MORPHOLOGICAL NEUROPROTECTION PARAMETERS OF RAT BRAIN WITH ISCHEMIA-REPERFUSION

Full Text

Лидирующие позиции в структуре заболеваемости и смертности во всем мире занимают церебро-васкулярные заболевания, преобладающими среди которых имеют ишемические поражения центральной нервной системы [2, 6]. До 25 % ишемических инсультов и транзиторных ишемических атак (ТИА) связаны с осложнениями эмболического характера из бляшек, локализующихся в экстракраниальных отделах артериальной системы [3, 4]. Возможности профилактических мероприятий при данной патологии, во многом связаны с хирургическим вмешательством на экстракраниальных сосудах, проходящем на фоне ишемии-реперфузии головного мозга. Очевидна необходимость поиска новых данных о метаболических аспектах патогенеза, стадийности изменений биохимических процессов, возможностей нейропротек-ции головного мозга на данный период. ЦЕЛЬ РАБОТЫ 1. Общая оценка характера патологии по основным отделам ГМ и оценка церебропротективного эффекта (окраска гематоксилин-эозином, по Нисслю). 2. Выявление механизмов отсроченной убыли нейронов (апоптоза) — иммуногистохимическое выявление экспрессии нейрональной и эндотелиальной нитроксидсинтаз, лиганда TNF-зависимого апоптоза TRAIL. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Работа выполнена на 82 половозрелых крысах обоего пола массой 180—250 г. Животным под наркозом (30 мг/кг этаминал-натрия внутрибрюшинно) выделяли с обеих сторон a. carotis communis, которые клеммировали на соответствующий срок (экспериментальная группа), табл. 1. Затем всем крысам опытной группы возобновляли кровоток по сонным артериям на 30 мин, после чего выводили из эксперимента передозировкой этаминал-натрия. Все процедуры выполняли в соответствии с «Правилами работы с лабораторными животными...». Клеммирование общих сонных артерий, как это уже неоднократно было показано исследованиями ише-мии-реперфузии ГМ, приводит к ограничению церебрального кровотока примерно на 70—80 %, что сопровождается после реперфузии формированием обратимого повреждения нейронов в течение 8—12 ч, необратимого — при увеличении сроков ишемии [3, 5, 7]. Группа сравнения (22 крысы) была представлена животными, которым выполнялась ишемия головного мозга клеммированием сонных артерий на срок до 20 ч с 30-минутной реперфузией, без применения каких-либо препаратов, с последующими аналогичным выведением из эксперимента. Непосредственно после эвтаназии головной мозг (ГМ) животных извлекали щадящим образом из черепа, помещали в 10%-й раствор нейтрального забуференного формалина (рН = 7,4) на 30 мин, после чего разделяли на 3 блока (А, В и С) фронтальной секцией через точку P0 по Сентаготаи и тангенциальной — от борозды, разделяющей полушария большого мозга и мозжечка до границы между стволом и промежуточным мозгом на вентральной его поверхности. После этого дофиксировали материал в том же растворе в течение 24 ч. С фронтальной (А, В) и вентро-фронтальной (С) поверхностей каждого блока делали по 50—60 серийных срезов толщиной 5 мкм. Использовали окраски гематоксилином и эозином и тионином по Нис-слю для каждого 10-го среза. Общее количество микропрепаратов — 30 на 1 ГМ экспериментального животного. В результате подобного исследования идентифицировали на срезах и подвергали качественной и полуколичественной оценке следующие структуры: заднюю фронтальную, теменную и затылочную области коры больших полушарий ГМ, таламус, гипоталамус, стриопаллидум, мозжечок, средний и продолговатый мозг: Производили микрофотосъемку цифровой камерой Canon (Japan, 5.0 мегапикселей) на базе микроскопа Axiostar plus (Карл Цейс, Германия) с использованием объектива х 40, х 100 и окуляра х 10. Таблица 1 Распределение животных в экспериментальных группах № Характер эксперимента в серии Сроки, ч Количество животных 1 Ишемия головного мозга клеммиро-ванием сонных артерий с 30-минутной реперфузией без применения каких-либо препаратов 1 4 3 4 8 6 12 5 17,5 2 20 1 2 Цитофлавин - 0,15 мг/кг массы внут-рибрюшинно за 30' до клеммирования сонных артерий 8 6 24 6 3 Актовегин - 30 мг/кг массы внутри-брюшинно за 30' до клеммирования сонных артерий 8 6 24 6 4 Мексидол - 1,5 мг/кг массы внутри-брюшинно за 30' до клеммирования сонных артерий 8 6 24 6 5 Эноксифол - 5 мг/кг массы внутри-брюшинно за 30' до клеммирования сонных артерий 8 6 24 6 6 АКФ-90-7 - 10 мг/кг массы внутри-брюшинно за 30' до клеммирования сонных артерий 8 6 24 6 Иммуногистохимическое исследование проводили на базе лаборатории морфологии Волгоградского научного центра РАМН и администрации Волгоградской области. Использовали моноклональные мышиные антитела к нейрональной нитроксидсинта-зе (NOS-1, клон NS14), эндотелиальной нитроксид-синтазе (NOS-3, клон NS5) и TRAIL производства DakoCytomation, Дания. Визуализацию проводили с помощью непрямого иммунопероксидазного метода с высокотемпературной и ферментной демаскировкой антигенов. Экспрессию оценивали по разбиению нейронов на классы в зависимости от степени экспрессии иммунопозитивного материала. Для достоверности полученных результатов применяли позитивные и негативные контроли антигенов, а также негативные контроли антител [4]. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ При сопоставлении цитотоксических, сосудистых и фибропластических изменений в ткани головного мозга у контрольных животных с ишемией-ре-перфузией головного мозга было обнаружено, что на протяжении эксперимента в течение 24 ч на ранних сроках ишемии преобладали сосудистые изменения. На микропрепаратах головного мозга крыс, окрашенных гематоксилином и эозином, это выражалось в виде резкого набухания ткани, разволокнения нервных проводников, развитии периваскулярного отека вокруг сосудов микроциркуляторного русла. В самих сосудах отмечалась неоднородность — часть артериол была спазмирована, часть — паретически расширена. Однако вне зависимости от степени вазоспазма во всех случаях определялось полнокровие сосудов, которое сопровождалось явлениями стаза и сладжа эритроцитов, что может быть свидетельством замедлением интрацеребрального кровотока. Данная картина наиболее ярко была представлена к 7 ч ишемии. К 24 ч эксперимента к уже указанным признакам застоя крови присоединялись явления внутрисо-судистой седиментации плазмы крови и периваску-лярные диапедезные кровоизлияния. Этот факт может рассматриваться как свидетельство нарушения сосудистой проницаемости на фоне длительно протекающей ишемии головного мозга с последующей реперфузией. В противовес сосудистым изменениям явления цитотоксичности наиболее ярко проявляли себя именно на сроках, близких к 24 ч. Если в сроках 3—7 часов в нейронах определялись дистрофические изменения в виде отека и набухания нейронов, базофилии периариона и явления выраженного перицеллюлярного отека, то ближе к 24 ч во многих отделах коры наблюдались признаки гибели нейронов. К таким признакам в данном случае можно отнести явления потери пирамидным клетками характерной формы, лизиса ядер, снижения тин-кториальных характеристик нейронов. Более того, во многих случаях были выражены явления глиальной реакции, скопления глиоцитов вокруг погибших нейронов и фокусы нейронофагии. Причем такая картина была характерна практически для всех отделов коры большого мозга. В опытной группе с использованием мексидола на фоне ишемии-реперфузии головного мозга было обнаружено, что морфологические изменения мало отличаются от таковых в контрольной группе, однако имеют место различия в сроках наступления сосудистых и цитотоксических реакций. Так, явления застоя крови в сосудах и эрит-родиапедезной экстравазации наступают позже, чем в контрольной группе. При этом дистрофические изменения нейронов в виде так называемых «гематок-силиновых» шаров можно наблюдать начиная с 7 ч ишемических повреждений. При окраске по Нисслю можно обнаружить, что явления необратимого повреждения нейронов в виде резкого потемнения нейронов и неразличимости ядра и цитоплазмы на фоне диффузной прокрашиваемости красителем цитоплазмы определяются с 9—12 ч эксперимента и наибольшей выраженности достигают к 24 ч. В опытной группе с терапией актовегином можно обнаружить следующие различия с контрольной группой животных. При анализе сосудисто-тканевых реакций обнаруживается более выраженное набухание ин-терстиция мозговой ткани у опытных крыс, которое развивается вплоть до деструктивного отека уже к 9 ч. При этом, как и для контрольной группы, остаются актуальными явления полнокровия сосудов, стазирования и сладжирования эритроцитов и седиментации плазмы крови в сосудах. Указанные изменения проявляются примерно на тех же сроках, что и в контроле. В отдельных случаях в коре большого мозга были обнаружены тяжелые ишемические изменения нейронов в виде колликвационного некроза на ранних сроках эксперимента. Данные изменения характеризовались кариолизисом, набуханием, сателлито-зом, нейронофагией и, в конечном итоге, образованием так называемых «клеток-теней». При исследовании микропрепаратов головного мозга крыс с ишемией-реперфузией на фоне предварительной терапии эноксифолом было обнаружено, что на морфологическом уровне тканевые изменения мозга резко отличались от изменений в контрольной группе в сторону меньшей выраженности. В первую очередь, это касается сосудистых реакций. Для животных данной группы были характерны явления спазмирования сосудов, однако кровенаполнение оставалось низким и застойные явления отсутствовали. Корме этого отсутствовали признаки диапедезного пропотевания эритроцитов через базальную мембрану капилляров. Изменения клеточного состава также было менее выраженным, чем в контрольной группе, но и здесь определялись тяжелые нарушения нейрональ-ных клеток в виде коагуляционного некроза на поздних сроках эксперимента. При окраске по Нисслю эти клетки выглядели резко уменьшенными в размерах, с гомогенной темной цитоплазмой, выраженным перицеллюлярным отеком. Такие пикноморфные нейроны в ткани мозга у крыс с эноксифолом определялись практически повсеместно. При исследовании препаратов головного мозга у крыс на фоне предварительной терапии цитофлави-ном и экспериментальным препаратом АКФ-90-7 было обнаружено, что на морфологическом уровне исследования эффективность данных лекарственных средств практически равнозначна. Это выражается в интенсивном снижении ряда патологических изменений, присущих ишемизированному мозгу. Так, у крыс данных опытных групп было отмечено снижение всех форм отечности на протяжении всего эксперимента — периваскулярной, перицеллю-лярной, интерстициальной. Также характерна минимальность сосудистых изменений — в виде спазма или паретического расширения сосудов. Однако у животных обеих групп характерным было высокое кровенаполнение сосудов с признаками сладжиро-вания эритроцитов в части из них. Нейрональные изменения становились видимыми, начиная с 12-го часа эксперимента, причем наиболее характерной формой гибели нейронов был пикноморфный коагу-ляционный некроз, что подтверждалось окраской по Нисслю. Данные об изменениях экспрессии NOS-1, NOS-3 и лиганда TNF-зависимого апоптоза TRAIL представлены в табл. 2. Таблица 2 Основные эффекты наиболее употребительных нейропротекторов при экспериментальной ишемии-реперфузии головного мозга у крыс Таким образом, на основании проведенного морфологического исследования можно сделать ряд выводов. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 1. Наиболее часто встречающиеся изменения в ткани головного мозга у крыс с ишемией-реперфу-зией последнего относятся к цитотоксическим и сосудистым проявлениям. 2. Наиболее характерные сосудистые изменения проявляются в виде сочетанного увеличения и уменьшения различных сосудов, сопровождающихся явлениями застоя крови и выходом эритроцитов в интерстициальное пространство. 3. К характерным цитолитическим изменениям можно отнести некротические явления в нейронах, протекающие по типу коагуляционного пикноморфного некроза и колликвационного повреждения с формированием «клеток-теней». По данным морфологического исследования можно сделать вывод о сопоставлении нейропротек-тивной активности используемых препаратов, причем активность убывает в ряду: АКФ-90-7 > цитофлавин > эноксифол > актовегин > мексидол.

About the authors

E. A. Ponomarev

V. V. Novochadov

N. N. Strepetov

Email: nstrepetov@mail.ru

References

Supplementary files