеются единичные работы, посвященные изучению влияния патогенетических факторов ВП на ультраструктурную организацию эритроцитов, обеспечивающих газотранспортную функцию крови, значение которой в условиях формирующейся при тяжелой пневмонии дыхательной недостаточности существенно возрастает [5]. Цель исследования Изучение с помощью АСМ и СКР некоторых параметров наноструктуры эритроцитов и оценка их взаимосвязис рядом патогенетических факторов ВП. Материал и методы В исследование было включено 55 пациентов в возрасте 18-26 лет (средний возраст 21,7+1,9 года), находившихся на стационарном лечении в пульмонологическом отделении госпиталя. Средние сроки стационарного лечения составили 22,4+0,5 дня. Лечение проводилось в соответствии с общепринятыми стандартами [9]. У 30 человек диагностирована нетяжелая ВП, у 25 - тяжелая. Госпитализация больных с нетяжелой ВП проводилась по эпидемическим показаниям,т. к. все они находились в закрытых организованных коллективах. Контрольную группу составили 20 здоровых некурящих добровольцев аналогичного возраста. Этиологическую структуру ВП составляли: Streptococcus pneumoniae - 58%, Haemophilus influenza - 22%, Mycoplasma pneumoniae - 14%, Hlamydophila pneumoniae - 6%. При постановке диагноза ВП учитывали рекомендации Российского респираторного общества [10]. Оценка состояния больных в динамике заболевания проводилась по результатам мониторирования клинических и лабораторно-инструментальных показателей, включая уровеньпарциального напряжения кислородав артериальной крови (PaO2) и сатурации артериальной крови кислородом (SpO2). Для больных с тяжелой ВП была характерна полисегментарная, долевая или бидолевая воспалительная инфильтрация легких, как правило двухсторонняя.У 8 (32%) больных диагностирован парапневмонический экссудативный плеврит. При нетяжелой ВП инфильтрация локализовалась субсегментарно или в пределах нескольких сегментов, преимущественно в одном легком. Все больные с тяжелой ВП находились в сознании.В разгар заболевания у них доминировала фебрильная лихорадка, выраженная одышка, артериальная гипотензия на фоне синусовой тахикардии. По данным мониторирования показателей PaO2и SpO2 у этой категории больных фиксировалась выраженная гипоксемия. Забор крови всем обследованным производился из вены в количестве 3 мл в течение суток после поступленияв стационар. В качестве антикоагулянта использовали гепарин в количестве10 Ед/мл. Выделение эритроцитов осуществляли путем центрифугирования в течение 10 мин при 1500 об/мин. Всем больным проводились стандартные лабораторные, микробиологические и иммунологические исследования, производился расчет гематологических индексов интоксикации [2]. Определяли концентрациюмолекул средней массы (МСМ) в плазме крови. Анализ газового состава артериальной крови проводился на автоматическом анализаторе ABL-725 (Radiometer Copenhagen, Дания), SpO2 определяли на пульсоксиметре Nissei OX-700 (Nihon Seimitsu Sokki Co Ltd, Япония). Исследование структурно-функциональных свойств эритроцитов осуществляли на сканирующем атомно-силовом микроскопе Bioscope Catalyst (Bruker, США) в сочетании с инвертированным микроскопом Axiovert 200 (Zeiss, Германия). Изображение получали в контактном режиме scan asyst mode. Для контроля отсутствия разрушения образцов при сканировании выборочно использовали полибесконтактный режим (tapping mode). Применяли кантилевера MSNL-10(k: 0,07-0,107 N/m, f0: 15-33 kHz) и SCANASYST-AIR (k: 0,3-0,4 N/m, f0: 54-92 kHz) производство Bruker. Для определения микромеханических характеристик (модуля упругости, эластической деформации, силы адгезии) использовали режим наномеханического картирования - the peak force quantitative nano-mechanical mapping mode (PFQNM), разработанный Bruker. Перед каждым микромеханическим картированием исследуемого образца проводили калибровку датчика (кантилевера) по опорным материалам - эталонам Bruker с известными механическими свойствами поверхности. При этом определялись чувствительность к отклонению по лейкосапфиру, модуль упругости - по полиэтилену: PDMS-SOFT1(2,5 MPa) и PDMS-SOFT2 (3,5 MPa). Кроме того, измеряли радиус скругления кончика иглы кантилевера на специальной тестовой пластине с покрытием из оксида титана. Полученные калибровочные данные использовались программой NanoScope v. 8.10 (Bruker, США) для расчета истинной константы упругости (k) и построения изображения объекта в микромеханических величинах. СКР проводили с помощью рамановского микроскопа-спектрометра Via Reflex (Renishaw, Великобритания), объединенного с универсальным микроскопом проходящего света Leica DM2500M, (Leica-microsystems, Германия). Для возбуждения использовали диодный лазер 532 нм при 0,50 мВт мощности на уровне объекта и времени экспозиции 0,3 с. Лазерное пятно диаметром около 1,6 мкм на образце формировалось объективом (50ґ, NA=0.6, Leica). Для измерения спектра комбинационного рассеяния готовили мазки из эритроцитарной массы на обезжиренной металлической подложке. Результаты экспериментальных исследований обработаны методами вариационной статистики с использованием пакета анализа Microsoft Excel 14. При сравнении двух независимых групп использованы непараметрический критерий Манна-Уитни, анализ взаимосвязей выполнялся непараметрическим методом корреляционного анализа Спирмена для ненормального распределения. Результаты и обсуждение Для оценки тяжести состояния больных ВП использовали показатели шкалы SMRT-CO (табл. 1), которая является«облегченным» вариантом шкалы SMART-COP (без учета концентрации альбумина и pH артериальной крови) [10]. Приведенные параметры свидетельствовали о том, что у большинства больных с нетяжелой ВП клинико-лабораторные показатели, за исключением умеренного лейкоцитоза, находились в пределах нормы. Однако, как было указано выше, их госпитализация была обусловлена эпидемическими показаниями. Состояние больных с тяжелой ВП характеризовалось выраженной систоло-диастолической гипотензией, синусовой тахикардией до 120 уд/мин, тахипноэ до30 дых. дв/мин, высоким лейкоцитозом, снижением показателей PaO2 и SpO2 до64 мм рт. ст. и 90% соответственно. Незначительное увеличение относительно контроля содержания эритроцитов было обусловлено интоксикационным синдромом и избыточным респираторным влаговыделением в результате тахипноэ, что подтверждалось и достоверным увеличением уровня гематокрита. Вместе с тем примерно у 20% обследованных имела место диссоциация между клиническими проявлениями синдрома эндогенной интоксикации и объемом поражения легочной ткани. Так, у больных с нетяжелой ВП выраженная лихорадка и тахи пноэ на фоне «скромных» объемов воспалительной инфильтрации легочной ткани свидетельствовали о преобладании в клинической картине заболевания проявлений эндогенной интоксикации.И, наоборот, у части больных с тяжелой ВП клинические проявления эндотоксикоза иногда были менее заметными и не соответствовали значительному объему поражения легких. Аналогичные наблюдения фиксировали и другие авторы [2]. Для более точного ранжирования больных по степени выраженности эндотоксикоза и последующего анализа влияния его факторов на микромеханические свойства мембран эритроцитов были определены и рассчитаны стандарт ные лабораторные показатели и индексы интоксикации (табл. 2). При этом тяжесть эндотоксикоза ранжировали по мере его нарастания от I до III степени. Анализ приведенных данных показал, что у большинства больных нетяжелой ВП диапазон изменений этих показателей соответствовал эндотоксикозуI ст., а при тяжелой ВП - II и III ст.Динамика изменений гемато логических показателей показала линейную направленность, которая ассоциироваласьс достоверным увеличением их значений по мере нарастания эндотоксикоза. Так, в группе нетяжелой ВП величины лейкоцитарного, гематологического и ядерного индексов интоксикации превышали значения контрольной группы в 5,2, 4,2 и 6,2 раза соответственно, а в группе тяжелой ВП это превышение составляло уже 12,9, 28,8 и 10 раз. Одновременно зарегистрировано достоверное повышение уровня МСМ на 19,4% при нетяжелой ВП и на 58,6% - при тяжелой. Кроме того,в этой группе больных установлено значительное повышение в сыворотке крови концентрации креатинина и мочевины. Полученные данные свидетельствуют о том, что тяжесть клинических проявлений ВП обусловлена не только респираторными нарушениями и ассоциированной с ними артериальной гипоксемией, но и накоплением в крови токсических компонентов, в т. ч. продуктов протеолиза мочевины и креатинина (МСМ и низкомолекулярных азотистых шлаков). Таким образом, оценка тяжести эндогенной интоксикации существенно дополняет клиническую характеристику больных и уточняет представления о выраженности метаболических нарушений и функциональном состоянии систем естественной биологической детоксикации. Для оценки ультраструктуры эритроцитов с помощью АСМ клетки визуализировались в 3 D изображении и проводилось определение их конфигурации, размеров и микромеханических свойств. Анализ параметров, характеризующих геометрическую структуру поверхности эритроцитов и микромеханические свойства их мембран показал, что не все из них претерпевают изменения на фоне ВП (табл. 3). Установлено, в частности, что даже в разгар заболевания диаметр, площадь, объем и другие параметры эритроцитов, описывающие их геометрический «образ», остаются стабильными у всех обследованных пациентов. Существенно изменялись только показатели, характеризующие упруго-эластические свойства этих клеток. Выраженность данных изменений доминировала среди больных с тяжелым течением ВП. Так, модуль упругости клеточных мембран эритроцитов и сила их адгезии снижались в 5,2 и 2,4 раза соответственно, а показатель упругой деформации повышался в 2,6 раза.У больных с нетяжелой ВП уровень этих показателей также достоверно отличался от контрольных значений, но был менее заметным. Результаты корреляционного анализа убедительно демонстрировали, что в разгар заболевания фиксируется сильная обратная корреляционная связь между SpO2 и показателем упругой деформации эритроцитов (r=-0,72; p<0,01) и сильные прямые связи с модулем упругости (r=0,81; p<0,01) и силой адгезии (r=0,68; p<0,01). Установлены также достоверные корреляционные связи между параметрами эндогенной интоксикации и микромеханическими свойствами мембран (табл. 4). В частности, имели место положительные корреляции высокой интенсив ности между ЛИИ (r =0,82), ГПИ (r =0,84), МСМ (r =0,88) и показателем упругой де формации эритроцитов (во всех случаях p<0,01). Сильные обратные связи обнаружены между ЛИИ (r =-0,84), ГПИ(r =-0,88), МСМ (r =-0,84) и модулем уп ругости эритроцитарной мембраны,а также с силой ее адгезии. Вместе с тем анализ этих показателей у больных с различной этиологической структурой пневмоний не выявил каких-либо количественных различий и характера изменений корреляционных связей в зависимости от вида возбудителя. Среди реконвалесцентов, перенесших нетяжелую ВП, не удалось обнаружить отклонений микромеханических параметров эритроцитов от контрольных значений, что свидетельствует о транзиторном характере указанных изменений.У большинства обследованных, перенесших тяжелую ВП, сохранялись их достоверные отличия от уровня нормы, которые нивелировались при контрольном исследовании через 2,5-3 мес после выписки из стационара. При исследовании спектра комбинационного рассеивания сухих образцов эритроцитной массы у здоровых лиц и больных ВП установлено, что при длине волны возбуждения 523 нм интенсивность и положение пиков в диапазонах 660- 1640 см-1, характерных для гемоглобина, между собой не различались. Кроме того, спектр комбинационного рассеивания в области 1564 см-1 и 1636 см1, соответствующий максимальным пикам колебаний связей гемопорфирина в цитоплазматическом гемоглобине, был аналогичным во всех обследованных группах. Известно, что единственной срочной реакцией адаптации к гипоксемии различного генеза является ускорение кровотока [6]. Это в полной мере относится к пневмонии как универсальной биологической модели гипоксии [8]. На уровне системной гемодинамики у больных ВП формируется гиперкинетический тип кровообращения за счет мобилизации инотропного ресурса миокарда и снижения периферического сосудистого сопротивления [4]. В зоне микрососудов происходит усиление притока крови, увеличивается спектр колебаний скорости кровотока и развивается гиперемический тип нарушений микроциркуляции. Важной особенностью микроциркуляции при патологии различного генеза, в т. ч. и при пневмонии, является ускоренное «замусоривание» микрососудов лейкоцитами, адгезированными к их внутренней стенке [6]. В ряде исследований доказано, что при воспалительных процессах в легких, особенно у лиц пожилого и старческого возраста, существенно возрастает сила адгезии лейкоцитов [8]. Это закономерно приводит к сужению просвета микрососудов и является одним из ведущих факторов нарушения микроциркуляции. Полученные в нашем исследовании данные о значительном снижении силы адгезии эритроцитов, особенно выраженном при тяжелой ВП, свидетельствуето торможении их агрегации и формирования сладжа. В то же время увеличение показателя упругой деформации мем браны эритроцитов при нарастающейтяжести ВП характеризует способность этих клеток адаптироваться к изменившимся условиям гемоциркуляции за счет изменения конфигурации в процессе их движения по микрососудам. Создание нового геометрического образа поверхности клеток в условиях патологического процесса подтверждается и динамикой изменения модуля упругости, уровень которого резко снижается при тяжелой ВП. Следует отметить, что другие АСМ-параметры эритроцитов (площадь, объем, диаметр и др.) даже в разгар тяжелой ВП не отличались от уровня таковых у здоровых лиц, что может свидетельствовать о стабильной структуре их цитоскелета. Анализ полученных данных позволяет сделать вывод о том, что изменения микромеханических свойств мембран эритроцитов при воздействии патогенетических факторов ВП, прежде всего гипоксемии и эндотоксемии, носят адаптивный характер. В то же время необходимо подчеркнуть, что данная динамика АСМ-параметров фиксировалась у однородного контингента лиц молодого возраста без «фоновой» патологии внутренних органов и сопутствующих заболеваний, что ассоциируется прежде всего с высоким адаптивным потенциалом функциональных систем организма и способностью адекватного ответа на предъявляемые воздействия. Таким образом, выявленные в нашей работе транзиторные изменения микромеханических свойств мембран эритроцитов указывают на уникальную пластичность этих клеток и их высокий адаптивный потенциал. Результаты, полученные при проведении СКР, свидетельствуют о том, что даже при тяжелой ВП у лиц молодого возраста без сопутствующих заболеваний интрацеллюлярная химическая структура эритроцитов остается стабильной и не отличается от таковой у здоровых лиц. Это позволяет предположить, что сродство гемоглобина к кислороду в этих случаях не нарушается. В ряде работ показано, что у молодых людей при неосложненном течении ВП концентрация гемоглобина в эритроцитах существенно не изменяется в отличие от больных пожилого и старческого возраста, среди которых при данном заболевании часто фиксируется устойчивая тенденция к развитию или усугублению уже существующей нормохромной анемии [3]. Полученные данные позволяют констатировать, что нарушения газообмена со снижением насыщения гемоглобина кислородом, закономерно развивающиеся при пневмонии вследствие «затопления» части альвеол воспалительным экссудатом, как правило, компенсируется у молодых людей за счет мобилизации респираторных возможностей аппарата внешнего дыхания. При сравнении результатов собственных исследований с немногочисленными данными литературы по этому вопросу выявляются общие закономерности молекулярной организации и функционирования эритроцитарной мембраны при ряде соматических заболеваний, что позволяет прийти к заключению о существовании однонаправленных структурно-функциональных ответов клеток крови на типовые стрессирующие факторы. В Ы В О Д Ы 1. При ВП у лиц молодого возраста фиксируются изменения упруго-эластических свойств мембран эритроцитов, которые более заметны при тяжелом течении заболевания. В разгар тяжелой ВП модуль упругости и сила адгезии эритроцитарной мембраны снижались в 5,2 и 2,4 раза соответственно, а упругая деформация повышалась в 2,6 раза. При этом геометрическая структура поверхности эритроцитов существенно не изменялась. Восстановление микромеханических параметров клеточных мембран происходило через 3 мес после перенесенной тяжелой пневмонии. 2. Результаты корреляционного анализа свидетельствуют о существенном влиянии эндотоксемии и артериальной гипоксемии на функциональное состояние и пластичность мембран эритроцитов, изменения которых носят адаптивный характер. 3. Результаты спектроскопии комбинационного рассеивания показали, что химическая структура эритроцитов при внебольничной пневмонии у лиц молодого возраста аналогична контрольной группе, что может свидетельствовать о стабильности метаболического профиля гемопорфиринов у данной категории больных.

About the authors

B. I Geltser

V. N Kotelnikov

Email: 671235@mail.ru

A. A Karpenko

A. P Kim

References

Supplementary files