PROGNOSTICATING THE INTENSITY OF INDUCING AH-RECEPTOR OF HUMAN LYMPHOCYTES WHEN EXPOSED TO 2,3,7,8-TETRACHLORODIBENZO-P-DIOXIN

Abstract

The possibility of prognosticating the level of induction of Ah-receptor in human lymphocytes when exposed to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin was demonstrated by studying the spontaneous and induced activity of Ah-receptor in human and animals lymphocytes in vitro and in vivo.

Full Text

Анализ механизмов действия токсикантов показывает, что существенное место в реализации их токсических эффектов занимает модуляция активности специфических для данных веществ ферментных и рецепторных систем иммунокомпетентных клеток [1, 5, 7]. Известно, что в механизме токсического действия 2,3,7,8-тетрахлордибензо-п-диоксина (2,3,7,8-ТХДД, диоксин) важнейшее место занимает активация арил-углеводородного рецептора (Ah-рецептора) [1, 4, 8]. При воздействии на организм диоксинов наибольший уровень Ah-рецептора отмечается в гепатоцитах, однако индукция происходит и в ряде других органов и тканей, в том числе в клетках иммунной системы [1, 6]. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Оценка возможности прогнозирования уровня индукции Ah-рецептора в лимфоцитах человека при воздействии 2,3,7,8-ТХДД. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ В работе использован 2,3,7,8-тетрахлордибензо-пара-диоксин, содержащий не менее 95 % основного вещества. Эксперименты проведены на мышах линий C57Bl/6, CBA, AKR, F1(C57Bl/6xDBA/2), нелинейных крысах, крысах линий Awgust, Wistar, морских свинках. При работе с экспериментальными животными руководствовались требованиями приказа Минздрава СССР №755 от 12.08.1977 г. Животных выводили из эксперимента передозировкой диэтилового эфира. Помимо этого для исследования активности Ah-рецептора в лимфоцитах человека использовалась кровь здоровых доноров, отобранная в асептических условиях. Активность Ah-рецептора определяли в условиях in vivo на 3-и сутки после внутрибрюшинного введения LD50 ксенобиотика и in vitro-после 24 часов инкубации лимфоцитов с 5-10-4 мг/мл 2,3,7,8-ТХДД. При исследовании уровня Ah-рецептора в моделях in vitro и in vivo селезенку экспериментальных животных выделяли в стерильных условиях, клеточную суспензию получали в гомогенизаторе Поттера. Лимфоциты из периферической крови и селезенки выделяли в градиенте плотности по Boyum [2]. Рабочая концентрация лимфоцитов крови человека и спленоцитов экспериментальных животных составила 2-106 клеток в 1 мл. Количество жизнеспособных клеток - не менее 95 %. Культивирование клеток проводили в 96-луноч-ных планшетах в среде RPMI1640 с добавлением 10 % фетальной сыворотки, 2мМ L-глютамина, 100 мкг/мл гентамицина и 2-10-5 М 2-меркаптоэтанола в течение 72 часов для модели in vivo или 48 часов для модели in vitro в атмосфере, содержащей 5 % СО2 при 100 % влажности. Затем для модели in vitro в культуры добавляли 2,3,7,8-ТХДД в концентрации 5-104 мг/мл. Инкубация культур клеток с диоксином составляла 24 часа. За 4 часа до конца инкубации в каждую лунку планшета добавляли по 2 мкКи [3Н]-бенз(а)пирена (молярная активность 40.. .60 Ки/моль). По окончании инкубации клетки осаждались на стекловолоконные фильтры, подсчет активности проб производился жидкостно-сцинтилляцион-ным методом [3]. Контрольные пробы, не содержащие диоксина, анализировали аналогично опытным. Рассчитывали индекс индукции, равный отношению активности Ah-рецептора при воздействии диоксина к аналогичному показателю у интактных животных того же вида и линии. Выпуск 3 (51). 2014 91 ЩШгорСз [ЩсмеТКЩ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Проведенные исследования показали, что активность Ah-рецептора у человека и интактных животных варьирует в широких пределах (табл.). Минимальный исходный уровень рецептора в лимфоцитах наблюдается у человека и мышей линии C57Bl/6, максимальный - у крыс линии Wistar. При воздействии 2,3,7,8-ТХДД индекс индукции колеблется от 1,2 раз (крысы линии Wistar) до 5 раз (крысы линии Awgust). На рис. представлена зависимость между интенсивностью индукции Ah-рецептора in vivo и in vitro у различных видов и линий экспериментальных животных после воздействии 2,3,7,8-ТХДД. Приведенные на рис. данные свидетельствуют об имеющейся связи степени индукции Ah-рецептора in vitro и in vivo (коэффициент корреляции Пирсона, равный 0,807) и, в связи с этим, о возможности использования данных показателей для прогноза состояния метаболизма 2,3,7,8-ТХДД при случайных отравлениях данным ксенобиотиком или профессиональном контакте с ним. Рис. Интенсивность индукции Ah-рецептора in vivo и in vitro у различных видов и линий экспериментальных животных при воздействии 2,3,7,8-ТХДД Исходя из известного уровня индукции in vitro для лимфоцитов человека (2,2) и базовых значений уровня Ah-рецептора, при поражении диоксином в дозе, равной LD50, активность Ah-рецептора должна возрасти в 2,6 раза. Показатели активности Ah-рецептора в лимфоцитах лабораторных животных и человека в норме и при воздействии 2,3,7,8-ТХДД в моделях in vivo и in vitro Вид,линия Активность Ah-рецептора лимфоцитов при индукции in vivo, пМ/мин/10 клеток (n) Активность Ah-рецептора лимфоцитов при индукции in vitro, пМ/мин/106 клеток (n) норма индукция индекс индукции норма индукция индекс индукции Мыши C57Bl/6 0,19 ± 0,03 (6) 0,51 ± 0,05 (5) 2,7 0,14 ± 0,01 (7) 0,42 ± 0,03 (7) 3,0 Мыши F1(C57Bl/6*DBA/2) 0,23 ± 0,02 (6) 0,52 ± 0,06 (5) 2,3 0,26 ± 0,01 (7) 0,47 ± 0,03 (7) 1,8 Мыши AKR 0,25 ± 0,04 (4) 0,44 ± 0,05 (8) 1,8 0,38 ± 0,13 (4) 0,58 ± 0,23 (4) 1,5 Мыши CBA 0,23 ± 0,02 (6) 0,45 ± 0,07 (6) 2,0 0,23 ± 0,03 (5) 0,37 ± 0,02 (5) 1,6 Крысы нелинейные 0,39 ± 0,08 (8) 0,79 ± 0,12 (8) 2,0 0,23 ± 0,03 (11) 0,54 ± 0,07 (11) 2,4 Крысы Wistar 2,10 ± 0,30 (5) 2,47 ± 1,28 (5) 1,2 3,76 ± 0,47 (5) 4,59 ± 0,86 (5) 1,2 Крысы Awgust 0,35 ± 0,10 (2) 1,75 ± 0,76 (3) 5,0 0,32 ± 0,09 (3) 1,05 ± 0,10 (3) 3,3 Морские свинки 0,71 ± 0,51 (4) 1,49 ± 0,44 (4) 2,1 0,75 ± 0,13 (3) 0,89 ± 0,13 (3) 1,2 Человек 0,15 ± 0,02 (8) - - 0,12 ± 0,01 (9) 0,26 ± 0,03 (9) 2,2 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Взаимосвязь показателей интенсивности индукции Ah-рецептора в лимфоцитах лабораторных животных при воздействии 2,3,7,8-ТХДД в условиях in vivo и in vitro дает возможность прогнозировать токсикометри-ческие параметры диоксина на основании интенсивности его метаболизма в культурах лимфоцитов. Учитывая высокую доступность иммунокомпетентных клеток человека для анализа, указанный метод можно применять для прогнозирования выраженности токсических эффектов диоксина и других веществ с аналогичным механизмом действия. ЛИТЕРАТУРА