UPDATING THE EXRACTION OF FLAVONOIDS FROM CONYZA CANADENSIS HERB

Full Text

Лколепестник канадский (Conyza canadensis (L.) Crong. (семейство Астровые-Asteraceae) - однолетнее травянистое растение с прямостоячим округлым не разветвленным и густо облиственным стеблем высотой до 1 м. Листья линейно-ланцетные. Нижние листья черешковые пильчато-зубчатые, не густо покрытые с обеих сторон крупными жесткими вверх загнутыми волосками. По направлению к верхушке растения листья постепенно становятся меньше, на них исчезают зубцы, а волоски опушения остаются только на краях листьев. Верхние листья сидячие [5]. Соцветие узкометельчатое, образованное мелкими многочисленными корзинками. Цветоложе почти плоское. Краевые цветки пестичные, язычковые, многочисленные, расположены в несколько рядов. Внутренние цветки бледно-желтые обоеполые трубчатые цилиндрические, опушенные в верхней части короткими волосками. Плод - семянка с хохолком [6]. Родина мелколепестника канадского - восточные районы Северной Америки. В России мелколепестник канадский широко распространен на всей Европейской части, на Кавказе, в Западной и Восточной Сибири, на Дальнем Востоке. Растет по берегам рек и озер, полям, сорным местам, на песчаной почве, в садах и на огородах как сорное растение [5]. Известно, что в траве указанного растения содержатся различные химические компоненты, такие как флавоноиды, фенольные соединения, дубильные вещества, фенольные кислоты, кумарины, сапонины, витамины, органические кислоты и другие компоненты [8]. Они и обуславливают его разнообразную биологическую активность. Однако терапевтическую ценность сырья мелколепестника канадского и препаратов на его основе детермини рует комплекс фенольных соединений, среди которых первостепенную роль играют флавоноиды [6, 10]. Растение обладает противовоспалительным, вяжущим и кровоостанавливающим действием. В Америке препараты мелколепестника канадского используется главным образом как средство от диареи. В немецкой народной медицине водный настой травы мелколепестника и спиртовую настойку в виде капель употребляют как кровоостанавливающее средство при легочных, кишечных, носовых, зубных, геморроидальных, родовых и менструальных кровотечениях [8]. На Украине на его основе выпускаются препараты эрикан и канизан, которые назначают при энтерите, колите, энтероколите и других заболеваниях желудочно-кишечного тракта, сопровождающихся поносами [4]. В корейской медицине из корней мелколепестника канадского готовят отвар, настойку, обладающие аналгезирующим, жаропонижающим, диуретическим действиями и применяющиеся при радикулитах, артритах, подагре, невралгиях. Масло мелколепестника, дистиллированное из листьев, используется в некоторых штатах США как диуретик, тонизирующее и вяжущее средство [8]. Однако в России трава мелколепестника канадского не является официнальным лекарственным растением и источником лекарственного сырья, что делает его приоритетным для фармакогностического изучения и включения в число официнальных лекарственных растений. Наиболее удобным способом получения биологически активных соединений, в том числе и флавоноидов, из лекарственного растительного сырья является экстракция. В процессе экстракции лекарственного растительного сырья следует учитывать, что данный технологический процесс подвержен воздействию боль 20 Выпуск 2 (50). 2014 ©зеторСз [gofiïijf3 шого количества разнообразных факторов, которые связаны различными закономерностями [7]. В настоящее время данных о характере влияния условий экстракции на процесс извлечения флавоноидов из растительного сырья недостаточно, сведения по этому вопросу часто отрывочны и противоречивы. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Выявление оптимальных значений технологических факторов, обеспечивающих максимальный выход флаво-ноидной фракции из травы мелколепестника канадского. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Объектом исследования выступала трава мелколепестника канадского, заготовленная в фазу полного цветения (июнь-июль 2013 г.) от дикорастущих популяций в Городищенском районе Волгоградской области. Все использованные в работе реактивы имели степень чистоты ч.д.а. В основу количественного определения флавоноидов в сырье положен метод дифференциальной спек-трофотометрии, основанный на способности флавонои-дов образовывать окрашенные хелатные комплексы со спиртовым раствором алюминия хлорида в среде кислоты хлороводородной разведенной [2, 3]. Для изучения зависимости содержания флавоно-идов и полноты их экстракции из сырья получали спиртовые извлечения при следующих различных значениях следующих факторов: степень измельчения, время экстрагирования, кратность экстракции, концентрация экстрагента, соотношение сырье:экстрагент. Спиртовые извлечения получали методом мацерации по следующей методике: 1,0 г травы, измельченной до размера частиц 1 мм, помещали в колбу со шлифом вместимостью 150 мл, прибавляли 90 мл 70%-го этанола, колбу присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на водяной бане в течение 30 мин. Затем колбу охлаждали под струей воды до комнатной температуры и содержимое колбы профильтровывали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл. Объем фильтрата доводили до метки 96%-м спиртом [2, 3]. При этом в каждой серии опытов меняли значения только одного из факторов, оставляя неизменными значения других. Полученное спиртовое извлечение (5 мл) помещали в колбу на 25 мл, прибавляли 5 мл 5%-го спиртового раствора алюминия хлорида и 2-3 капли разведенной кислоты хлороводородной. Объем смеси доводили до метки 96%-м спиртом этиловым. Время прохождения реакции комплексообразования в защищенном от света месте 45 мин [2, 9]. Для приготовления раствора сравнения в колбу вместимостью 25 мл помещали 5 мл спиртового извлечения, 2-3 капли разведенной кислоты хлороводородной и доводили объем до метки 96%-м этанолом. Количественное содержание суммы флавоноидов определяли в пересчете на рутин, если максимум по глощения спиртовых извлечений был близок к спектральным характеристикам указанного флавона и располагался в области 408-420 нм. С целью определения содержания суммы флавоноидов использовали удельный показатель поглощения комплекса раствора ГСО рутина с алюминия хлоридом, который согласно литературным данным, составляет 191,0 [2]. На этом основании в формулу расчета включено теоретическое значение е1% = 191. 1см В некоторых из проведенных опытов максимум поглощения спиртовых извлечений располагался в области 421-435 нм и был близок к спектральным характеристикам другого флавона - кверцетина. В таких случаях в расчетах использовали удельный показатель поглощения комплекса раствора ГСО кверцетина с алюминия хлоридом, равный 778 [2]. Регистрацию ультрафиолетовых спектров и измерение оптической плотности продуктов взаимодействия спиртовых извлечений из сырья мелколепестника канадского с 5%-м спиртовым раствором алюминия хлорида в среде кислоты хлористоводородной разведенной проводили с помощью двулучевого спектрофотометра UV1800 («Shimadzu», Япония) в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм. Диапазон сканирования находился в пределах 200-800 нм, ширина щели - не более 1,1 нм, режим «поглощение», скорость сканирования - медленная. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин (или кверцетин) вели по формуле: Е = А ■W1 -W2 х 12 EW1 ■ m ■V 1%1см a где Ах-оптическая плотность исследуемого раствора; W1, W2 - разведения, мл; Е1%1см - ГСО рутина с алюминия хлоридом при X = 41°0снм (191); max v ' ’ (в случае пересчета на кверцетин при X = 430 нм (778)); max m - масса навески исследуемого сырья, г; V - объем аликвоты, мл. a ’ Статистическая обработка результатов химического эксперимента проводилась согласно ОФС 42-0111-09 «Статистическая обработка результатов химического эксперимента» и включала проверку однородности выборки, с последующим вычислением базовых статистических показателей, характеризующих вариационные ряды, с использованием пакета программ Statistica 6.0 (StatSoft, США) и Excel 2000 (MS Office 2000, США). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Проверку однородности выборки и идентификацию вариант, отягощенных грубыми ошибками, осуществляли исходя из размаха варьирования. Рассчитанные значения контрольного критерия (Q) не превышали Выпуск 2 (50). 2014 21 ЩШгорСз [ЩсмеТКЩ соответствующие табличные (Qтабл = 95 %) с доверительной вероятностью P = 95 %. Следовательно, ни одна из вариант не отягощена грубой ошибкой, то есть выборка считалась однородной и статистические ха рактеристики методики, соответственно, были признаны достоверными. Результаты проведенного исследования представлены в табл. Зависимость полноты извлечения суммы флавоноидов из травы мелколепестника канадского от условий экстракции Параметры экстракции Значение параметра Содержание суммы флавоноидов (Хср), % Метрологические характеристики Размер частиц сырья, мм < 1 1,250 ± 0,001 S = 0,001 S2 = 0,00001 є,% (ср.) = 0,089 < 2 1,020 ± 0,003 S = 0,003 S2 = 0,00001 є,% (ср.) = 0,315 < 3 0,982 ± 0,001 S = 0,001 S2 = 0,00001 є,% (ср.) = 0,144 < 5 0,938 ± 0,002 S = 0,002 S2 = 0,00005 є,% (ср.) = 0,261 Время экстракции, мин 15 0,998 ± 0,003 S = 0,001 S2 = 0,00001 є,% (ср.) = 0,322 30 1,25 ± 0,001 S = 0,001 S2 = 0,00001 є,% (ср.) = 0,089 45* 0,430 ± 0,001 S = 0,001 S2 = 0,00001 є,% (ср.) = 0,235 60* 0,496 ± 0,002 S = 0,005 S2 = 0,00001 є,% (ср.) = 0,113 90* 0,626 ± 0,001 S = 0,003 S2 = 0,00001 є,% (ср.) = 0,441 Кратность экстракции 1 1,250 ± 0,001 S = 0,001 S2 = 0,00001 є,% (ср.) = 0,089 2 0,724 ± 0,001 S = 0,003 S2 = 0,00001 є,% (ср.) = 0,438 3 1,107 ± 0,003 S = 0,002 S2 = 0,00001 є,% (ср.) = 0,157 Концентрация экстрагента (спирта этилового), % 40 0,662 ± 0,001 S = 0,005 S2 = 0,00002 є,% (ср.) = 0,885 50 0,789 ± 0,002 S = 0,002 S2 = 0,00001 є,% (ср.) = 0,311 60 0,980 ± 0,002 S = 0,002 S2 = 0,00001 є,% (ср.) = 0,231 70 1,250 ± 0,001 S = 0,001 S2 = 0,00001 є,% (ср.) = 0,089 22 Выпуск 2 (50). 2014 ©зеторСз [gofiïijf3 Окончание таблицы Параметры экстракции Значение параметра Содержание суммы флавоноидов (Хср), % Метрологические характеристики 80 1,053 ± 0,001 S = 0,002 S2 = 0,00001 є,% (ср.) = 0,196 95 1,010 ± 0,002 S = 0,001 S2 = 0,00001 є,% (ср.) = 0,167 Экстракция с последовательной сменой этанола 96%-й, 70%-й и 40%-й концентрации 0,808 ± 0,001 S = 0,002 S2 = 0,0004 є,% (ср.) = 0,256 Соотношение сырья и экстрагента (модуль экстракции) *1:30 0,180 ± 0,001 S = 0,003 S2 = 0,00002 є,% (ср.) = 0,092 *1:40 0,270 ± 0,001 S = 0,001 S2 = 0,0001 є,% (ср.) = 0,338 1:50 1,237 ± 0,001 S = 0,002 S2 = 0,00001 є,% (ср.) = 0,13 1:60 1,910 ± 0,003 S = 0,005 S2 = 0,00001 є,% (ср.) = 0,289 1:100 1,250 ± 0,001 S = 0,001 S2 = 0,00001 є,% (ср.) = 0,089 *Пересчет суммы флавоноидов на кверцетин. В качестве оптимального экстрагента, наиболее полно извлекающего флавоноидную фракцию, был выбран 70%-й спирт этиловый. Экстракция с последовательной сменой этанола не дала высокого выхода флавоноидов и поэтому была признана нецелесообразной. С увеличением степени измельчения сырья выход флавоноидов увеличивается. Так, максимальный выход данной группы соединений (1,25 ± 0,001) % отмечался при измельчении сырья до размеров частиц 1 мм, которое и было принято как оптимальное. Установлено, что с увеличением времени экстракции выход флавоноидов увеличивается, достигая максимального значения (1,25 ± 0,001) % (время кипячения 30 мин). Дальнейшее нагревание сопровождается гидролизом рутина с образованием кверцетина и соотношение рутин:кверцетин уменьшается, при этом наблюдается смещение максимума поглощения от 415 до 424 нм с небольшим изменением оптической плотности извлечений, характеризующихся более высоким содержанием кверцетина [максимум - (0,626 ± 0,001) %, время кипячения 90 мин]. Изучение влияния на качество извлечений модуля экстракции показало, что с уменьшением соотношения сырье:экстрагент увеличивается выход фла-воноидов, достигая своего максимума при значении 1:60 - (1,91 ± 0,003) %. При соотношении 1:100 наблюдается более низкий выход флавоноидной фракции (1,25 ± 0,001) %. Было замечено, что при уменьшении модуля экстракции в извлечение переходит преимущественно кверцетин. Однако его содержание в экстракте незначительно, что не позволит использовать полученные извлечения в практических целях. Поэтому как оптимальное нами было выбрано соотношение сырье-:экстрагент 1:60, при котором в извлечение переходит, в основном,рутин. Также было выявлено, что однократная экстракция характеризуется более высоким выходом флавоноидов (1,25 ± 0,001) % по сравнению с двух- и трехкратной, поэтому наиболее экономически и технологически целесообразно проводить экстрагирование исследуемого сырья в режиме однократной экстракции.

About the authors

A. V. Yanitskaya

I. Yu. Mitrofanova

Email: I.U.Mitrofanova@yandex.ru

J. V. Heylik

References

Supplementary files