Sedative effect of U-49900 (3,4-dichloro-N- (2-(diethylamino)cyclohexyl)-N-methyl-benzamide) in adult Zebrafish

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Опиоиды, в том числе нефентаниловые циклогексилбензамиды, часто употребляемые наркотические вещества [1]. Препарат 3,4-дихлор-N-(2-(диэтиламино)циклогексил)-N-метилбензамид (U-49900) (рис.) представляет собой аналог синтетического опиоида U-47700, вызывает у человека абстиненцию и (при хроническом использовании) потерю вкуса, обоняния и осязания [2]. Данное соединение внесено в список сильнодействующих и наркотических средств во многих странах [3], включая США, Швецию, Испанию [2] и (с 2017 г.) Россию. Ввиду растущего злоупотребления опиатов в мире [1] их изучение становится важной биомедицинской задачей, в том числе в клинических и доклинических исследованиях. Однако, несмотря на данные об эффектах U-47700 у грызунов [2], сведения о действии его аналога U-49900 на животных моделях практически отсутствуют.

Наряду с грызунами, в доклиническом скрининге химических соединений широко используют рыбу зебраданио (zebrafish, Danio rerio), ставшую незаменимым модельным объектом в биомедицине. Наряду с невысокой стоимостью, быстрым развитием, прозрачностью эмбрионов, морфологической, физиологической и генетической гомологией с человеком [4], а также чувствительностью к основным классам препаратов, зебраданио также демонстрируют обучение [5], социальность [6] и сложное поведение [7]. В силу отсутствия данных о нейротропных эффектах U-49900 цель настоящего исследования состояла в изучении его воздействия при остром введении на поведение и двигательную активность взрослых рыб зебраданио.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Анализ взаимосвязи структуры и активности имеет ключевое значение для прогнозирования биологических свойств химических соединений в базе данных PASSOnline, которая с точностью более 96 % предсказывает фармакологические профили лекарств, механизм действия, взаимодействия мишеней и побочные/токсические эффекты на основе библиотеки более 1 млн биологически активных веществ [8]. В работе проанализировано соединение U-49900 с использованием этого подхода для оценки рассчитанной вероятности (Pa) конкретных биологических активностей.

В исследовании использовано 83 зебраданио аутбредной популяции короткоплавникового дикого типа обоего пола в возрасте 4–6 мес., полученные от местного поставщика (Zootrade, Inc., Екатеринбург). Рыбы были акклиматизированы в течение не менее двух недель до начала экспериментов и содержались группами по 40 особей в 40-литровых аквариумах, заполненных чистой фильтрованной водой (температура — 25 ± 1 °С, pH 7,4). Освещение (950−960 люкс) обеспечивали потолочными светильниками, а световой день составлял 12 ч (09:00–21:00 [9]). Экспериментальных животных ранее не применяли в других экспериментах, кормили стандартным кормом (хлопьями Tetramin для аквариумных рыб) дважды в день. Выбор беспородной популяции дикого типа для настоящего исследования был основан на соображениях популяционной валидности и ее значимости для настоящего исследования. Хотя генетически контролируемые модели (например, инбредные линии рыб зебраданио) могут быть более воспроизводимой и надежной системой для нейрогенетических исследований, моделирование нарушений центральной нервной системы на животных подразумевает воспроизведение «реальных» болезней мозга человека, затрагивающих генетически гетерогенные популяции. Таким образом, использование аутбредной линии рыб в данной работе обосновано с популяционной и трансляционной точек зрения.

Эксперименты проводили с 10:00 до 17:00 в тесте «нового аквариума», хорошо валидированном для анализа локомоторных и других поведенческих фенотипов зебраданио [10]. Перед тестированием выполняли инкубацию рыб по 1 штуке в пластиковом стакане емкостью 0,5 л в течение 20 мин в растворе, содержащем U-49900 в разных концентрациях, разведенном в 0,1% диметилсульфоксиде (ДМСО), в данной концентрации не влияющем на поведение зебраданио [11]. Контрольные рыбы подвергались действию раствора ДМСО без препарата. Вещество U-49900 (Россия) было получено от таможенной службы РФ в рамках исследовательских контрактов с Уральским федеральным университетом.

Экспериментальные животные случайным образом разделены на контрольную и экспериментальные группы: 1, 5, 10 и 25 мг/л (n = 16–19 в группе). Концентрации определены на основе собственных пилотных экспериментов по тестированию широкого диапазона острых эффектов U-49900 на зебраданио. Стандартная 20-минутная экспозиция выбрана на основе опыта работы с различными психотропными препаратами.

После инкубации с препаратом поведение рыб исследовали в тесте «нового аквариума», аппарат которого составлял прямоугольный резервуар объемом 1,5 л (15×20×5 см), заполненный водой и разделенный на две равные части виртуальной горизонтальной линией. Поведение рыб записывали на веб-камеру SJ4000 и полученные материалы обрабатывали в программе RealTimer (Open Science, Ltd., Красногорск, Россия). Оценивали количество, продолжительность (с) и латентный период эпизодов замирания (фризинга), латентный период (с) первого выхода в верхнюю часть аквариума, количество выходов наверх и их общую продолжительность (с), а также количество беспорядочных движений (хаотичные движения с высокой скоростью и ускорением, являющиеся маркером тревожного поведения) [12]. Фризинг определяли как полную неподвижность рыбы, за исключением движения жаберных крышек и глаз, более 2 с. Для оценки уровня двигательной активности, общее пройденное расстояние (м), число и продолжительность состояний высокой подвижности подсчитывали с помощью программы Noldus Ethovision XT11 (Wageningen, Нидерланды). Траектории движения зебраданио были также построены в Ethovision XT11 и сохранены в формате JPEG для наглядной иллюстрации пространственных паттернов активности рыб. Полулетальную дозу ЛД₅₀ препарата определяли путем инкубации групп из 30 рыб в различных концентрациях в течение 24 ч.

Группы сравнивали в программе Statistica 10.0 с помощью непараметрического критерия Краскела – Уоллиса с последующим попарным сравнением рангов групп с применением теста Манна – Уитни с поправкой Бонферрони. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Препарат U-49900 демонстрирует выраженную нейротропность в тесте «нового аквариума», статистически достоверно влияя на ряд параметров поведения зебраданио, которые отражают уровень их локомоторной активности (см. рис., табл. 1). В частности, в концентрации 25 мг/л U-49900 на 95,79 % уменьшилась частота выходов зебраданио в верхнюю часть аквариума без изменения продолжительности и латентного периода выхода, что свидетельствует о снижении уровня локомоции рыб после воздействия вещества. В концентрации 25 мг/л U-49900 наблюдалось также 75 % уменьшение общей пройденной дистанции по сравнению с контрольной группой, что подтверждает седативный профиль данного препарата. При этом не отмечено значимых различий в частоте отражающих тревожность беспорядочных движений и фризинга во всех группах (см. табл. 1). ЛД₅₀ для тестируемого препарата U-49900 составила 15 мг/л.

 

Таблица 1. Влияние U-49900 на поведенческие реакции зебраданио в 5-минутном тесте «нового аквариума»

Table 1. Effect of U-49900 on the behavioral responses of zebrafish in the 5-minute new aquarium test

Показатель	Контроль (n = 16)	1 мг/л (n = 16)	5 мг/л (n = 16)	10 мг/л (n = 16)	25 мг/л (n = 15)	Значение критерия Краскела – Уоллиса H (4,79), р
Параметры, подсчитанные с помощью программного обеспечения Ethovision XT
Пройденная дистанция, м	19,0 ± 1	17,0 ± 0,9	15,7 ± 0,9	15,0 ± 0,1	0,8 ± 0,1*** # @A	37,5, p = 0,00001
Параметры, подсчитанные с помощью программного обеспечения RealTimer
Частота выходов наверх	28,0 ± 4,6	19,0 ± 2,6	17,0 ± 2,8	17,0 ± 2,7	7,0 ± 1,6***#A	23,3, p = 0,0001
Продолжительность выходов наверх, с	99,0 ± 10,8	77,0 ± 12,4	78,0 ± 16,6	78,0 ± 12,6	53,0 ± 17	7,8, p = 0,1
Общее количество хаотических движений	1,2 ± 0,8	1,1 ± 0,5	0,9 ± 0,3	0,9 ± 0,7	0,0 ± 0,0##@	11,9, p = 0,02
Число актов фризинга	0,1 ± 0,1	0,1 ± 0,1	0,0 ± 0,0	0,3 ± 0,2	1,6 ± 0,6#	21,2, p = 0,0003
Суммарная продолжительность фризинга, с	2,5 ± 2,5	2,2 ± 2,2	0,0 ± 0,0	23,0 ± 15,0	52,0 ± 22,0#A	20,0, p = 0,0005
Латентный период выхода в верхнюю часть аквариума, с	47,0 ± 9,6	62,0 ± 14,3	58,0 ± 13,0	76,0 ± 13,4	50,0 ± 22,0	9,4, p = 0,05
Латентный период фризинга, с	282,0 ± 18,0	282 ± 17,6	300,0 ± 0,0	248,0 ± 28,3	143,0 ± 39,0#@	22,2, p = 0,0002

Примечание: ***р < 0,001 против контроля, ^#р < 0,05 против группы 1 мг/л, ^##р < 0,01 против группы 1 мг/л, ^@р < 0,05 против группы 5 мг/л, ^A р < 0,05 против группы 10 мг/л, тест Краскела – Уоллиса с последующим тестом Манна – Уитни с поправкой Бонферрони для попарного сравнения групп. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего.

Note: ***p < 0.001 vs control; ^#p < 0.05 vs 1 mg/L group; ^##p < 0.01 vs 1 mg/L group; ^@p < 0.05 vs 5 mg/L group; ^A p < 0.05 vs 10 mg/L group; the Kraskell–Wallis test followed by the Mann–Whitney test with Bonferroni correction for pairwise comparison of groups. Data are presented as mean ± standard error of the mean.

 

По сравнению с острым введением морфина, воздействие которого у зебраданио проявляется в поведенческой активности при концентрации 2 мг/л [13], острое введение U-49900 снижает активность рыб в концентрации 25 мг/л (см. рис.), подтверждая сравнительно более слабую активность последнего в центральной нервной системе у зебраданио. Более того, высокие концентрации морфина (10 и 30 мг/л) не влияют на локомоцию зебраданио [14], но в концентрации 25 мг/л U-49900 вызвал седацию в настоящем исследовании (см. рис.), вследствие чего можно предположить его большую эффективность в высоких дозах по сравнению с морфином.

 

Рис. Влияние U-49900 на паттерны плавания рыб в тесте «новый аквариум»

 

Компьютерный анализ химической структуры U-49900 с использованием базы данных PASSOnline предсказал (табл. 2) с высокой вероятностью (Pa > 60 %) анксиолитические свойства U-49900, что в целом согласуется с его седативным действием на зебраданио (см. табл. 1).

 

Таблица 2. Вероятность биологической активности (Ра) препарата U-49900, рассчитанная с помощью базы данных PASSOnline (www.way2drug.com/passonline/)

Table 2. Probabilities of biological activity (Pa) of the drug U-49900, calculated using the PASSOnline database (www.way2drug.com/passonline/)

Pa	Биологическая активность
0,910	Антифобическое действие
0,890	Ингибитор тауриндегидрогеназы
0,826	Ингибитор НАДФН-пероксидазы
0,771	Ингибитор гликозилфосфатидилинозитол фосфолипазы D
0,783	Ингибитор убихинол-цитохром-с-редуктазы
0,735	Ингибитор фосфолипид-транслоцирующей АТФазы
0,707	Ингибитор L-глутаматоксидазы
0,671	Ингибитор 5-O-(4-кумароил)-D-хинат-3’-монооксигеназы
0,631	Ингибитор (S)-6-гидроксиникотиноксидазы
0,613	Ингибитор сульфитоксидазы
0,587	Ингибитор камфор-1,2-монооксигеназы
0,592	Ингибитор белка, ассоциированного с центромерой
0,601	Анксиолитическое (противоневротическое) действие
0,538	Активатор кальциевых каналов

 

Несмотря на обнаружение выраженных нейротропных седативных эффектов U-49900 (см. рис., табл. 1), настоящее исследование имеет несколько ограничений. Например, не изучали потенциальное молекулярное, геномное и протеомное воздействие U-49900 на зебраданио, а также индивидуальные различия [15]. В будущем целесообразно оценить эффекты хронического воздействия U-49900 на рыбах, грызунах и человеке, а также сопоставить возможное привыкание и развитие синдрома отмены, особенно в контексте опиоидергических эффектов препарата. Целесообразен также систематический анализ нейрохимических и фармакокинетических процессов в мозге зебраданио (например, через 1, 2, 6, 12, 24 и 48 ч после воздействия) для низких, средних и высоких доз в будущих доклинических исследованиях U-49900.

Еще один фактор — возможная потенциальная острая неспецифическая токсичность U-49900. Например, в пилотных исследованиях U-49900 нами не выявлено токсичности при применении концентрации 25 мг/л, но показана летальность 80–100 % после однократного острого 60-минутного воздействия в концентрации 50–100 мг/л (данные не приведены). Кроме того, после однократного острого 20-минутного введения 50–100 мг/л наблюдались выраженная атаксия и седативный эффект, а оцененная в настоящей работе ЛД₅₀ препарата составила 15 мг/л при 24-часовой экспозиции. Таким образом, преобладание седативного эффекта при остром воздействии нарастающих доз U-49900 на зебраданио могло маскировать анксиолитические эффекты этого препарата. Однако, поскольку острые дозы морфина и других опиоидов в малых количествах вызывают анксиолитические эффекты у людей [16], в дальнейшем нужна оценка более широкого диапазона низких доз этого вещества, чтобы оценить потенциальное анксиолитическое действие при однократном введении.

В целом седативный эффект U-49900 у взрослых зебраданио в концентрации 25 мг/л (см. рис., табл. 1) аналогичен эффектам U-47700, что позволяет предположить не только химическое, но и фармакологическое сходство данных синтетических опиоидов [17], для чего необходимы дальнейшие исследования данных препаратов. Способность U-49900 вызывать выраженные нейротропные седативные эффекты у зебраданио также согласуется с клиническими и доклиническими данными о синтетических препаратах, подчеркивая важность доклинического скрининга химических соединений на рыбах. Учитывая высокую консервативность мишеней для лекарств и сходство основных молекулярных сетей между рыбами, людьми и грызунами [18, 19], разработка скрининговых платформ на основе зебраданио может стать важной стратегией поиска путей терапии при состояниях, вызванных приемом синтетических препаратов [20].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, вещество U-49900 в концентрации 25 мг/л в течение 20 мин на 95,79 % уменьшает пройденную дистанцию и на 75 % количество выходов в верхнюю часть аквариума в тесте «нового аквариума» (р < 0,001) по сравнению с контрольной группой. Данный фенотип свидетельствует о седативном действии препарата на взрослых зебраданио. Препарат во всех исследуемых концентрациях не влиял на другие параметры в тесте «нового аквариума», но продемонстрировал ЛД₅₀ при концентрации 15 мг/л и 24-часовой инкубации. Проведенный in siliсo анализ U-49900 при помощи базы данных PASSOnline указывает на возможность анксиолитических свойств препарата, что косвенно соответствует его обнаруженной седативности и требует дальнейшего исследования.

About the authors

T. O. Kolesnikova

Sirius University of Science and Technology; Ural Federal University

Email: Philimontani@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5561-8583
SPIN-code: 8558-7887
Russian Federation, Sirius; Yekaterinburg

V. A. Shevyrin

Ural Federal University

Email: vadim.shevyrin@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-0369-0786
SPIN-code: 5899-6920

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Yekaterinburg

S. L. Khatsko

Ural Federal University

Email: hardscore@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5921-6680
SPIN-code: 4973-7083
Russian Federation, Yekaterinburg

A. V. Kalueff

Sirius University of Science and Technology; Almazov National Medical Research Center

Author for correspondence.
Email: avkalueff@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-7525-1950
SPIN-code: 4134-0515

Dr. Sci. (Biology)

Russian Federation, 354340, Krasnodar Region, Sirius Federal Territory, Olimpiisky prospect, 1; Saint Petersburg

References

Supplementary files