Молекулярные механизмы контроля дифференцировки регуляторных т-лимфоцитов экзогенным мелатонином

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Исследовали роль эпифизарного гормона мелатонина в дифференцировке наивных Т‑лимфоцитов CD4+ в регуляторные Т‑клетки (Treg). Гормон в физиологической и в фармакологических концентрациях ингибировал дифференцировку Treg, снижая как долю клеток CD4+FOXP3+ в культуре, так и уровень ключевого для данной Т‑клеточной субпопуляции цитокина — TGF‑β. Ингибирующее влияние экзогенного мелатонина было обусловлено его взаимодействием с мембранными рецепторами МТ1 и МТ2. В то же время сигналы, реализуемые через ядерный рецептор для мелатонина, RORa, стимулировали формирование Treg, но они были значительно слабее сигнала от мембранных рецепторов и перекрывались последним. Поскольку субпопуляция Treg играет важную роль в физиологических и патологических процессах в организме, выявленные нами эффекты мелатонина должны учитываться при его терапевтическом использовании.

Полный текст

Гормон шишковидной железы мелатонин (N‑ацетил‑5-метокситриптамин) является важнейшим компонентом нейроэндокринной системы. Обладая плейотропными эффектами, такими как контроль биологических ритмов, сна, артериального давления, а также антиоксидантной и антистрессовой активностью [1, 2], мелатонин имеет существенную потенциальную клиническую значимость. В то же время гормон способен эффективно регулировать иммунную систему: практически все основные типы иммунных клеток экспрессируют рецепторы для мелатонина [2] и чувствительны к его действию [3]. Как следствие, существенные и устойчивые изменения уровня гормона в крови, наблюдаемые в случае применения мелатонина в качестве фармакологического препарата, должны вносить существенный вклад в регуляцию иммунного ответа организма.

Важнейшей потенциальной мишенью действия гормона в иммунной системе является субпопуляция регуляторных Т‑лимфоцитов (Treg), контролирующих интенсивность и продолжительность иммунного ответа и играющих ключевую роль в предупреждении развития аутоиммунных, аллергических процессов, реакций отторжения трансплантата [4, 5]. Treg экспрессируют два типа специфических мембранных рецепторов для мелатонина, МТ1 и МТ2 [6], а ключевой дифференцировочный фактор и маркёр данной субпопуляции, FОXP3, находится под контролем транскрипционного фактора RORα [7], который также связывает мелатонин и рассматривается как ещё один ядерный рецептор для гормона [7, 8]. Поскольку все мелатониновые рецепторы имеют разную аффинность связывания гормона [2], регуляция Treg должна напрямую зависеть от концентрации мелатонина.

Целями настоящей работы был анализ роли экзогенного мелатонина в контроле дифференцировки Treg и оценка вклада конкретных мелатониновых рецепторов в реализацию эффектов этого гормона.

 

Рис. 1. Регуляция экзогенным мелатонином in vitro экспрессии FOXP3 интактными и активированными Т-лимфоцитами CD4+. Заштрихованные столбцы – доля Т-клеток CD4+FOXP3+ в процентах от общего числа клеток, тёмные столбцы – доля активированных Т-клеток CD4+FOXP3+ в процентах. Здесь и на рис. 2 M ± m, n = 11, *p < 0,05 по сравнению с контролем; #p < 0,05 при сравнении с соответствующим показателем для интактных Т-лимфоцитов CD4+.

 

Рис. 2. Изменение концентрации TGF-b в культуральных супернатантах активированных Т-лимфоцитов CD4+ при действии экзогенного мелатонина. *p < 0,05 по сравнению с контролем, аp < 0,05 при сравнении с соответствующим показателем для дозы 0,5 нг/мл.

 

Рис. 3. Снижение уровня Т-клеток CD4+FOXP3+ в культуре на фоне подавления экспрессии RORa с помощью специфичных siРНК.

 

Объектами исследования служили лейкоциты здоровых небеременных женщин репродуктивного возраста (32,18 ± 2,74 года, n = 11). От всех доноров было получено информированное согласие на участие в работе. Дифференцировку фракционированных наивных Т‑лимфоцитов CD4+ в Treg оценивали в 48-часовой культуре в спонтанном и стимулированном (анти-CD3/CD28, “Invitrogen”, США) вариантах по экспрессии клетками транскрипционного фактора FOXP3 проточной цитометрией с помощью моноклональных антител анти-CD4*FITC, анти-FОXP3*PE (“R&D Sys-tems”, “BioLegend”, США), а также по продукции ключевого цитокина Treg, трансформирующего ростового фактора b (TGF‑b), с помощью иммуноферментного анализа (“R&D Systems”). Мелатонин (“Sigma-Aldrich”, США) использовали в высокой физиологической концентрации 100 пг/мл [9], в фармакологических концентрациях 0,5 и 5 нг/мл (максимальные уровни мелатонина в периферической крови при использовании соответственно низкой и высокой терапевтических доз гормона в лечении бессонницы, депрессивных состояний [10]) и 200 нг/мл (максимальная концентрация мелатонина в периферической крови при использовании препаратов на основе гормона в противоопухолевой терапии [11]). Вклад конкретных мелатониновых рецепторов в реализацию эффектов экзогенного гормона определяли ингибиторным анализом с использованием для мембранных рецепторов соответствующих антагонистов — неселективного (luzindole — для МТ1/МТ2) и селективного (4-P-PDOT — для МТ2). Оба антагониста производства “Tocris Bioscience”, Великобритания. А для ядерного мелатонинового рецептора RORa — три типа малых интерферирующих РНК (siРНК, “OriGene”, США), специфичных для RORa, и скремблированную siРНК в качестве отрицательного контроля. Трансфекцию siРНК проводили с помощью липофектамина (“Invitrogen”). Эффективность трансфекции подтверждали оценкой экспрессии RORa в клетках, определяя содержание мРНК полимеразной цепной реакцией (RT‑qPCR) с помощью набора SingleShot™ SYBR® Green One-Step Kit (“Bio-Rad”, США), и белка — проточной цитометрией с использованием моноклональных антител анти-RORa*PЕ (“R&D Systems”). При статистическом анализе полученных данных использовали парный критерий t Стьюдента.

Мелатонин в высокой физиологической концентрации подавлял дифференцировку Treg: число FOXP3-позитивных клеток достоверно снизилось через 48 ч культивирования стимулированных Т‑лимфоцитов CD4+ (рис. 1). В условиях поликлональной активации Т‑лимфоцитов данный показатель также статистически значимо снизился под действием гормона в фармакологической концентрации, равной 0,5 нг/мл (рис. 1). Выявленные эффекты подтвердились и снижением уровня TGF‑b в культуральных супернатантах под действием мелатонина в концентрациях 100 пг/мл, 0,5 и 5 нг/мл (рис. 2).

Оценка вклада мембранных мелатониновых рецепторов в реализацию выявленных эффектов гормона показала, что подавление дифференцировки Treg фармакологическими концентрациями гормона 0,5 и 5 нг/мл отменялось на фоне неселективной блокады МТ1/МТ2 и селективного ингибирования МТ2. Эти данные указывают на ключевую роль МТ2 в реализации ингибиторных эффектов мелатонина в отношении дифференцировки Treg, хотя не исключено участие в этом процессе и МТ1 (табл. 1).

При подавлении экспрессии внутриклеточного рецептора RORa все три варианта использованных siРНК, специфичных к мРНК RORa, показали свою эффективность: контроль — 1,10 ± 0,27 (процент Т‑клеток CD4+RORa+, здесь и далее M ± m, n = 5), siРНК A — 0,77 ± 0,16; siРНК B — 0,87 ± 0,25; siРНК C — 0,82 ± 0,18. Учитывая высокую вариабельность показателей между донорами, полученные результаты выражали в процентах подавления экспрессии RORa и маркёра дифференцировки Treg, FOXP3. Как видно из рис. 3, снижение уровня клеток CD4+FOXP3+ в культуре при действии мелатонина в концентрации 0,5 нг/мл усиливалось на фоне siРНК, причём имела место та же закономерность, что и для RORa: максимальное подавление экспрессии обоих факторов мы зарегистрировали на фоне siРНК B, минимальное — на фоне siРНК C. Эти данные указывают на то, что RORa-зависимые эффекты мелатонина, используемого в этой концентрации, являются стимулирующими для Treg. В отличие от этого в реализации действия мелатонина в концентрации 5 нг/мл RORa практически не участвует: его инактивация не сопровождалась заметным изменением уровня клеток CD4+FOXP3+ в культуре, хотя для обоих факторов изменения носили однотипный характер (рис. 3). Следует отметить, что ряд исследователей [12] ставит под сомнение способность RORα непосредственно связывать мелатонин и, соответственно, выступать в качестве рецептора для гормона, основываясь на данных кристаллографического анализа. Однако эти данные противоречат более ранним работам, в которых с помощью классического скетчардовского анализа была определена аффинность связывания RORα с мелатонином [8]. Что касается настоящей работы, вопрос о том, регулирует ли мелатонин RORα напрямую или такая регуляция опосредуется другими факторами, не принципиален: способность гормона регулировать активность RORα показана в различных системах [13], и мы исследовали такую регуляцию в Т‑лимфоцитах.

В целом полученные результаты указывают на способность мелатонина в высокой физиологической и в фармакологических концентрациях ингибировать дифференцировку Treg, снижая как долю клеток CD4+FOXP3+, так и уровень ключевого для данной клеточной субпопуляции цитокина — TGF‑b. При этом ингибирующие эффекты фармакологических концентраций мелатонина реализуются через мембранные рецепторы, в первую очередь через МТ2. В то же время сигналы, реализуемые через ядерный рецептор RORa, стимулируют формирование Treg, но они значительно слабее сигналов с мембранных рецепторов и перекрываются последними. Это показано для концентрации мелатонина 0,5 нг/мл, тогда как в реализации ингибирующего эффекта посредством ядерного рецептора гормон в концентрации 5 нг/мл, по-видимому, не участвует. Обнаруженные нами эффекты мелатонина должны учитываться при решении вопроса о применении мелатонинзависимой терапии.

 

Таблица 1. Роль мембранных рецепторов МТ1 и МТ2 в реализации эффектов мелатонина в отношении дифференцировки Т-клеток CD4+ в Treg in vitro

Экспериментальные условия

Концентрация мелатонина в культуре

Контроль/

ингибитор

0,5 нг/мл

5 нг/мл

Процент клеток CD4+FOXP3+в культуре активированных Т-лимфоцитов

Без блокады МТ1/МТ2

9,77 ± 1,78

7,00 ± 1,46*

8,30 ± 1,68

С блокадой МТ1/МТ2 (Luzindole)

6,82 ± 2,17

6,98 ± 1,98

7,55 ± 1,99

С блокадой МТ2

(4-P-PDOT)

7,11 ± 2,03

7,79 ± 2,14

6,99 ± 1,78

Концентрация TGF-b в супернатантах культур активированных Т-клеток CD4+, пг/мл

Без блокады МТ1/МТ2

1606,24 ± 157,74

1319,20 ± 159,26*

1363,24 ± 159,58*

С блокадой МТ1/МТ2 (Luzindole)

1451,05 ± 151,41

1427,88 ± 151,76

1341,80 ± 145,78

С блокадой МТ2

(4-P-PDOT)

1428,29 ± 169,36

1263,43 ± 153,40

1295,89 ± 144,24

M ± m, n = 11, *p < 0,05 при сравнении с контролем.

 

Данные литературы о связи мелатонина с активностью Treg немногочисленны и касаются в основном патологических состояний. Так, показано, что мелатонин вызывает значительное снижение численности Treg при его использовании в противоопухолевой терапии [14]. В то же время выявлено стимулирующее действие гормона в отношении Treg при аутоиммунных патологиях [15]. Данные противоречия, возможно, связаны с показанной в настоящей работе разнонаправленной регуляцией Treg мелатонином через мембранные и ядерный рецепторы, а также с зависимостью действия гормона от его концентрации.

Работа поддержана грантом РФФИ 16–34–60094 мол_а_дк.

×

Об авторах

Н. С. Глебездина

Институт экологии и генетики микроорганизмов  Уральского отделения Российской Академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: glebezdina_n@mail.ru
Россия, 614990, Пермский край, г. Пермь, ул. Ленина, д.13, стр. а

А. А. Олина

Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта

Email: glebezdina_n@mail.ru
Россия, 199034, г. Санкт-Петербург, Менделеевская линия, 3

И. В. Некрасова

Институт экологии и генетики микроорганизмов  Уральского отделения Российской Академии наук

Email: glebezdina_n@mail.ru
Россия, 614990, Пермский край, г. Пермь, ул. Ленина, д.13, стр. а

Е. М. Куклина

Институт экологии и генетики микроорганизмов  Уральского отделения Российской Академии наук

Email: glebezdina_n@mail.ru
Россия, 614990, Пермский край, г. Пермь, ул. Ленина, д.13, стр. а

Список литературы

  1. Hardeland R. // Sci. World J. 2012. V. 8. P. 1–18.
  2. Ren W., Liu G., Chen S., et al. // J. Pineal Res. 2017. V. 62. e12394.
  3. Carrillo-Vico A., Calvo J.R., Abreu P., et al. // FASEB J. 2004. V. 18. № 3. P. 537–539.
  4. Kanamori M., Nakatsukasa H., Okada M., et al. // Trends Immunol. 2016. V. 37. № 11. P. 803–811.
  5. Jeffery H.C., Braitch M.K., Brown S., Oo Y.H. // Front Immunol. 2016. V. 7. P. 334.
  6. Slominski R.M., Reiter R.J., Schlabritz-Loutsevitch N., et al. // Mol. Cell. Endocrinol. 2012. V. 351. № 2. P. 152–166.
  7. Lardone P.J., Guerrero J.M., Fernandez-Santos J.M., et al. // J. Pineal Res. 2011. V. 51. № 4. P. 454–462.
  8. Wiesenberg I., Missbach M., Kahlen J.P., et al. // Nucl. Acids Res. 1995. V. 23. № 3. P. 327–333.
  9. Brzezinski A. // N. Engl. J. Med. 1997. V. 336. № 3. P. 186–195.
  10. Gooneratne N.S., Edwards A.Y., Zhou C., et al. // J. Pineal Res. 2012. V. 52. № 4. P. 437–445.
  11. Hill S.M., Blask D.E. // Cancer Res. 1988. V. 48. № 21. P. 6121–6126.
  12. Slominski A.T., Michal A., Zmijewski M.A., Jetten A.M. // Bioessays. 2016. V. 38. № 12. P. 1193–1194.
  13. Carrillo-Vico A., Lardone P.J., Alvarez-Sanchez N., et al. // Int. J. Mol. Sci. 2013. V. 14. P. 8638–8683.
  14. Vinther A.G., Claesson H.C. // Int. J. Cancer Clin. Res. 2015. V. 2. P. 1–4.
  15. Medrano-Campillo P., Sarmiento-Soto H., Alvarez-Sanchez N., et al. // J. Pineal Res. 2015. V. 58. P. 219–226.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Регуляция экзогенным мелатонином in vitro экспрессии FOXP3 интактными и активированными Т-лимфоцитами CD4+. Заштрихованные столбцы – доля Т-клеток CD4+FOXP3+ в процентах от общего числа клеток, тёмные столбцы – доля активированных Т-клеток CD4+FOXP3+ в процентах. Здесь и на рис. 2 M ± m, n = 11, *p < 0,05 по сравнению с контролем; #p < 0,05 при сравнении с соответствующим показателем для интактных Т-лимфоцитов CD4+.

Скачать (65KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Изменение концентрации TGF-b в культуральных супернатантах активированных Т-лимфоцитов CD4+ при действии экзогенного мелатонина. *p < 0,05 по сравнению с контролем, аp < 0,05 при сравнении с соответствующим показателем для дозы 0,5 нг/мл.

Скачать (60KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Снижение уровня Т-клеток CD4+FOXP3+ в культуре на фоне подавления экспрессии RORa с помощью специфичных siРНК.

Скачать (84KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2019