Разработка метода выделения лизоцима из слюны человека

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Доступ платный или только для подписчиков

Аннотация

Введение. Растущая антибиотикорезистентность диктует необходимость поиска альтернативных антимикробных препаратов. Среди перспективных прототипов – антимикробные полипептиды, в том числе лизоцим. Существующие методы выделения лизоцима человека менее разработаны в сравнении с методами получения лизоцима из других видовых источников.

Цель исследования – разработка простого и быстрого метода выделения лизоцима из слюны человека, который может быть реализован в условиях лабораторий, специализирующихся на биохимии пептидов и низкомолекулярных белков.

Материал и методы. Слюну человека обрабатывали NaCl, центрифугировали, пропускали через фильтры с диаметром пор

0,45 мкм, подвергали двухступенчатой твердофазной экстракции на картриджах C18 (элюция 20%-ным и 60%-ным ацетонитрилом), а также обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке C18 в градиенте ацетонитрила и рехроматографии. Гомогенность и соответствие молекулярной массы лизоцима подтверждали электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Ферментативную активность устанавливали с помощью турбидиметрического анализа в присутствии Micrococcus lysodeikticus. Наличие антимикробной активности выявляли методом наложения геля после электрофореза в кислой системе на гель с бактерией Listeria monocytogenes.

Результаты. Обработка слюны 62,5–1000 мМ NaCl не влияла на содержание общего белка в супернатантах после центрифугирования. Обработанную 0,5 М NaCl и профильтрованную слюну подвергали двухступенчатой твердофазной экстракции. После отделения компонентов, элюирующихся 20%-ным ацетонитрилом, использовали компоненты, элюирующиеся при 60% аце-тонитрила, для проведения высокоэффективной жидкостной хроматографии, в результате которой получили мажорный пик. Фракции, соответствующие мажорному пику, использовали для дополнительной очистки и анализа. Полученный препарат содержал белок, по молекулярной массе соответствующий лизоциму. Белок обладал мурамидазной активностью в отношении клеточных стенок M. lysodeikticus и антимикробной активностью в отношении L. monocytogenes.

Выводы. В настоящей работе удалось разработать простой метод выделения лизоцима из слюны человека (около 5 мкг очищенного белка из 1 мл слюны). Протокол сохраняет важнейшие биологические свойства лизоцима.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

И. А. Кренев

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»

Автор, ответственный за переписку.
Email: il.krenevv13@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-7970-3291
SPIN-код: 1411-0962

аспирант, мл. науч. сотрудник, отдел общей патологии и патологической физиологии

Россия, Санкт-Петербург, 197022, ул. Акад. Павлова, 12

М. Н. Берлов

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»

Email: berlov.mn@iemspb.ru
ORCID iD: 0000-0001-5191-0467
SPIN-код: 9006-6127

кандидат биологических наук, ст. науч. сотрудник, отдел общей патологии и патологической физиологии

 

Россия, Санкт-Петербург, 197022, ул. Акад. Павлова, 12

Список литературы

  1. Ventola C.L. The Antibiotic Resistance Crisis: Part 1: Causes and Threats. P & T. 2015;40(4): 277–283.
  2. Ventola C.L. The Antibiotic Resistance Crisis: Part 2: Management Strategies and New Agents. P & T. 2015; 40(5): 344–352.
  3. Ghosh C., Sarkar P., Issa R., Haldar J. Alternatives to Conventional Antibiotics in the Era of Antimicrobial Resistance. Trends in Microbiology. 2019; 27(4): 323–338. doi: 10.1016/j.tim.2018.12.010.
  4. Fleming A. On a Remarkable Bacteriolytic Element Found in Tissues and Secretions. Proceedings of the Royal Society of Lon-don. Series B. 1922; 93: 306–317. doi: 10.1098/rspb.1922.0023.
  5. Ragland S.A., Criss A.K. From Bacterial Killing to Immune Modulation: Recent Insights into the Functions of Lysozyme. PLoS Pathogens. 2017; 13(9): e1006512. doi: 10.1371/jour-nal.ppat.1006512.
  6. Ferraboschi P., Ciceri S., Grisenti P. Applications of Lysozyme, an Innate Immune Defense Factor, as an Alternative Antibiotic. Antibiotics (Basel). 2021; 10(12): 1534. doi: 10.3390/antibiotics10121534.
  7. Shahmohammadi A. Lysozyme Separation from Chicken Egg White: a Review. European Food Research and Technology. 2018; 244: 577–593. doi: 10.1007/s00217-017-2993-0.
  8. Liu B.L., Ooi C.W., Ng I.S. et al. Effective Purification of Lysozyme from Chicken Egg White by Tris(hydroxyme-thyl)amino-methane Affinity Nanofiber Membrane. Food Chemistry. 2020; 327: 127038. doi: 10.1016/j.food-chem.2020.127038.
  9. Yao X., Du T., Guo J. et al. Extraction and Characterization of Lysozyme from Salted Duck Egg White. Foods. 2022; 11(22): 3567. doi: 10.3390/foods11223567.
  10. Mohamed R., Campbell J.L., Cooper-White J. et al. The Impact of Saliva Collection and Processing Methods on CRP, IgE, and Myoglobin Immunoassays. Clinical and Translational Medicine. 2012; 1(1): 19. doi: 10.1186/2001-1326-1-19.
  11. Jenzano J.W., Hogan S.L., Lundblad R.L. Factors Influencing Measurement of Human Salivary Lysozyme in Lysoplate and Turbidimetric Assays. Journal of Clinical Microbiology. 1986; 24(6): 963–967. doi: 10.1128/jcm.24.6.963-967.1986.
  12. Bradford M.M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Analytical Biochemistry. 1976; 72: 248–254. doi: 10.1006/abio.1976.9999.
  13. Schägger H., von Jagow G. Tricine-Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis for the Separation of Pro-teins in the Range from 1 to 100 kDa. Analytical Biochemistry. 1987; 166(2): 368–379. doi: 10.1016/0003-2697(87)90587-2.
  14. Mörsky P. Turbidimetric Determination of Lysozyme with Micrococcus lysodeikticus Cells: Reexamination of Reaction Conditions. Analytical Biochemistry. 1983; 128(1): 77–85. doi: 10.1016/0003-2697(83)90347-0.
  15. Lehrer R.I., Rosenman M., Harwig S.S. et al. Ultrasensitive Assays for Endogenous Antimicrobial Polypeptides. Journal of Immunological Methods. 1991; 137(2): 167–173.
  16. doi: 10.1016/0022-1759(91)90021-7.
  17. Panyim S., Chalkley R. The Heterogeneity of Histones. I. A Quantitative Analysis of Calf Histones in Very Long Polyacrylamide Gels. Biochemistry. 1969; 8(10): 3972–3979. doi: 10.1021/bi00838a013.
  18. Schipper R.G., Silletti E., Vingerhoeds M.H. Saliva as Research Material: Biochemical, Physicochemical and Practical Aspects. Archives of Oral Biology. 2007; 52(12): 1114–1135. doi: 10.1016/j.archoralbio.2007.06.009.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Профиль элюции, полученный в ходе проведения твердофазной экстракции обработанной слюны. Объем каждой фракции – 5 мл

Скачать (50KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Результаты ОФ-ВЭЖХ препарата, полученного в ходе твердофазной экстракции обработанной слюны человека

Скачать (41KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Результаты очистки лизоцима человека с помощью ОФ-ВЭЖХ

Скачать (41KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Результаты аналитического электрофореза лизоцима человека в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях в присутствии SDS: st – стандарт молекулярных масс; 1 – лизоцим куриного яйца; 2 – полученный препарат лизоцима слюны человека

Скачать (140KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Результаты оценки ферментативной активности полученного препарата лизоцима турбидиметрическим методом

Скачать (36KB)
Метаданные
7. Рис. 6. Результаты электрофореза в полиакриламидном геле кислой системе и антимикробного теста методом наложения геля: 1 – дорожка на полиакриламидном геле с полученным препаратом лизоцима человека; 2 – агарозный гель с бактерией на чашке Петри, содержащий две зоны ингибирования; 3 – дорожка на полиакриламидном геле с полученным препаратом лизоцима человека после наложения на агарозный гель; 4 – лизоцим куриного яйца. Всюду верхняя белковая полоса содержит димеры лизоцима, нижняя – мономеры лизоцима

Скачать (134KB)
Метаданные

© ИД "Русский врач", 2025