URINARY N-ACETYL-BETA-D-GLUCOSAMINIDASE ACTIVITY IN URINE FROM PREGNANT WOMEN

Abstract

We determined the analytical characteristics, including the limit of detection and quantification, of the spectrophotometric method used to measure urinary N-acetyl-β-D-glucosaminidase activity. The reference value for urinary NAG activity was found to be 0.73-4.0 U/mmol creatinine.

Full Text

Ранняя диагностика почечной патологии является чрезвычайно актуальной проблемой для современной медицины, так как распространенность ХПН среди жителей Российской Федерации составляет 2-3 % [1]. Перспективным направлением представляется исследование специфических белков, указывающих на повреждение ткани почек [7]. Однако изучение и внедрение в клиническую практику биохимических маркеров патологии почек находятся на различных стадиях разработки. В настоящее время №ацетилф-й-глюкозаминидаза (NAG) считается наиболее специфичным маркером раннего повреждения почек [5]. №ацетилф-й-глюкозаминидаза представляет собой лизосомальный фермент, представленный в большем количестве в клетках проксимальных канальцев почек. ЩШгорСз [ЩсмеТКЩ В настоящее время в литературе представлены данные по изучению изменения уровня активности данного фермента во время беременности. Многочисленные данные, полученные за последние годы, позволяют позиционировать NAG как потенциальный маркер преэклампсии у беременных или раннего тубулярного повреждения почек [5]. Однако в настоящее время нет четких референтных диапазонов по нормальной активности NAG в моче или других жидкостях, особенно для такого контингента, как беременные. Это стало предпосылкой к проведению нашего исследования. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Проведение валидации спектрофотометрического метода определения активности №ацетил-р^-глюкоза-минидазы в моче и оценка прогностической значимости определения ее активности в моче беременных женщин для диагностики ренальной патологии при гестозах. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Активность фермента №ацетил-р^глюкозаминида-зы в моче определяли спектрофотометрическим методом, описанным K. Sato [6]. Оценку аналитических характеристик метода проводили согласно рекомендациям ГОСТ [2]. Для оценки аналитических характеристик метода определения активности NAG использовали образец мочи с активностью фермента 7,72 Ед/л. Эта величина активности была получена путем пятикратного измерения образца мочи. Оценку предела обнаружения проводили в 8 разведениях (физиологическим раствором) в трех приготовлениях. Для расчета предела обнаружения согласно рекомендациям IHC [4] использовали результаты 10-кратного измерения активности фермента в образце мочи с низкой активностью NAG (0,38 Ед/л). На клиническом этапе использовались образцы проб мочи 75 беременных, предоставленные МУЗ «Женская консультация № 1» г. Волгограда в течение одной календарной недели. Возраст обследованных беременных женщин колебался от 18 до 45 лет. При анализе амбулаторных карт оказалось, что в общей группе женщины с диагнозом гестоз составили 10,67 %, с сопутствующей патологией - 17,33 %, с диагнозом пиелонефрит - 6,67 %, женщины с беременностью без особенностей - 65,33 % соответственно. Среди них на первом триместре беременности оказались 26,53 % женщин, на втором - 53,06 %, на третьем - 20,41 %. Моча (утренняя порция) собиралась по общепринятой методике, после туалета наружных половых органов в пластиковые контейнеры. Образцы для исследования выделяли путем центрифугирования нативной мочи со скоростью 3000 оборотов в минуту в течение 10 мин и хранили до анализа при - 20 0С. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Аналитические характеристики спектрофотометрического метода определения активности NAG в моче Полученная функция отклика метода приведена на рис. 1. Данная прямая описывается уравнением: А405 = (0,056 ± 0,001) X С + 0,033 ± 0,001, где А405-оптическая плотность реакционной смеси при длине волны 405 нм, С - активность NAG в пробе. Коэффициенты в уравнении приведены с указанием ошибки. R2=0,974 0,45 0,00 ................................................................................. 012345678 Активность NAG, Ед/л Рис. 1. Зависимость активности NAG от оптической плотности при разведении образца мочи физиологическим раствором Зависимость оптической плотности от активности фермента оказалась линейной в диапазоне от 0 до ~ 4 Ед/л (коэффициент детерминации R2 составил 0,947). Коэффициент чувствительности составил 0,033. Достоверно отличная от 0 величина смещения (0,056 о.е.) может свидетельствовать о незначительной спонтанной деградации субстрата за время проведения анализа. Однако в случае повышение активности фермента выше 4 Ед/л, перед анализом образцы мочи следует разводить физиологическим раствором в 3 раза для работы в линейном диапазоне концентраций. В результате проведенного исследования были получены следующие значения предела обнаружения по рекомендациям различных ассоциаций: 0,275 Ед/л согласно ГОСТ [2]; 0,244 Ед/л - IHC[4]; 0,636 Ед/л - IFCC [3]. Поскольку для активности NAG в моче биологическая вариабельность неизвестна по определению, то в прогностических целях мы использовали зависимость аналитической вариабельности от активности NAG (рис. 2). Что касается величины предела количественного определения, то способы оценки по ГОСТ [2] и IHC [4] имеют чисто аналитический аспект. Величина предела количественного определения, рассчитанная согласно этим документам, составила 0,739 Ед/л. Вместе с тем, согласно рекомендациям IFCC, - это такая величина определяемой характеристики, при которой обеспечивается определенное соотношение между аналитической и биологической вариабельностью [3]. 114 Выпуск 2 (54). 2015 14 0 і..........I , . I I I I . I I I I . I I I , . , 1 I I . 1 I I I . 1 , I 012345678 Активность NAG, Ед/л Рис. 2. Зависимость коэффициента вариации от активности NAG Согласно полученной зависимости, при уровне активности фермента 0,739 Ед/л коэффициент вариации метода равен примерно 7 %. То есть, при данном уровне активности достижимо оптимальное качество измерений (IFCC и ГОСТ [2]), если значение биологической вариабельности будет не ниже 28 %. Полученные нами данные позволяют сделать вывод о том, что методика, предложенная K. Sato с со-авт. [6], может быть использована для определения активности NAG в моче при модификациях этапа подготовки пробы. Получен предел количественного определения активности фермента, равный 0,739 Ед/л. 2. Активность NAG в моче беременных женщин Результаты определения активности NAG во всех образцах оказались выше пределов обнаружения, рассчитанных согласно рекомендациям ГОСТ, IHC, IFCC. Активность NAG ниже порога обнаружения, равного 0,636 Ед/л по методу IFCC, оказалась всего у 3 беременных (4 % случаев). При анализе уровня активности фермента в пробах мы производили перерасчет на 1 ммоль креатини-на. Отметим, что оценка верхнего референтного предела (М + 2s) для NAG взята нами из литературного источника [5]. Для спектрофотометрического метода она составляла 3 Ед/ммоль креатинина. При анализе полученных данных было установлено, что в группе женщин ІІІ триместра беременности и группе с диагнозом гестоз значения активности NAG превысили верхнюю границу референтного интервала в 20 и 12,5 % случаев соответственно (рис. 3). В то время как все остальные группы оказались в границах интервала, указанного в литературных данных [5]. Сравнение данных с привлечением медиальных оценок не выявило достоверных различий распределения по группам (по критерию Краскел-Уоллиса). Вместе с тем, данные, приведенные на рис. 3, указывают на увеличение медиальных оценок в группах женщин ІІ и ІІІ триместра беременности, гестоз, другую патологию. Действительно, доля пациенток с активностью NAG выше 0,32 (медиана для І триместра) оказалась достоверно выше в 84,6 % случаев (р = 0,015), чем в І триместре. В группе женщин с указанием на патологию доля пациентов с активностью более 0,32 оказалась достоверно выше в 85,7 % случаев, р = 0,037. Референтный интервал [92, 104] Активность NAG в моче, Ед/ммоль креатинина Рис. 3. Распределение беременных женщин по уровню активности NAG Ед/ммоль креатинина в моче с учетом диагноза в амбулаторной карте и триместра беременности Следует отметить, что значение 97,5 % перцентиля не превышало 3,53 Ед/ммоль креатинина для группы норма и 3,87 гестоз. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, было установлено, что спектрофотометрический метод может быть внедрен в лабораторную практику для определения активности N-ацетил-ß-D-глюкозаминидазы в моче. Однако технологическая процедура требует некоторой модификации хроматографических колонок в связи с достаточно трудоемким этапом пробоподготовки. Следует отметить, что для определения активности NAG в моче необходимо нормирование ее уровня на концентрацию креатинина в моче, т.к. уровень u-креатинина отражает одновременно СКФ и эффективность тубулярной секреции. Получена оценка референтного интервала активности NAG в моче для беременных. На наш взгляд, он может быть принят равным 0,739-4,0 Ед/ммоль креа-тинина.