СЕДАТИВНЫЙ ЭФФЕКТ U-49900 (3,4-ДИХЛОР-N-(2-(ДИЭТИЛАМИНО)ЦИКЛОГЕКСИЛ)-N-МЕТИЛ-БЕНЗАМИДА) НА ВЗРОСЛЫХ РЫБАХ ЗЕБРАДАНИО

Полный текст

Введение

Опиоиды, в том числе нефентаниловые циклогексилбензамиды, являются часто употребляемыми наркотическими веществами [1]. Препарат 3,4-дихлор-N-(2-(диэтиламино)циклогексил)-N-метилбензамид (U-49900) (Рис. 1) представляет собой аналог синтетического опиоида U-47700, вызывающий у человека абстиненцию и (при хроническом использовании) потерю вкуса, обоняния и осязания [2]. Данное соединение внесено в список сильнодействующих и наркотических средств во многих странах [3], включая США, Швецию, Испанию [2] и (с 2017 г.) Россию. Ввиду растущего злоупотребления опиатов в мире [1], их изучение становится важной биомедицинской задачей, в том числе в клинических и доклинических исследованиях. Однако, несмотря на данные об эффектах U-47700 у грызунов [2], сведения об эффектах его аналога U-49900 на животных моделях практически отсутствуют.

Наряду с грызунами, в доклиническом скрининге химических соединений широко используется рыба зебраданио (zebrafish, Danio rerio), ставшая незаменимым модельным объектом в биомедицине. Наряду с малой стоимостью, быстрым развитием, прозрачностью эмбрионов, морфологической, физиологической и генетической гомологией с человеком [4], а также чувствительностью к основным классам препаратов, зебраданио также демонстрируют обучение [5], социальность [6] и сложное поведение [7]. Ввиду отсутствия данных о нейротропных эффектах U-49900, целью настоящего исследования явилось изучение его воздействия при остром введении на поведение и двигательную активность взрослых рыб зебраданио.

Методы исследования

Анализ взаимосвязи структуры и активности является ключевым для прогнозирования биологических свойств химических соединений базой данных PASSOnline, которая с точностью > 96% предсказывает фармакологические профили лекарств, механизм действия, взаимодействия мишеней и побочные/токсические эффекты на основе библиотеки более 1 миллиона биологически активных веществ [8]. В работе был проанализирован U-49900 с использованием этого подхода для оценки рассчитанной вероятности (Pa) конкретных биологических активностей.

В исследовании было использовано 83 зебраданио аутбредной популяции коротно-плавникового дикого типа обоего пола возрастом 4–6 месяцев, полученные от местного поставщика (Zootrade, Inc., Екатеринбург). Рыбы были акклиматизированы в течение не менее двух недель до начала экспериментов и содержались группами по 40 особей в 40-литровых аквариумах, заполненных чистой фильтрованной водой (температура 25 ± 1 ◦C, pH 7.4). Освещение (950−960 люкс) обеспечивалось потолочными светильниками, а световой день составлял 12-часов (9:00-21:00 ч [9]). Экспериментальные животные ранее не были использованы в других экспериментах, и кормились стандартным кормом (хлопьями Tetramin для аквариумных рыб) дважды в день. Выбор беспородной популяции дикого типа для настоящего исследования был основан на соображениях популяционной валидности и ее значимости для настоящего исследования. Вкратце, хотя генетически контролируемые модели (например, инбредные линии рыб зебраданио) могут быть более воспроизводимой и надежной системой для нейрогенетических исследований, моделирование нарушений ЦНС на животных подразумевает воспроизведение «реальных» болезней мозга человека, затрагивающих генетически гетерогенные популяции. Таким образом, использование аутбредной линии рыб в данной работе обосновано с популяционной и трансляционной точек зрения.

Эксперименты проводили с 10:00 до 17:00 в тесте «нового аквариума», хорошо валидированном для анализа локомоторных и других поведенческих фенотипов зебраданио [10]. Перед тестированием проводили инкубацию рыб по 1 штуке в пластиковом стакане емкостью 0.5 л в течение 20 минут в растворе, содержащем U-49900 в разных концентрациях, растворенном в 0.1% диметилсульфоксиде (ДМСО), в данной концентрации не влияющем на поведение зебраданио [11]. Контрольные рыбы подвергались действию раствора ДМСО без препарата. Вещество U-49900 (Россия) было получено от таможенной службы РФ в рамках исследовательских контрактов с Уральским федеральным университетом.

Экспериментальные животные были случайным образом разделены на контрольную и экспериментальные группы 1, 5, 10 и 25 мг/л (n = 16–19 в группе). Исследуемые концентрации были выбраны на основе собственных пилотных экспериментов по тестированию широкого диапазона острых эффектов U-49900 на зебраданио. Стандартная 20-минутная экспозиция была выбрана на основе опыта работы с различными психотропными препаратами.

После инкубации с препаратом поведение рыб исследовали в тесте «нового аквариума», аппарат которого составлял прямоугольный резервуар объемом 1.5 л (15 × 20 × 5см), заполненный водой и разделенный на две равные части виртуальной горизонтальной линией. Поведение рыб записывали на веб-камеру SJ4000 и полученные материалы обрабатывали в программе RealTimer (Open Science, Ltd., Красногорск, Россия). Оценивали количество, продолжительность (с) и латентный период эпизодов замирания (фризинга), латентный период (с) первого выхода в верхнюю часть аквариума, количество выходов наверх и их общая продолжительность (с), а также количество беспорядочных движений (хаотичные движения с высокой скоростью и ускорением, являющиеся маркером тревожного поведения) [12]. Фризинг определяли, как полное отсутствие движений рыбы, за исключением движения жаберных крышек и глаз, более 2 с. Для оценки уровня двигательной активности, общее пройденное расстояние (м), число и продолжительность состояний высокой подвижности, подсчитывали с помощью программы Noldus Ethovision XT11 (Wageningen, Netherlands). Траектории движения зебраданио были также построены в Ethovision XT11 и сохранены в формате JPEG для наглядной иллюстрации пространственных паттернов активности рыб. Полулетальную дозу ЛД50 препарата определяли путем инкубации групп из 30 рыб в различных концентрациях в течение 24 часов.

Сравнение групп проводили в программе Statistica10.0 непараметрическим критерием Краскела-Уоллеса с последующим попарным сравнением рангов групп с помощью теста Манна-Уитни с поправкой Бонферрони. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. Различия считали статистически значимыми при значении p < 0,05.

.

Результаты и их обсуждение

Препарат U-49900 демонстрирует выраженную нейротропность в тесте «нового аквариума», статистически достоверно влияя на ряд параметров поведения зебраданио, которые отражают уровень их локомоторной активности (Рис. 1, Табл. 1). В частности, в концентрации 25 мг/л U-49900 на 95,79% уменьшилась частота выходов зебраданио в верхнюю часть аквариума без изменения продолжительности и латентного периода выхода, что свидетельствует о снижении уровня локомоции рыб после воздействия вещества. В концентрации 25 мг/л U-49900 наблюдалось также 75 %-ное уменьшение общей пройденной дистанции по сравнению с контрольной группой, подтверждая седативный профиль данного препарата. При этом не наблюдалось значимых различий в частоте отражающих тревожность беспорядочных движений и фризинга во всех группах (Табл. 1). ЛД50 для тестируемого препарата U-49900 составила 15 мг/л.

 

Рисунок 1. Влияние U-49900 (вверху слева) на паттерны плавания рыб в тесте «новый аквариум»

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Таблица 1. Влияние U-49900 на поведенческие реакции зебраданио в 5-минутном тесте «нового аквариума»

Показатель	Контроль (n=16)	1 мг/л (n=16)	5 мг/л (n=16)	10 мг/л (n=16)	25 мг/л (n=15)	Значение критерия Краскела-Уоллиса H(4,79), р
Параметры, подсчитанные с помощью программного обеспечение Ethovision XT
Пройденная дистанция, м	19,0±1	17,0±0,9	15,7±0,9	15,0±0,1	0,8±0,1 *** # @A	37,5, p = 0,00001
Параметры, подсчитанные с помощью программного обеспечение RealTimer
Частота выходов наверх	28,0±4,6	19,0±2,6	17,0±2,8	17,0±2,7	7,0±1,6***#A	23,3, p = 0,0001
Продолжительность выходов наверх, с	99,0±10,8	77,0±12,4	78,0±16,6	78,0±12,6	53,0±17	7,8, p = 0,1
Общее количество хаотических движений	1,2±0,8	1,1±0,5	0,9±0,3	0,9±0,7	0,0±0,0##@	11,9, p = 0,02
Число актов фризинга	0,1±0,1	0,1±0,1	0,0±0,0	0,3±0,2	1,6±0,6#	21,2, p = 0,0003
Суммарная продолжительность фризинга, с	2,5±2,5	2,2±2,2	0,0±0,0	23,0±15,0	52,0±22,0#A	20,0 p = 0,0005
Латентный период выхода в верхнюю часть аквариума, с	47,0±9,6	62,0±14,3	58,0±13,0	76,0±13,4	50,0±22,0	9,4, p = 0,05
Латентный период фризинга, с	282,0±18,0	282±17,6	300,0±0,0	248,0±28,3	143,0±39,0#@	22,2, p = 0,0002

***р<0.001 против контроля, #р<0.05 против группы 1 мг/л, ##р<0.01 против группы 1 мг/л, @р<0.05 против группы 5 мг/л, A р<0.05 против группы 10 мг/л, тест Краскела-Уоллиса с последующим тестом Манна-Уитни с поправкой Бонферрони для попарного сравнения групп. Данные представлены как среднее±стандартная ошибка среднего.

 

Интересно, что по сравнению с острым введением морфина, который у зебраданио проявляет поведенческую активность при концентрации 2 мг/л [13], острое введение U-49900 снижает активность рыб в концентрации 25 мг/л (Рис. 1), подтверждая сравнительно более слабую активность последнего в ЦНС у зебраданио. Более того, высокие концентрации морфина (10 и 30 мг/л) не влияют на локомоцию зебраданио [14], однако в концентрации 25 мг/л U-49900 вызвал седацию в настоящем исследовании (Рис. 1), вследствие чего можно предположить его большую эффективность в высоких дозах  по сравнению с морфином.

Проведенный компьютерный анализ химической структуры U-49900 с использованием базы данных PASSOnline предсказал (Табл. 2), что с высокой вероятностью (Pa>60%) U-49900 обладает анксиолитическими свойствами, что в целом согласуется с его наблюдаемым седативным действием на зебраданио (Табл. 1).

 

Таблица 2. Вероятности биологической активности (Ра) препарата U-49900, рассчитанные с помощью базы данных PASSOnline (www.way2drug.com/passonline/)

Pa	Биологическая активность
0.910	Антифобическое действие
0.890	Ингибитор тауриндегидрогеназы
0.826	Ингибитор НАДФН-пероксидазы
0.771	Ингибитор гликозилфосфатидилинозитол фосфолипазы D
0.783	Ингибитор убихинол-цитохром-с-редуктазы
0.735	Ингибитор фосфолипид-транслоцирующей АТФазы
0.707	Ингибитор L-глутаматоксидазы
0.671	Ингибитор 5-O-(4-кумароил)-D-хинат-3'-монооксигеназы
0.631	Ингибитор (S)-6-гидроксиникотиноксидазы
0.613	Ингибитор сульфитоксидазы
0.587	Ингибитор камфор-1,2-монооксигеназы
0.592	Ингибитор белка, ассоциированного с центромерой
0.601	Анксиолитическое (противо-невротическое) действие
0.538	Активатор кальциевых каналов

 

Несмотря на обнаружение выраженных нейротропных седативных эффектов U-49900 (Рис. 1, Табл. 1), настоящее исследование имеет несколько ограничений. Например, не исследовалось его потенциальное молекулярное, геномное и протеомное воздействие U-49900 на зебраданио, а также индивидуальные различия [15]. В будущем целесообразно оценить эффекты хронического воздействия U-49900 на рыбах, грызунах и человека, а также сопоставить возможное привыкание и развитие синдрома отмены, особенно в контексте опиодиергических эффектов препарата. Также целесообразен систематический анализ нейрохимических и фармакокинетических процессов в мозге зебраданио (например, через 1, 2, 6, 12, 24 и 48 часов после воздействия) для низких, средних и высоких доз в будущих доклинических исследованиях U-49900.

Еще один фактор – возможная потенциальная острая неспецифическая токсичность U-49900. Например, в пилотных исследованиях U-49900 нами не выявлено токсичности при 25 мг/л, однако показана летальность 80–100% при 50–100 мг/л после однократного острого 60-минутного воздействия (данные не показаны). Кроме того, после однократного острого 20-минутного введения 50-100 мг/л наблюдались выраженная атаксия и седативный эффект, а оцененная в настоящей работе ЛД50 препарата составляет 15 мг/л при 24-часовой экспозиции¹. Таким образом, преобладание седативного эффекта при остром воздействии нарастающих доз U-49900 на зебраданио могло маскировать анксиолитические эффекты этого препарата. Однако, поскольку острые дозы морфина и других опиоидов в малых количествах вызывают анксиолитические эффекты у людей [16], в дальнейшем требуется оценка более широкого диапазона низких доз этого вещества, чтобы оценить потенциальное анксиолитическое действие при однократном введении.

В целом, седативный эффект U-49900 у взрослых зебраданио в концентрации 25 мг/л (Рис. 1, Табл. 1) аналогичен эффектам U-47700, что позволяет предполагать не только химическое, но и фармакологическое сходство данных синтетических опиоидов [17], требуя дальнейших исследований данных препаратов. Способность U-49900 вызывать выраженные нейротропные седативные эффекты у зебраданио также согласуются с клиническими и доклиническими данными о синтетических препаратах, подчеркивая важность доклинического скрининга химических соединений на рыбах. Учитывая высокую консервативность мишеней для лекарств и сходство основных молекулярных сетей между рыбами, людьми и грызунами [18], разработка скрининговых платформ на основе зебраданио может стать важной стратегией поиска путей терапии состояний, вызванных приемом синтетических препаратов [19].

Заключение

Таким образом, вещество U-49900 в концентрации 25 мг/л в течение 20 минут на 95,79% снижает пройденную дистанцию и на 75% количество выходов в верхнюю часть аквариума в тесте «нового аквариума» (р<0,001) по сравнению с контрольной группой. Данный фенотип свидетельствует о седативном действии препарата на взрослых зебраданио. Препарат во всех исследуемых концентрациях не оказал влияния на другие параметры в тесте «нового аквариума», однако демонстрирует ЛД50 15 мг/л при 24-часовой инкубации. Проведенный in siliсo анализ U-49900 при помощи базы данных PASSOnline указывает на возможность анксиолитических свойств препарата, что косвенно соответствует его обнаруженной седативности, и требует дальнейшего исследования.

 

 

 

 

Об авторах

Татьяна Олеговна Колесникова

Научно-технологический университет «Сириус»

Email: philimontani@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5561-8583
SPIN-код: 8558-7887

научн. сотр.

Россия, Сочи

Вадим Андреевич Шевырин

Email: vadim.shevyrin@gmail.com

Сергей Леонидович Хацко

Уральский федеральный университет

Email: hardscore@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5921-6680
SPIN-код: 4973-7083

науч. сотр.

Россия, Екатеринбург

Алан Валерьевич Калуев

ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет»

Автор, ответственный за переписку.
Email: avkalueff@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-7525-1950

доктор биологических наук, профессор РАН, профессор, зав. лаб. биологической психиатрии

Россия

Список литературы

Дополнительные файлы