The novel dipeptide ligand of TASP

Full Text

Транслокаторный белок (TSPO, 18 кДа), ранее известный как периферический бензодиазепиновый рецептор, участвует в транспорте холестерина от внешней к внутренней митохондриальной мембране, что является лимитирующей стадией синтеза нейростероидов [1]. Нейростероидные гормоны взаимодействуют с отличным от бензодиазепинового модуляторным сайтом рецептора ГАМКa [2] и обладают анксиолитической активностью без побочных эффектов бензодиазепиновых транквилизаторов.

В НИИ фармакологии им. В.В. Закусова с помощью оригинальной стратегии создания фармакологически активных дипептидов [3] на основе структуры алпидема был получен первый дипептидный лиганд TSPO — амид N‑карбобензокси-L‑триптофанил-L‑изолейцина (рабочее название ГД‑23) [4]. Для дипептида ГД‑23 было показано наличие анксиолитической активности в батарее валидированных фармакологических тестов у грызунов в интервале доз 0,1–1,0 мг/кг при системном введении. С помощью ингибиторного анализа с использованием селективного антагониста TSPO и двух блокаторов нейростероидогенеза были доказаны лигандные свойства ГД‑23 [5].

С целью расширения группы дипептидных лигандов TSPO, перспективных быстродействующих анксиолитиков, нами были синтезированы аналоги ГД‑23, в которых варьировались структуры C‑концевого и N‑концевого замещения [6]. Было выявлено, что замена бензилоксикарбонильной группы на фенилалканоильную той же длины приводила к сохранению анксиолитической активности. В развитие этой работы в настоящем сообщении нами описан новый дипептидный лиганд TSPO, амид N‑фенилпропионил-L‑триптофанил-L‑лейцина (ГД‑102), в котором по отношению к ГД‑23 была проведена одновременная замена остатка изолейцина на остаток лейцина и бензилоксикарбонильной группы на фенилпропионильную.

 

Таблица 1. Рассчитанные значения минимальной энергии связывания лиганд–рецептор

Соединение, шифр	Glide score, ккал /моль
PK11195	–10,0
Алпидем	–10,3
ГД-23	–7,2
ГД-102	–8,2

 

Для подтверждения того, что ГД‑102, как и ГД‑23, алпидем и известный антагонист TSPO, соединение РК11195 (N‑метил-N-(1-метил-пропил)амид 1-(2-хлорфенил)изохинолин‑3-карбоновой кислоты), может быть лигандом TSPO, мы провели их сравнительное молекулярное докирование в TSPO. При этом использовали пространственную структуру рецептора TSPO в комплексе с лигандом PK11195, полученную при помощи ЯМР (PDB ID: 2MGY) [7]. Расчёты выполняли в режиме полужёсткого докинга с помощью программы Glide [8]. Для анализа выбрали комплексы с наименьшей расчётной энергией связывания (табл. 1).

По результатам докинга мы обнаружили, что арильный заместитель в ГД‑102, как и в структурах алпидема, PK11195 и ГД‑102, занимал гидрофобный карман, образованный Trp107, Ala108 и Ala110. Замещённая амидная группа в структуре PK11195 и C‑концевая амидная группа в структуре ГД‑102 образовывали водородную связь с His43, а ГД‑23 — водородную связь с His43 с помощью индольного кольца. Ароматический гетероциклический фрагмент в структурах алпидема и PK11195 и арильный радикал в структуре дипептида ГД‑23 участвовали в π-π-стэкинге с Trp143. Пептид ГД‑102 не формировал стэкинг, но вступал в гидрофобное взаимодействие с этим же остатком триптофана (рис. 1).

Таким образом, данные молекулярного докинга свидетельствовали о наличии лигандных свойств ГД‑102 по отношению к TSPO.

 

Рис. 1. Положение в зоне связывания рецептора TSPO. а – алпидем, б – PK11195, в – ГД-23, г – ГД-102.

 

Анксиолитическую активность дипептида ГД‑102 изучали в стандартных фармакологических тестах открытого поля (ОП) со световой вспышкой с реакцией замирания на мышах-самцах BALB/cJLacSto и приподнятого крестообразного лабиринта (ПКЛ) на аутбредных мышах-самцах ICR (филиал питомника “Столбовая” ФГБУН НЦБМТ ФМБА России). Соединение вводили в виде суспензии с водным Твином‑80 (две капли на 10 мл воды) однократно внутрибрюшинно за 30 мин до начала эксперимента. Статистическую обработку фармакологических экспериментов проводили, используя однофакторный дисперсионный анализ ANOVA с критерием Краскела–Уоллиса и непараметрическое оценивание для независимых переменных (критерий U Вилкоксона–Манна–Уитни). Результаты считали достоверными при p £ 0,05.

Методика ОП со световой вспышкой основана на формировании стрессового ответа на перемещение из темноты на ярко освещённую арену, выражающегося для мышей линии BALB/c в реакции “замирания” (freezing). Увеличение общей двигательной активности в этом случае трактуется как проявление анксиолитического эффекта у испытуемого вещества, при этом общая двигательная активность оценивается как сумма периферической, центральной, вертикальной активностей и заходов в центр [9]. В тесте ОП со световой вспышкой установили, что соединение ГД‑102 после внутрибрюшинного введения в интервале доз 0,01–0,1 мг/кг вызывало статистически значимое увеличение общей двигательной активности мышей BALB/c по сравнению с контролем. В дозах 0,5; 1,0 и 5,0 мг/кг достоверного эффекта не зарегистрировали (рис. 2).

Таким образом, анксиолитическая активность ГД‑102 при минимальной действующей дозе была на порядок выше, чем таковая ГД‑23, что находится в согласии с данными, полученными методом молекулярного докинга более высокими энергиями связи с TSPO для ГД‑102 (8,2 ккал/моль) по сравнению с ГД‑23 (7,2 ккал/моль).

Наличие анксиолитической активности у ГД‑102 мы подтвердили и в тесте ПКЛ, который считается наиболее адекватным для выявления анксиолитической активности, которая проявляется в увеличении времени пребывания животного в открытых рукавах и относительной частоты заходов в открытые рукава [10]. Относительное время пребывания в открытых рукавах лабиринта в процентах рассчитывали по формуле , где ТО— время пребывания животных в открытых рукавах, ТЗ — время пребывания в закрытых рукавах лабиринта. Относительное число заходов в открытые рукава лабиринта рассчитывали по формуле: относительное число заходов в открытые рукава (проценты) = , где NО — число заходов животных в открытые рукава, NЗ — число заходов животных в закрытые рукава лабиринта.

При исследовании соединения ГД‑102 после внутрибрюшинного введения в диапазоне доз 0,1–0,5 мг/кг обнаружили достоверный анксиолитический эффект как по относительному времени пребывания в открытых рукавах, так и по относительному числу заходов в открытые рукава лабиринта (табл. 2).

Для доказательства участия рецептора TSPO в реализации анксиолитической активности соединения ГД‑102 мы исследовали в тесте ПКЛ возможное влияние антагониста TSPO — PK11195. Ингибитор PK11195 в водном растворе Твина‑80 вводили за 30 мин до введения ГД‑102 в дозе 10,0 мг/кг, при которой анализатор не влиял ни на время нахождения животных в открытых рукавах, ни на частоту заходов в открытые рукава [11]. В каждом исследовании животные получали одинаковое количество инъекций. Контрольные животные получали воду

 

Рис. 2. Анксиолитическая активность ГД-102 у мышей BALB/c в тесте ОП со световой вспышкой. *p < 0,05 – при сравнении с контролем (критерий U).

 

Таблица 2. Влияние ГД-102 при однократном внутрибрюшинном введении на поведение мышей ICR в тесте ПКЛ

Доза, мг/кг	Время в открытых рукавах, с	Время в закрытых рукавах, с	Число заходов в открытые рукава	Число заходов в закрытые рукава	Время в открытых рукавах, %	Время в закрытых рукавах, %	Общее число заходов в рукава лабиринта	Относительное время пребывания в открытых рукавах, %	Относительное число заходов в открытые рукава, %
Контроль	8,50 ± 14,08	259,25 ± 16,45	1,00 ± 1,31	8,63 ± 2,33	2,83 ± 4,69	86,42 ± 5,48	9,63 ± 2,50	3,12 ± 5,04	10,21 ± 15,18
0,1	58,75 ± 62,21*	206,38 ± 56,76*	2,50 ± 1,69	10,25 ± 2,82	19,58 ± 20,74*	68,79 ± 18,92*	12,75 ± 1,83*	21,69 ± 22,37*	20,39 ± 13,95
0,5	64,63 ± 47,73*	198,88 ± 39,97*	3,38 ± 2,83*	9,13 ± 1,36	21,54 ± 15,91*	66,29 ± 13,32*	12,50 ± 2,67*	24,04 ± 16,85*	24,50 ± 16,01*
1,0	44,00 ± 26,53*	214,38 ± 26,53*	3,13 ± 2,42	7,50 ± 1,93	14,67 ± 8,84*	71,46 ± 8,84*	10,63 ± 2,77	16,95 ± 10,27*	26,91 ± 18,39
p (ANOVA)	0,0106	0,0080	0,0947	0,1128	0,0106	0,0080	0,0728	0,0102	0,1050

Здесь и в табл. 3 данные представлены в виде M ± SD, количество животных n = 8 для каждой группы, *p < 0,05 при сравнении с контролем (критерий U).

 

Таблица 3. Влияние специфического ингибитора TSPO (РК11195) на анксиолитический эффект соединения ГД-102

Вещество, доза	Время в открытых рукавах, с	Время в закрытых рукавах, с	Число заходов в открытые рукава	Число заходов в закрытые рукава	Время в открытых рукавах, %	Время в закрытых рукавах, %	Общее число заходов в рукава лабиринта	Относительное время в открытых рукавах, %	Относительное число заходов в открытые рукава, %
Контроль	29,00 ± 5,35	226,88 ± 15,34	2,00 ± 0,76	8,25 ± 1,91	9,67 ± 1,78	75,63 ± 5,11	10,25 ± 1,75	11,38 ± 2,33	19,96 ± 8,91
РК11195, 10 мг/кг + вода	28,75 ± 23,91	225,75 ± 19,12	2,25 ± 1,91	9,75 ± 3,37	9,58 ± 7,97	75,25 ± 6,37	12,00 ± 3,85	11,05 ± 8,74	18,51 ± 11,98
ГД-102, 0,5 мг/кг + вода	114,13 ± 53,10*	139,13 ± 53,46*	5,50 ± 2,88*	6,88 ± 2,53	38,04 ± 17,70*	46,38 ± 17,82*	12,38 ± 3,38	45,09 ± 20,66*	43,72 ± 17,18*
РК11195, 10,0 мг/кг + + ГД-102, 0,5 мг/кг	25,88 ± 13,14	234,38 ± 23,17	2,63 ± 1,41	9,75 ± 2,31	8,63 ± 4,38	78,13 ± 7,72	12,38 ± 2,72	9,99 ± 4,99	21,19 ± 9,29
p (ANOVA)	0,0140	0,0139	0,0308	0,1003	0,0140	0,0139	0,2600	0,0123	0,0155

 

Предварительное введение PK11195 полностью блокировало анксиолитический эффект ГД‑102 (табл. 3). Показатели поведения животных этой группы оставались на уровне контроля и в то же время достоверно отличались от показателей группы, получавшей ГД‑102. Эти результаты подтвердили лигандные свойства дипептида ГД‑102 по отношению к TSPO.

Таким образом, на основании полученных результатов докинга, наличия анксиолитического эффекта и его блокирования с помощью антагониста PK11195 можно сделать вывод, что ГД‑102 является лигандом TSPO.

Работа выполнена при поддержке гранта Российского фонда фундаментальных исследований 17–04–00861, проект “Дизайн, синтез и изучение анксиолитической активности дипептидных лигандов рецептора TSPO как основа для создания нового класса быстродействующих анксиолитиков”.

About the authors

O. A. Deeva

State Foundation Institute of Pharmacology of the Russian Academy of Medical Sciences

Email: tata-sosnovka@mail.ru
Russian Federation, 8, Baltiyskaya street, Moscow, 125315

A. S. Pantileev

State Foundation Institute of Pharmacology of the Russian Academy of Medical Sciences

Email: tata-sosnovka@mail.ru
Russian Federation, 8, Baltiyskaya street, Moscow, 125315

I. V. Rybina

State Foundation Institute of Pharmacology of the Russian Academy of Medical Sciences

Email: tata-sosnovka@mail.ru
Russian Federation, 8, Baltiyskaya street, Moscow, 125315

M. A. Yarkova

State Foundation Institute of Pharmacology of the Russian Academy of Medical Sciences

Email: tata-sosnovka@mail.ru
Russian Federation, 8, Baltiyskaya street, Moscow, 125315

T. A. Gudasheva

State Foundation Institute of Pharmacology of the Russian Academy of Medical Sciences

Author for correspondence.
Email: tata-sosnovka@mail.ru

Сorresponding Member of the RAS

Russian Federation, 8, Baltiyskaya street, Moscow, 125315

S. B. Seredenin

State Foundation Institute of Pharmacology of the Russian Academy of Medical Sciences

Email: tata-sosnovka@mail.ru

Аcademician of the RAS

Russian Federation, 8, Baltiyskaya street, Moscow, 125315

References

Supplementary files