THE INFLUENCE OF GYMNEMA ACIDS ON CELL DEATH AND REPARATION OF р-CELLS ON STREPTOZOTOCIN-INDUCED DIABETES MELLITUS

Full Text

Ранняя инвалидизация и высокая летальность от поздних осложнений возводят сахарный диабет (СД) в ранг глобальной медико-социальной проблемы здравоохранения многих стран мира [3]. Одним из приоритетных направлений современной фармакологии является создание новых антидиабетических средств. При этом существующий алгоритм лечения СД, особенно II типа, не всегда является оптимальным способом коррекции гипергликемии и развития осложнений. Ведется активный поиск гипогликеми-ческих препаратов с новыми механизмами действия: секретогенов, сенситайзеров инсулина, ингибиторов скорости продукции глюкозы печенью и др. Одним из перспективных направлений является поиск модуляторов инкретинов: GIP (глюкозозависимый инсу-линотропный полипептид) и GLP-1 (глюкагоноподоб-ный пептид-1), которые регулируют активность секреции b-клеток путем оптимизации синтеза инсулина и способствуют пролиферации b-клеток, новообразованию панкреатических островков, а также угнетают апоптоз. Установлено, что некоторые растительные экстракты, в частности гимнемы лесной (Gymnema sylvestre), обладают выраженными гипогликемичес-кими свойствами [4]. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Изучение лекарственного патоморфоза и особенностей репаративной регенерации р-эндокриноцитов панкреатических островков при их повреждении стреп-тозотоцином на фоне введения гимнемовых кислот. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Исследование проводили на белых крысах-самцах, массой 300—340 г, разделенных на группы: 1 — интактная (n = 10), 2 — стрептозотоцин-индуцированный СД (n = 10) и 3 — стрептозотоцин-индуцирован-ный СД на фоне введения гимнемовых кислот (n = 10). Во 2-й и 3-й опытных группах моделировали тяжелый СД (глюкоза крови выше 15 ммоль/л) ежедневным в/в введением стрептозотоцина (Sigma) в дозе 20 мг/кг в течение 5 дней. В 3-й группе перорально вводили экстракт гимнемовых кислот в дозировке 280 мг/кг, 2 раза/сутки. Животные контрольной группы и с моделью СД получали питьевую отстоянную воду в аналогичном объеме (протокол экспериментальной части исследования согласован с Региональным этическим комитетом, решение № 43-2006). Спустя три недели, соблюдая принципы гуманного отношения, животных выводили из эксперимента. Ткань поджелудочной железы фиксировали в течение 24 часов в 10%-м растворе нейтрального забуференного формалина (рН 7,4) и заливали в парафиновые блоки. На роторном микротоме изготавливали серийные срезы толщиной 5—6 мкм. Производили окрашивание гематоксилином и эозином по общепринятой гистологической методике [5]. Для иммуногистохимического исследования использовали поликлональные антитела к инсулину (DakoCytomation), протеинам p53 (DakoCytomation) и Bax (BD Pharmingen); монокло-нальные антитела к ядерному антигену пролифери-рующих клеток — PCNA (клон PC10), к белку Ki-67 (клон MIB-5), к каспазе 3 (клон JHM62, Novocastra), к рецептору TRAIL — родственный фактору некроза опухоли апоптоз-индуцирующий лиганд (клон 27B12, Novocastra), белку MDM2 (клон 1B10, Novocastra) и протеину Bcl2 (клон sc-7382, Santa Cruz). Иммуноги-стохимическое исследование проводили по протоколу фирм производителей (HIER) с использованием систем детекции «LSAB» и «En Vision» и хромогеном — диаминобензидином. Характер иммуногистохимической реакции оценивали визуально в баллах с учетом интенсивности окраски и количества окрашенных клеток по шкале Allred D. C., et al. (1998). Морфометрический анализ проводили с помощью программы анализа изображений «ВидеоТест-Морфо-4». Определяли индексы апоптоза и пролиферации (число р-клеток панкреатических островков с признаками апоптоза и пролиферации на 100 %). Статистическую обработку данных проводили в программе «MS Excel» с расчетом базовых статистических показателей (M, m) и использованием парного t-критерия Стьюдента при достоверности p < 0,05 [1]. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В контрольной группе отмечалось типичное гистологическое строение поджелудочной железы. В панкреатических островках р-эндокриноциты располагались преимущественно в центре. Выявлялась выраженная цитоплазматическая экспрессия инсулина. В отдельных р-клетках отмечалась слабая или умеренная ядерная экспрессия факторов пролиферации: PCNA-позитивные клетки составляли 3 %, Ki-67-позитивные — 1,5 %. Экспрессия Bax была негативной во всех клетках. Определялось слабое позитивное цитоплазматическое окрашивание к протеину Bcl-2. В ядрах единичных р-клеток определялась слабая экспрессия белка p53. Большинство ядер р-клеток позитивно окрашивались антителами к белку MDM2. Цитоплазматическая экспрессия кас-пазы 3 и TRAIL носила слабо выраженный характер в единичных р-эндокриноцитах (табл. 1). Апоптотичес-кий индекс составлял 4,1 % (табл. 2). У крыс со стрептозотоцин-индуцированным СД определялся выраженный отек междольковой соединительной ткани и полнокровие кровеносных капилляров. В коллабированных панкреатических островках отмечалась умеренная лимфоцитарная инфильтрация. В большинстве островков отмечались выраженные деструктивные изменения р-клеток и разрастание соединительной ткани. Инсулин-позитивные клетки располагались поодиночке или в виде мелких скоплений в центральных отделах островков. Отмечалась их гипертрофия с выраженной экспрессией инсулина и умеренной экспрессией факторов пролиферации: PCNA-позитивные клетки составляли 9 %, Ki-67-по-зитивные — 2,3 %. Экспрессия протеинов p53, Bax, MDM2 и Bcl-2 была слабая в единичных клетках. Отмечалась выраженная экспрессия TRAIL и каспазы 3 в большинстве р-эндокриноцитов (табл. 1). Происходило достоверное увеличение р-эндокриноцитов, находящихся в состоянии апоптоза, по сравнению с контрольной группой животных (табл. 2). В группе животных со стрептозотоцин-индуци-рованным СД, получавших экстракт гимнемовых кислот, в панкреатических островках сохранялась умеренная лимфоцитарная инфильтрация, полнокровие капилляров и деструктивные изменения р-эндокри-ноцитов. Единичные островки были полностью скле-розированы. Отмечалась умеренно выраженная гипертрофия р-эндокриноцитов центральных отделов островков с выраженной экспрессией инсулина. Мелкие островки без признаков воспаления и деструкции располагались в тесной связи с выводными протоками. Среди ацинарных клеток определялись единичные инсулин-позитивные клетки или их скопления. Экспрессия факторов пролиферации носила выраженный характер: PCNA-позитивные клетки составляли 13,1 %, Ki-67-позитивные — 3,2 %. Также отмечались PCNA-позитивные и Ki-67-позитивные клетки эпителия протоков и единичные клетки, расположенные в ацинарной ткани и в непосредственной близости от островков. Экспрессия протеинов p53, Bcl-2 была слабая и Bax негативная. Умеренная экспрессия протеина MDM2 отмечалась в большинстве клеток островков Лангерганса. Экспрессия каспазы 3 и TRAIL отмечалась в единичных р-эндокриноцитах (табл. 1). Количество р-клеток в состоянии апоптоза по сравнению с животными с СД достоверно уменьшалось Индексы апоптоза и пролиферации Р -эндокриноцитов (табл. 2). Известно, что при токсическом действия стреп-тозотоцина на р-клетки происходит фрагментация ДНК в результате ее алкилирования, а также образование токсических соединений — супероксид аниона, пероксинитрита и оксида азота. Грубые необратимые повреждения ДНК и внутриклеточных структур сопровождаются развитием некроза р-эндокри-ноцитов. Наравне с деструктивными изменениями в островках Лангерганса удается обнаружить активацию запрограммированной клеточной гибели, так называемый апоптоз, пусковым моментом которого служат нелетальные повреждения ДНК, повреждение мембран митохондрий и действие на клетку внешних стимулов [9]. Вне зависимости от причины активации апоп-тоза ключевое место в его развитии занимает семейство цистеиновых протеаз, так называемые кас-пазы, которые образуют разветвленный каскад, взаимно активируя друг друга. В результате взаимодействия каспазного каскада активируется эффек-торная каспаза 3, которая вызывает расщепление внутриклеточных белков и влечет гибель клетки [6, 8]. Выраженность апоптотического индекса и распространенность площади некрозов позволяют оценить степень повреждения ткани поджелудочной железы и наравне с биохимическими показателями (уровень гликемии, гликозилированный гемоглобин и др.) могут служить критерием степени тяжести экспериментального СД. Расчет индекса пролиферации выявил достаточно низкую активность р-эндокриноцитов в контрольной группе животных, что согласуется с литературными данными о медленном обновление клеточной популяции островков Лангерганса [2]. При моделировании СД и гибели большей части р-клеток достоверное увеличение индекса пролиферативной активности обусловлено активацией репаративных процессов. Из экспериментальных данных следует, что гимнемовые кислоты обладают выраженным стимулирующим действием на процессы клеточной репарации, что вполне согласуется с опытом зарубежных исследователей. Пролиферация не только островко-вых р-клеток, но и экспрессия маркеров клеточного деления в ацино-инсулярных клетках и клетках эпителия протоков рассматривается как активация клеток предшественников р-эндокриноцитов [11]. Однако вопрос о существовании клеток предшественников эндокриноцитов по-прежнему остается открытым. Ряд исследователей рассматривают в качестве таких клеток камбиальные клетки протоков поджелудочной железы [7]. Другие считают, что клетки предшественники эндокриноцитов присутствуют не только в системе протоков поджелудочной железы, но также определяются вокруг островков и способны транс-дифференцироваться в р-эндокриноциты. Эти клетки встречаются крайне редко — 1 клетка на 3000—9000 клеток, и их гистогенез остается не выясненным [11]. Экспрессию ядерного антигена пролиферирую-щих клеток не всегда можно рассматривать как достоверный признак пролиферации, так как данный антиген обладает продолжительным периодом разрушения (около 20 часов) и экспрессируется в G0 фазе клеточного цикла и при репарации ДНК клеток [10]. В связи с этим более достоверным для расчетов индекса пролиферации следует считать экспрессию протеина Ki-67. Усиление репаративных процессов р-клеток, обусловленное введением гимнемовых кислот, объясняется наличием инкретиномиметического эффекта, то есть стимуляцией GLP-1, который, как известно, регулирует баланс клеточной популяции островков Лангерганса за счет активации пролиферации и угнетения апоптоза. Однако конкретный механизм регуляции численности эндокриноцитов остается до конца не выясненным. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, пероральное введение гимне-мовых кислот у крыс с экспериментальным СД не препятствует развитию деструктивных изменений в р-эндокриноцитах. Выявленные особенности патомор-фоза стрептозотоцин-индуцированного СД и репаративных процессов обусловлены инкретиноподобным действием гимнемовых кислот. Введение гимнемовых кислот существенно замедляет апоптоз, а также активирует репаративную регенерацию р-клеток при экспериментальном сахарном диабете.

About the authors

V. B. Pisarev

G. L. Snigur

Email: innov_volgmed@mail.ru

A. A. Spasov

M. P. Voronkova

A. E. Bulanov

References

Supplementary files