SEDATIVE EFFECT OF U-49900 (3,4-DICHLORO-N-(2-(DIETHYLAMINO)CYCLOHEXYL)-N-METHYL-BENZAMIDE) IN ADULT ZEBRAFISH
- Authors: Kolesnikova T.O.1, Shevyrin V.1, Khatsko S.L.2, Kalueff A.3
-
Affiliations:
- Sirius University of Science and Technology
- Ural Federal University
- Saint-Petersburg State University
- Section: Neuropsychopharmacology
- URL: https://journals.eco-vector.com/1606-8181/article/view/627411
- DOI: https://doi.org/10.17816/phbn627411
- ID: 627411
Cite item
Full Text
Abstract
U-49900 is a chemical analogue of a selective μ-opioid receptor agonist U-47700. Despite the growing abuse of synthetic opioids, including U-49900, its psychopharmacological and toxicological profiles remain poorly understood. The zebrafish (Danio rerio) is a promising model organism in neuroscience, and is often used for the psychopharmacological evaluation of neurotropic drugs. The psychopharmacological profile of U-49900 was evaluated here in adult zebrafish at 1, 5, 10 and 25 mg/l (water immersion) tested in the novel tank test. U-49900 at 25 mg/l for 20 min reduces the distance traveled and the number of top entries in the novel tank test (p<0.001 vs. control group), but unalters other parameters in this test. Overall, the sensitivity of zebrafish to synthetic non-fentanyl opioids like U-49900 suggests the possibility of developing high-throughput screening platforms for finding effective therapies for pathological conditions caused by synthetic opioids.
Keywords
Full Text
Введение
Опиоиды, в том числе нефентаниловые циклогексилбензамиды, являются часто употребляемыми наркотическими веществами [1]. Препарат 3,4-дихлор-N-(2-(диэтиламино)циклогексил)-N-метилбензамид (U-49900) (Рис. 1) представляет собой аналог синтетического опиоида U-47700, вызывающий у человека абстиненцию и (при хроническом использовании) потерю вкуса, обоняния и осязания [2]. Данное соединение внесено в список сильнодействующих и наркотических средств во многих странах [3], включая США, Швецию, Испанию [2] и (с 2017 г.) Россию. Ввиду растущего злоупотребления опиатов в мире [1], их изучение становится важной биомедицинской задачей, в том числе в клинических и доклинических исследованиях. Однако, несмотря на данные об эффектах U-47700 у грызунов [2], сведения об эффектах его аналога U-49900 на животных моделях практически отсутствуют.
Наряду с грызунами, в доклиническом скрининге химических соединений широко используется рыба зебраданио (zebrafish, Danio rerio), ставшая незаменимым модельным объектом в биомедицине. Наряду с малой стоимостью, быстрым развитием, прозрачностью эмбрионов, морфологической, физиологической и генетической гомологией с человеком [4], а также чувствительностью к основным классам препаратов, зебраданио также демонстрируют обучение [5], социальность [6] и сложное поведение [7]. Ввиду отсутствия данных о нейротропных эффектах U-49900, целью настоящего исследования явилось изучение его воздействия при остром введении на поведение и двигательную активность взрослых рыб зебраданио.
Методы исследования
Анализ взаимосвязи структуры и активности является ключевым для прогнозирования биологических свойств химических соединений базой данных PASSOnline, которая с точностью > 96% предсказывает фармакологические профили лекарств, механизм действия, взаимодействия мишеней и побочные/токсические эффекты на основе библиотеки более 1 миллиона биологически активных веществ [8]. В работе был проанализирован U-49900 с использованием этого подхода для оценки рассчитанной вероятности (Pa) конкретных биологических активностей.
В исследовании было использовано 83 зебраданио аутбредной популяции коротно-плавникового дикого типа обоего пола возрастом 4–6 месяцев, полученные от местного поставщика (Zootrade, Inc., Екатеринбург). Рыбы были акклиматизированы в течение не менее двух недель до начала экспериментов и содержались группами по 40 особей в 40-литровых аквариумах, заполненных чистой фильтрованной водой (температура 25 ± 1 ◦C, pH 7.4). Освещение (950−960 люкс) обеспечивалось потолочными светильниками, а световой день составлял 12-часов (9:00-21:00 ч [9]). Экспериментальные животные ранее не были использованы в других экспериментах, и кормились стандартным кормом (хлопьями Tetramin для аквариумных рыб) дважды в день. Выбор беспородной популяции дикого типа для настоящего исследования был основан на соображениях популяционной валидности и ее значимости для настоящего исследования. Вкратце, хотя генетически контролируемые модели (например, инбредные линии рыб зебраданио) могут быть более воспроизводимой и надежной системой для нейрогенетических исследований, моделирование нарушений ЦНС на животных подразумевает воспроизведение «реальных» болезней мозга человека, затрагивающих генетически гетерогенные популяции. Таким образом, использование аутбредной линии рыб в данной работе обосновано с популяционной и трансляционной точек зрения.
Эксперименты проводили с 10:00 до 17:00 в тесте «нового аквариума», хорошо валидированном для анализа локомоторных и других поведенческих фенотипов зебраданио [10]. Перед тестированием проводили инкубацию рыб по 1 штуке в пластиковом стакане емкостью 0.5 л в течение 20 минут в растворе, содержащем U-49900 в разных концентрациях, растворенном в 0.1% диметилсульфоксиде (ДМСО), в данной концентрации не влияющем на поведение зебраданио [11]. Контрольные рыбы подвергались действию раствора ДМСО без препарата. Вещество U-49900 (Россия) было получено от таможенной службы РФ в рамках исследовательских контрактов с Уральским федеральным университетом.
Экспериментальные животные были случайным образом разделены на контрольную и экспериментальные группы 1, 5, 10 и 25 мг/л (n = 16–19 в группе). Исследуемые концентрации были выбраны на основе собственных пилотных экспериментов по тестированию широкого диапазона острых эффектов U-49900 на зебраданио. Стандартная 20-минутная экспозиция была выбрана на основе опыта работы с различными психотропными препаратами.
После инкубации с препаратом поведение рыб исследовали в тесте «нового аквариума», аппарат которого составлял прямоугольный резервуар объемом 1.5 л (15 × 20 × 5см), заполненный водой и разделенный на две равные части виртуальной горизонтальной линией. Поведение рыб записывали на веб-камеру SJ4000 и полученные материалы обрабатывали в программе RealTimer (Open Science, Ltd., Красногорск, Россия). Оценивали количество, продолжительность (с) и латентный период эпизодов замирания (фризинга), латентный период (с) первого выхода в верхнюю часть аквариума, количество выходов наверх и их общая продолжительность (с), а также количество беспорядочных движений (хаотичные движения с высокой скоростью и ускорением, являющиеся маркером тревожного поведения) [12]. Фризинг определяли, как полное отсутствие движений рыбы, за исключением движения жаберных крышек и глаз, более 2 с. Для оценки уровня двигательной активности, общее пройденное расстояние (м), число и продолжительность состояний высокой подвижности, подсчитывали с помощью программы Noldus Ethovision XT11 (Wageningen, Netherlands). Траектории движения зебраданио были также построены в Ethovision XT11 и сохранены в формате JPEG для наглядной иллюстрации пространственных паттернов активности рыб. Полулетальную дозу ЛД50 препарата определяли путем инкубации групп из 30 рыб в различных концентрациях в течение 24 часов.
Сравнение групп проводили в программе Statistica10.0 непараметрическим критерием Краскела-Уоллеса с последующим попарным сравнением рангов групп с помощью теста Манна-Уитни с поправкой Бонферрони. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. Различия считали статистически значимыми при значении p < 0,05.
.
Препарат U-49900 демонстрирует выраженную нейротропность в тесте «нового аквариума», статистически достоверно влияя на ряд параметров поведения зебраданио, которые отражают уровень их локомоторной активности (Рис. 1, Табл. 1). В частности, в концентрации 25 мг/л U-49900 на 95,79% уменьшилась частота выходов зебраданио в верхнюю часть аквариума без изменения продолжительности и латентного периода выхода, что свидетельствует о снижении уровня локомоции рыб после воздействия вещества. В концентрации 25 мг/л U-49900 наблюдалось также 75 %-ное уменьшение общей пройденной дистанции по сравнению с контрольной группой, подтверждая седативный профиль данного препарата. При этом не наблюдалось значимых различий в частоте отражающих тревожность беспорядочных движений и фризинга во всех группах (Табл. 1). ЛД50 для тестируемого препарата U-49900 составила 15 мг/л.
Рисунок 1. Влияние U-49900 (вверху слева) на паттерны плавания рыб в тесте «новый аквариум»
Таблица 1. Влияние U-49900 на поведенческие реакции зебраданио в 5-минутном тесте «нового аквариума»
Показатель | Контроль (n=16) | 1 мг/л (n=16) | 5 мг/л (n=16) | 10 мг/л (n=16) | 25 мг/л (n=15) | Значение критерия Краскела-Уоллиса H(4,79), р |
Параметры, подсчитанные с помощью программного обеспечение Ethovision XT | ||||||
Пройденная дистанция, м | 19,0±1 | 17,0±0,9 | 15,7±0,9 | 15,0±0,1 | 0,8±0,1 *** # @A | 37,5, p = 0,00001 |
Параметры, подсчитанные с помощью программного обеспечение RealTimer | ||||||
Частота выходов наверх | 28,0±4,6 | 19,0±2,6 | 17,0±2,8 | 17,0±2,7 | 7,0±1,6***#A | 23,3, p = 0,0001 |
Продолжительность выходов наверх, с | 99,0±10,8 | 77,0±12,4 | 78,0±16,6 | 78,0±12,6 | 53,0±17 | 7,8, p = 0,1 |
Общее количество хаотических движений | 1,2±0,8 | 1,1±0,5 | 0,9±0,3 | 0,9±0,7 | 0,0±0,0##@ | 11,9, p = 0,02 |
Число актов фризинга | 0,1±0,1 | 0,1±0,1 | 0,0±0,0 | 0,3±0,2 | 1,6±0,6# | 21,2, p = 0,0003 |
Суммарная продолжительность фризинга, с | 2,5±2,5 | 2,2±2,2 | 0,0±0,0 | 23,0±15,0 | 52,0±22,0#A | 20,0 p = 0,0005 |
Латентный период выхода в верхнюю часть аквариума, с | 47,0±9,6 | 62,0±14,3 | 58,0±13,0 | 76,0±13,4 | 50,0±22,0 | 9,4, p = 0,05 |
Латентный период фризинга, с | 282,0±18,0 | 282±17,6 | 300,0±0,0 | 248,0±28,3 | 143,0±39,0#@ | 22,2, p = 0,0002 |
***р<0.001 против контроля, #р<0.05 против группы 1 мг/л, ##р<0.01 против группы 1 мг/л, @р<0.05 против группы 5 мг/л, A р<0.05 против группы 10 мг/л, тест Краскела-Уоллиса с последующим тестом Манна-Уитни с поправкой Бонферрони для попарного сравнения групп. Данные представлены как среднее±стандартная ошибка среднего.
Интересно, что по сравнению с острым введением морфина, который у зебраданио проявляет поведенческую активность при концентрации 2 мг/л [13], острое введение U-49900 снижает активность рыб в концентрации 25 мг/л (Рис. 1), подтверждая сравнительно более слабую активность последнего в ЦНС у зебраданио. Более того, высокие концентрации морфина (10 и 30 мг/л) не влияют на локомоцию зебраданио [14], однако в концентрации 25 мг/л U-49900 вызвал седацию в настоящем исследовании (Рис. 1), вследствие чего можно предположить его большую эффективность в высоких дозах по сравнению с морфином.
Проведенный компьютерный анализ химической структуры U-49900 с использованием базы данных PASSOnline предсказал (Табл. 2), что с высокой вероятностью (Pa>60%) U-49900 обладает анксиолитическими свойствами, что в целом согласуется с его наблюдаемым седативным действием на зебраданио (Табл. 1).
Таблица 2. Вероятности биологической активности (Ра) препарата U-49900, рассчитанные с помощью базы данных PASSOnline (www.way2drug.com/passonline/)
Pa | Биологическая активность |
0.910 | Антифобическое действие |
0.890 | Ингибитор тауриндегидрогеназы |
0.826 | Ингибитор НАДФН-пероксидазы |
0.771 | Ингибитор гликозилфосфатидилинозитол фосфолипазы D |
0.783 | Ингибитор убихинол-цитохром-с-редуктазы |
0.735 | Ингибитор фосфолипид-транслоцирующей АТФазы |
0.707 | Ингибитор L-глутаматоксидазы |
0.671 | Ингибитор 5-O-(4-кумароил)-D-хинат-3'-монооксигеназы |
0.631 | Ингибитор (S)-6-гидроксиникотиноксидазы |
0.613 | Ингибитор сульфитоксидазы |
0.587 | Ингибитор камфор-1,2-монооксигеназы |
0.592 | Ингибитор белка, ассоциированного с центромерой |
0.601 | Анксиолитическое (противо-невротическое) действие |
0.538 | Активатор кальциевых каналов |
Несмотря на обнаружение выраженных нейротропных седативных эффектов U-49900 (Рис. 1, Табл. 1), настоящее исследование имеет несколько ограничений. Например, не исследовалось его потенциальное молекулярное, геномное и протеомное воздействие U-49900 на зебраданио, а также индивидуальные различия [15]. В будущем целесообразно оценить эффекты хронического воздействия U-49900 на рыбах, грызунах и человека, а также сопоставить возможное привыкание и развитие синдрома отмены, особенно в контексте опиодиергических эффектов препарата. Также целесообразен систематический анализ нейрохимических и фармакокинетических процессов в мозге зебраданио (например, через 1, 2, 6, 12, 24 и 48 часов после воздействия) для низких, средних и высоких доз в будущих доклинических исследованиях U-49900.
Еще один фактор – возможная потенциальная острая неспецифическая токсичность U-49900. Например, в пилотных исследованиях U-49900 нами не выявлено токсичности при 25 мг/л, однако показана летальность 80–100% при 50–100 мг/л после однократного острого 60-минутного воздействия (данные не показаны). Кроме того, после однократного острого 20-минутного введения 50-100 мг/л наблюдались выраженная атаксия и седативный эффект, а оцененная в настоящей работе ЛД50 препарата составляет 15 мг/л при 24-часовой экспозиции1. Таким образом, преобладание седативного эффекта при остром воздействии нарастающих доз U-49900 на зебраданио могло маскировать анксиолитические эффекты этого препарата. Однако, поскольку острые дозы морфина и других опиоидов в малых количествах вызывают анксиолитические эффекты у людей [16], в дальнейшем требуется оценка более широкого диапазона низких доз этого вещества, чтобы оценить потенциальное анксиолитическое действие при однократном введении.
В целом, седативный эффект U-49900 у взрослых зебраданио в концентрации 25 мг/л (Рис. 1, Табл. 1) аналогичен эффектам U-47700, что позволяет предполагать не только химическое, но и фармакологическое сходство данных синтетических опиоидов [17], требуя дальнейших исследований данных препаратов. Способность U-49900 вызывать выраженные нейротропные седативные эффекты у зебраданио также согласуются с клиническими и доклиническими данными о синтетических препаратах, подчеркивая важность доклинического скрининга химических соединений на рыбах. Учитывая высокую консервативность мишеней для лекарств и сходство основных молекулярных сетей между рыбами, людьми и грызунами [18], разработка скрининговых платформ на основе зебраданио может стать важной стратегией поиска путей терапии состояний, вызванных приемом синтетических препаратов [19].
Заключение
Таким образом, вещество U-49900 в концентрации 25 мг/л в течение 20 минут на 95,79% снижает пройденную дистанцию и на 75% количество выходов в верхнюю часть аквариума в тесте «нового аквариума» (р<0,001) по сравнению с контрольной группой. Данный фенотип свидетельствует о седативном действии препарата на взрослых зебраданио. Препарат во всех исследуемых концентрациях не оказал влияния на другие параметры в тесте «нового аквариума», однако демонстрирует ЛД50 15 мг/л при 24-часовой инкубации. Проведенный in siliсo анализ U-49900 при помощи базы данных PASSOnline указывает на возможность анксиолитических свойств препарата, что косвенно соответствует его обнаруженной седативности, и требует дальнейшего исследования.
About the authors
Tatyana O. Kolesnikova
Sirius University of Science and Technology
Email: philimontani@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5561-8583
SPIN-code: 8558-7887
Research Associate
Russian Federation, SochiVadim Shevyrin
Email: vadim.shevyrin@gmail.com
Sergey L. Khatsko
Ural Federal University
Email: hardscore@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5921-6680
SPIN-code: 4973-7083
Research Associate
Russian Federation, YekaterinburgAllan Kalueff
Saint-Petersburg State University
Author for correspondence.
Email: avkalueff@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-7525-1950
Doctor of Biological Sciences, Professor of the Russian Academy of Sciences, Professor, Head of Laboratory of Biological Psychiatry
Russian Federation