OPTIMIZATION OF THE PROTOCOL OF DETERMINING THE LEVEL OF CELL-FREE DNA IN PLASMA

Abstract

We adapted the protocol of measuring cell-free DNA (cfDNA) level in plasma for application in clinical practice. This protocol is based on sorption extraction of DNA followed by measuring its concentration with a Qubit fluorometer. We explored the analytical parameters of this procedure. The regional reference limit of the cfDNA level in plasma of healthy volunteers was 14,7 ng/ml to 104,7 ng/ml.

Full Text

Использование внеклеточной ДНК как биомаркера в клинической медицине может стать перспективным направлением для мониторинга терапии онкологических заболеваний и прогноза течения процесса [6]. Однако тест на определение уровня циркулирующей ДНК (цДНК) нуждается в стандартизации и решении ряда аналитических проблем. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Разработка унифицированного протокола по оценке уровня внеклеточной ДНК в плазме крови и проведение аналитической валидации разработанного метода. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ ДНК выделяли с помощью набора ДНК-сорб В (Интерлабсервис, Россия) с последующим определением концентрации ДНК на флуориметре Qubit 2.0 (Invitrogen, США), используя набор Qubit dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen, США). Образцы венозной крови собирали в пробирки с ЭДТА (Improvacuter, США), клетки крови осаждали центрифугированием при 800 g в течение 15 мин, затем отбирали супернатант и центрифугировали вторично в течение 15 мин при 1600 g. Предел обнаружения (limit of detection) метода рассчитывали в соответствии с ГОСТ Р ИСО 11843-2-2007 [1] и ГОСТ Р ИСО 11843-3-2007 [2]. Оценка влияния матрицы на результаты измерения проводилась в соответствии с рекомендациями CLSI [4]. В качестве эталона был взят раствор стандартной ДНК (Invitrogen, США) с исходным содержанием ана-лита 1000 нг/мл в 5 разведениях (0 нг/мл, 25 нг/мл, 50 нг/мл, 100 нг/мл, 200 нг/мл). В качестве матрицы использовали: ТЕ-буфер (Интерлабсервис, Россия), 5%-й раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА, Диа-М, Россия) и плазму от трех добровольцев. Все измерения проводили в дупликатах. Оценку сходимости проводили на основании 20 измерений двух образцов плазмы с разным содержанием внеклеточной ДНК. Для определения параметров стабильности пробы образец c известным уровнем ДНК подвергали трем циклам замораживания и оттаивания с интервалом 24 часа. Для анализа воспроизводимости исследовали 2 образца плазмы с нормальным и повышенным уровнем цДНК. Для этого пробы аликвотировали и хранили в замороженном виде. Каждый образец измеряли в трипликатах. Для изучения стабильности пробы при воздействии комнатной температуры образец цельной крови оставляли на 1, 2, 4, 8 и 24 часа до момента центрифугирования и выделения ДНК. Для исследования длительного воздействия температуры образец с известной величиной уровня цДНК разаликвоти-ровали и заморозили при -20 оС. Далее снова анализировали содержание цДНК в 4 приготовлениях с интервалом от 1 недели до 2 месяцев. Оценку групповой биологической вариабельности и референтного интервала выполняли на образцах плазмы от 54 здоровых добровольцев. Критериями включения в данную группу были следующие: отсутствие острых воспалительных заболеваний, отсутствие аутоиммунной патологии, отсутствие инфаркта миокарда в острой фазе, отсутствие хирургического вмешательства за 10 дней до взятия биологических образцов. 84 Выпуск 2 (54). 2015 Возраст обследованных был от 19 до 57 лет, женщины составляли 39 %, а мужчины 61 %. Для расчета параметров функции отклика использовали линейный регрессионный анализ. Анализ данных, полученных при изучении стабильности пробы, проводили с привлечением многофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующими множественными сравнениями по Даннету. Для оценки репрезентативности группы здоровых добровольцев рассчитывали накопленное среднее значение и стандартное отклонение показателя уровня цДНК (для N от 10 до 54). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Предел обнаружения метода, рассчитанный в соответствии с рекомендациями ГОСТ Р ИСО 11843-2-2007, составил 16,9 нг/мл, в соответствии с ГОСТ Р ИСО 118433-2007, составил 11,2 нг/мл (рис. 1). Эти величины существенно ниже, чем уровень цДНК, определенный флуориметрическим методом, приведенный в статьях разных авторов [3, 5]. трации ДНК (рис. 2). Относительная ошибка данных (Д[цДНК]/[цДНК]свежей %) увеличивается после второго размораживания образца до 54 %. Это может являться следствием того, что количество ДНК в ядрах клеток значительно превосходит их уровень во внеклеточном пространстве. Поэтому лизис нескольких оставшихся в супернатанте клеток может значительно увеличить уровень цДНК. Зависимость параметров функции отклика (Y = a + bX) от вида матрицы (M ± 1,96*m) Параметры a b R2 ТЕ 6,0 ± 3,0 0,90 ± 0,03 0,99 5% БСА 7,8 ± 4,5 0,89 ± 0,04 0,99 Плазма 1 42,7 ± 7,4 0,93 ± 0,07* 0,99 Плазма 2 31,4 ± 5,8 0,94 ± 0,06* 0,99 Плазма 3 48,5 ± 9,3 0,95 ± 0,09* 0,98 *p > 0,05 при сравнении с параметром b при использовании ТЕ-буфера. Рис.1. Зависимость измеренного уровня ДНК от приготовленного разведения ДНК с указанием коэффициента вариации Результаты оценки влияния матрицы на параметры функции отклика приведены в табл. Вариация значения функции отклика (параметр а, табл.) при разведении плазмой, очевидно, связана с неодинаковым содержанием аналита в разных биологических образцах. Коэффициент чувствительности (b, табл.) и коэффициент детерминации (R2) при использовании всех тех матриц был близок к 1. Значение параметра b статистически значимо не отличалось при использовании всех трех матриц. Таким образом, существенного влияния матрицы на результаты определения ДНК не выявлено. Однократное замораживание не влияет на уровень цДНК (р = 0,67). При последующих циклах происходит статистически значимое повышение концен Цикл разморозки Рис. 2. Стабильность образца плазмы при замораживании-оттаивании, (М ± 1,96 m) Хранение образца крови до центрифугирования от 1 часа до 4 не оказывает существенного влияния на уровень цДНК (рис. 3), при хранении образца более 4 часов происходит статистически значимое повышение уровня цДНК на 24 %, что может быть связано с выходом ДНК из клеток крови. Поэтому образцы плазма должны быть отделены от клеток крови не более чем через 4 часа после венепункции. Хранение образца плазмы при -20 оС в течение 2 месяцев не приводит к достоверному изменению уровня внеклеточной ДНК (рис. 4). При оценке воспроизводимости процедуры анализа уровня цДНК в плазме крови для различных концентраций цДНК - 38,2 нг/мл, 295,7 нг/мл коэффициент вариации составил соответственно 8,1 и 8,3 %. При оценке сходимости результатов Выпуск 2 (54). 2015 85 ІШторСз коэффициент вариации при уровне цДНК 54,5 нг/мл составил 5,9 %, при уровне 180,5 нг/мл составил 4,8 %. хранение цельной крови,ч Рис. 5. Распределение обследованных по уровню цДНК Рис. 3. Влияние хранения образца крови при комнатной температуре до центрифугирования, (М ± 1,96 m) хранение плазмы, недели 100 - 10 20 30 40 50 60 объем выборки,человек Рис. 6. Зависимость стандартного отклонения от объема выборки Рис. 4. Влияние длительного хранения образца плазмы при -20 оС, (М ± 1,96 m) Отметим, что ни в одной из серий коэффициент аналитической вариации не превышал 10 %. Таким образом, по аналитическим характеристикам метод соответствует приемлемому для клинических исследований уровню качества измерений. Распределение результатов измерения уровня цДНК в группе здоровых добровольцев оказалось крайне асимметричным (рис. 5). Несмотря на это, после 47 наблюдения (рис. 6) среднее значение и стандартное отклонение стабилизировались. Поэтому объем выборки 54 человека оказался достаточным для оценки референтного интервала. Медиальное значение уровня цДНК составило 28 нг/мл, у 41 обследованного (75 %) концентрация цДНК была менее 40 нг/мл, в то время как у 6 обследованных (11 %) уровень цДНК превышал 90 нг/мл. Мы не стали исключать данных пациентов, хотя достаточно высокие значения уровня цДНК могут быть обусловлены наличием пока еще недиагностирован-ной патологии. При установлении верхней границы референтного интервала мы предлагаем использовать значение 95-го перцентиля от 0, так как диагностическое значение имеет только повышение уровня цДНК. Корреляции между уровнем цДНК и возрастом не выявлено (по Спирмену, R = 0,055; р = 0,68). При сравнении уровня цДНК у мужчин и женщин статистически значимых различий не обнаружено (по Манну-Уитни, р = 0,38). 86 Выпуск 2 (54). 2015 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Предложенный в работе протокол позволяет получать результаты с приемлемым для клинических исследований уровнем качества измерения. Стабильность замороженного образца плазмы при 2-месячном хранении позволяет рассчитывать на возможность применения сливной плазмы в качестве контрольных материалов. Региональный референтный предел уровня циркулирующей ДНК плазмы крови условно здоровых добровольцев составил 14,7-104,7 нг/мл. Какой-либо связи между возрастом, полом и уровнем цДНК не выявлено.