Система контроля качества пробоподготовки и результатов анализа при диагностике вирусных гепатитов В и С методом ПЦР в реальном времени

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Доступ платный или только для подписчиков

Аннотация

Введение. При проведении диагностических исследований на вирусоносительство критическое значение имеет предотвращение получения ложноотрицательных результатов. Для этого необходимо тщательно контролировать как все этапы процесса пробоподготовки, так и качество проведения самой диагностической реакции.

Цель работы – создание оптимального сочетания экзогенного контроля качества пробоподготовки и систем для детекции вирусов гепатитов В и С методом мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени для улучшения точности, воспроизводимости и надежности результатов.

Материал и методы. Объект исследования – выделенная ДНК вируса гепатита B и РНК вируса гепатита C из образцов плазмы крови от пациентов с подтверждёнными диагнозами. Для выполнения исследования in silico использовали: онлайн-ресурс Primer-BLAST, интегрированный в базу данных NCBI; онлайн-сервис OligoAnalyzer Tool Oligo 7 (Integrated DNA Technologies), а также программы Oligo Primer Analysis Software, Clustal Omega и UGENE. Для проведения ПЦР в реальном времени прменяли амплификатор CFX96 Touch (Bio-Rad Laboratories, США). В ходе работы использовали набор для выделения нуклеиновых кислот МагноПлюс-НК-Био (ГК «Алкор Био», Россия). Процесс автоматического выделения проводили на станции Auto-Pure96 (Allsheng, Китай). ПЦР осуществляли с помощью наборов «Интифика ВГВ» и «Интифика ВГС» (ГК «Алкор Био», Россия).

Результаты. Разработана стабильная и устойчивая мультиплексная ПЦР-система для контроля качества пробоподготовки и диагностики вирусных гепатитов В и С при анализе плазмы крови человека. Показано, что использование термодинамического анализа при дизайне праймеров и зондов способствует повышению эффективности работы ПЦР-систем, а также повышает чувствительность и исключает ложноположительные результаты.

Выводы. Тщательная оптимизация характеристик праймеров и зондов при сочетании детекции экзогенного внутреннего контроля и вирусов в мультиплексной реакции значительно улучшает точность, воспроизводимость и надежность результатов анализа.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

А. С. Мороз

ФГАОУ ВО «Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого»; ГК «Алкор Био»

Автор, ответственный за переписку.
Email: anny-nice@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4693-623X
SPIN-код: 4721-1020

аспирант, Высшая школа биотехнологий и пищевых производств; инженер-исследователь

Россия, 194021, Санкт-Петербург, ул. Новороссийская, 48; 192148, Санкт-Петербург, Железнодорожный пр., 40а

В. А. Торопов

ГК «Алкор Био»

Email: anny-nice@mail.ru
ORCID iD: 0009-0005-1993-5572

ведущий инженер-исследователь

Россия, 192148, Санкт-Петербург, Железнодорожный пр., 40а

В. Н. Большаков

ФГАОУ ВО «Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого»; ГК «Алкор Био»

Email: anny-nice@mail.ru
ORCID iD: 0009-0007-5126-6035

к.б.н., доцент, доцент Высшей школы биотехнологий и пищевых производств;  руководитель лаборатории молекулярной диагностики

Россия, 194021, Санкт-Петербург, ул. Новороссийская, 48; 192148, Санкт-Петербург, Железнодорожный пр., 40а

Е. Б. Аронова

ФГАОУ ВО «Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого»

Email: anny-nice@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4376-2972
SPIN-код: 7288-6820

к.т.н., доцент, доцент Высшей школы биотехнологий и пищевых производств

Россия, 194021, Санкт-Петербург, ул. Новороссийская, 48

Список литературы

  1. Фаенко А.П., Филиппова А.А., Голосова С.А. и др. Внедрение лабораторного исследования на анти-НВсоге у доноров крови. Гематология и трансфузиология. 2022; 67(4): 525–534. [Faenko A.P., Filippova A.A., Golosova S.A. i dr. The introduction of Laboratory testing for anti-HBcore in blood donors. Gematologiya i transfuziologiya. 2022; 67(4): 525–534. (In Russ.)]. doi: 10.35754/0234-5730-2022-67-4-525-534.
  2. Останкова Ю.В., Серикова Е.Н., Семенов А.В. и др. Молекулярно-генетическая характеристика полнораз-мерного генома вируса гепатита В у HBsAg-негативных доноров крови в Уральском федеральном округе. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2022; 99(6): 637–650. [Ostankova Yu.V., Serikova E.N., Semenov A.V. i dr. Molecular and genetic characterization of the hepatitis B virus full-length genome sequences identified in HBsAg-negative blood donors in Ural Federal District. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2022; 99(6): 637–650. (In Russ.)]. DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-325.
  3. Хорькова Е.В., Лялина Л.В., Микаилова О.М. и др. Актуальные вопросы эпидемиологического надзора за хроническими вирусными гепатитами B, C, D и гепатоцеллюлярной карциномой на региональном уровне. Здоровье населения и среда обитания. 2021;29(8):76-84. [Khorkova E.V., Lyalina L.V., Mikailova O.M. i dr. Current issues of epidemiological surveillance of chronic viral hepatitis B, C, D and hepatocellular carcinoma at the regional level. Zdorov'e naseleniya i sreda obitaniya. 2021;29(8):76-84. (In Russ.)]. doi: 10.35627/2219-5238/2021-29-8-76-84.
  4. Волков А.Н., Начева Л.В. Молекулярно-генетические методы в практике современных медико-биологических исследований. ЧАСТЬ III: генодиагностика человека при решении медицинских задач. Фундаментальная и клиническая медицина. 2021; 6(3): 100–109. [Volkov A.N., Nacheva L.V. Molecular genetic methods in biomedical research. Part III: human gene diagnostics in clinical practice. Fundamental'naya i klinicheskaya meditsina. 2021; 6(3): 100–109. (In Russ.)]. doi: 10.23946/2500-0764-2021-6-3-100-109.
  5. Aydogan S., Acikgoz Z.C, Gozalan A. et al. Comparison of a novel real-time PCR method (RTA) and Artus RG for the quantification of HBV DNA and HCV RNA. J Infect Dev Ctries. 2017; 11(7): 543–548. doi: 10.3855/jidc.8363.
  6. Tan B., Qin L., Chen C. et al. Multiplex fluorescence quantitative polymerase chain reaction for simultaneous detection of hepatitis B virus, hepatitis C virus and human immunodeficiency virus. Clin Lab. 2015; 61(1-2): 53–59. doi: 10.7754/clin.lab.2014.131102.
  7. Оскорбин И.П., Шевелёв Г.Ю., Проняева К.А. и др. Вы-явление РНК SARS-CoV2 с помощью мультиплексной изо-термической петлевой амплификации с обратной транс-крипцией методом анализа кривых плавления. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтичес-кой химии. 2020; 23(12): 3−10. [Oscorbin I.P., Shevelev G.Yu., Pronyaeva K.A. i dr. Detection of SARS-CoV2 RNA using multiplex reverse transcription loop-mediated isothermal amplification with melting curve analysis. Voprosy biologicheskoi, meditsinskoi i farmatsevticheskoi khimii. 2020; 23(12): 3–10. (In Russ.)]. doi: 10.29296/25877313-2020-12-01.
  8. Da Silva M.C.C., De Abreu L.C.L., Do Carmo F.A. et al. Development of a validation protocol method for nucleic acid testing to detect human immunodeficiency virus, hepatitis C virus, and hepatitis B virus. An Acad Bras Cienc. 2022; 94(3). doi: 10.1590/0001-3765202220211321.
  9. Martínez-Santolaria M., Sota-Diez C., García-Manrique B. et al. A-300 Evaluation of Different Storage Conditions of Nasopharyngeal Swabs for the Detection of Influenza A, Influenza B and RSV. Clinical Chemistry. 2023; 69(1). doi: 10.1093/clinchem/hvad097.265.
  10. Cheung H.W., Wong K.S., Lin V.Y.C. et al. Optimization and implementation of four duplex quantitative polymerase chain reaction assays for gene doping control in horseracing. Drug Test Anal. 2022; 14(9): 1587–1598. doi: 10.1002/dta.3328.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Термодинамическая стабильность для праймеров F_x20 (А) и F_x16 (Б). По оси абсцисс – протяжённость олигонуклеотида, по оси ординат – ΔG

Скачать (33KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Влияние термодинамических характеристик праймеров на чувствительность и специфичность детекции вируса гепатита С в образцах с различной вирусной нагрузкой. (А) – обсчёт кривых амплификации методом регрессии; (Б) – результат амплификации в логарифмических координатах. По оси абсцисс – циклы амплификации, по оси ординат – интенсивность сигнала амплификации. Кривые результатов амплификации образцов: 1 –с высокой вирусной нагрузкой (2,5·104 МЕ/мкл) для системы с прямым праймером F_x20 без термодинамически стабильных вторичных структур; 2 –с низкой вирусной нагрузкой (5·102 МЕ/мкл) для системы с прямым праймером F_x20 без термодинамически стабильных вторичных структур; 3 –с высокой вирусной нагрузкой (2,5·104 МЕ/мкл) для системы с прямым праймером F_x16 с термодинамически стабильными вторичными структурами, отжигающимся на участок НК с термодинамически стабильной вторичной структурой; 4 –с низкой вирусной нагрузкой (5·102 МЕ/мкл) для системы с прямым праймером F_x16 с термодинамически стабильными вторичными структурами, отжигающимся на участок НК с термодинамически стабильной вторичной структурой)

Скачать (59KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Результаты детекции вируса гепатита С мультиплексной термодинамически сбалансированной ПЦР-системой с использованием внутреннего контрольного образца. Кривые амплификации: 1 – концентрированная матрица вируса гепатита C; 2 – разбавленная матрица вируса гепатита C: 3 – внутренний контрольный образец; 4 – отрицательный контрольный образец. По оси абсцисс – циклы амплификации, по оси ординат – интенсивность сигнала амплификации

Скачать (105KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Результаты детекции вируса гепатита В мультиплексной термодинамически сбалансированной ПЦР-системой с использованием внутреннего контрольного образца. Кривые амплификации концентрированной и разбавленной матрицы ДНК вируса гепатита B для системы праймеров и зондов, разработанных с учётом термодинаических расчётов: 1 – концентрированная матрица вируса гепатита B; 2 – разбавленная матрица вируса гепатита B; 3 – внутренний контрольный образец; 4 – отрицательный контрольный образец. По оси абсцисс – циклы амплификации, по оси ординат – интенсивность сигнала амплификации

Скачать (86KB)
Метаданные

© ИД "Русский врач", 2025