BIOPRINTING OF ORGANS AND TISSUES

Full Text

Ежегодно в мире выполняется 100 тысяч трансплантаций органов и более 200 тысяч - тканей и клеток человека. Из них до 26 тысяч приходится на пересадку почки, 8-10 тысяч - печени, 2,7-4,5 тысячи -сердца, 1,5 тысячи - легких, 1 тысяча - поджелудочной железы. Лидером среди государств мира по количеству проводимых трансплантаций являются США. Ежегодно американские врачи выполняют 10 тысяч пересадок почек, 4 тысячи - печени, 2 тысячи - сердца. В России ежегодно производится 4-5 трансплантаций сердца, 100-120 - печени, 500-800 - почек [1-4]. Этот показатель в сотни раз ниже потребности в данных операциях. Согласно исследованию американских экспертов, расчетная потребность количества трансплантаций органов на 1 млн населения в год составляет: почка - 74,5; сердце - 67,4; печень - 59,1; поджелудочная железа - 13,7; легкое - 13,7; комплекс сердце-легкое - 18,5 [5]. По данным статистики, в 2013 г. в России зарегистрировано более 12 млн случаев переломов костей, большинство из которых требуют костной пластики [6, 7]. Опухоли костей, туберкулез костей и суставов, заболе ваемость которым увеличилась на треть, также приводят к формированию костных дефектов, требующих своего замещения [8]. С каждым годом в России возрастает на 2 % количество трепанаций черепа, которые требуют в последующем закрытия посттрепанационных дефектов. Ежегодно только в Российской Федерации 25 тысяч человек нуждаются в нейрохирургической помощи по поводу краниальной посттравматической патологии, а количество инвалидов уже превышает 2 млн человек [9]. В результате травм происходит повреждение и суставного хряща. Посттравматический артроз только голеностопного сустава развивается в 60 % случаев [10-13]. Нехватка донорских органов, доступных для трансплантации, длительность ожидания операции, срочность ее выполнения после изъятия органа, дороговизна традиционной пересадки и проблемы иммуносовместимости донорских тканей создают необходимые предпосылки для поиска альтернативных, более безопасных, экономичных и эффективных технологий. Очевидно, что решение данной проблемы путем биопечати является далеким будущим. Между тем замещение кожи, ЩШгорСз [ЩсмеТКЩ костной и хрящевой ткани является для ученых уже сейчас достижимой задачей [14-18]. Современные методы диагностики позволяют неинвазивно получать информацию о микроанатомии человека. Так, полученные при спиральной компьютерной томографии (КТ) или магниторезонансной томографии (МРТ) поперечные и продольные срезы любого участка тела позволяют судить о топографии органов и очаге заболевания. Дальнейшая компьютерная обработка данных обеспечивает создание трехмерных виртуальных моделей как отдельных органов и органных комплексов, так и организма человека в целом [19, 20]. Благодаря развитию аддитивных технологий 3D печати появилась возможность материализовать виртуальные 3D модели, применяя послойный принцип создания объектов, когда на горизонтальную поверхность наносится тонкий слой материала, затем сверху этого слоя накладывается следующий, пока не будет целиком создан объект сложной формы. Одной из разновидностей 3D принтеров являются биопринтеры. Данные устройства способны создавать органы и ткани, послойно нанося биологический материал. Исследования в области биопечати проводятся во всем мире [21]. Одним из основных направлений исследований является разработка технологий создания имплантируемых биоискусственных систем, состоящих из каркаса на основе биосовместимых материалов и жизнеспособных функционирующих клеток. Биоискусственные системы сочетают в себе свойства живой и неживой материи. Основным их предназначением является полная или частичная замена функции утраченных органов или тканей. Имплантируемые в организм человека биоискусственные системы являются своего рода биоинкубаторами, обеспечивающие клеткам необходимые условия для пролиферации, дифференциации и функционирования. В последнее время высказываются предположения, что терапевтическая функция таких систем заключается в биостимуляции регенерации собственных клеток поврежденных органов и тканей реципиента [22, 23]. Одной из инновационных разработок XXI века, которая позволит в будущем снизить уровень инвалидности и смертности, повысит доступность органов и тканей для трансплантации, является биофабрикация [24]. Биофабрикация - это процесс искусственного создания органов и тканей из собственных клеток пациента с использованием биопечати. В нее входит три стадии: препроцессинг, процессинг, постпроцессинг [25]. Препроцессинг. Исходными данными для биопечати тканевых и органных конструкторов является их компьютерная трехмерная модель. Для ее создания возможно использование данных КТ и МРТ. Применение методик компьютерного моделирования позволяет добавлять необходимые параметры будущим биоимплантатам еще на этапе препроцессинга [26]. Для проектирования органа и ткани необходимо учитывать три уровня: макро-, микро- и наноорганиза цию создаваемой области. Под макроархитектурой подразумевается форма, отражающая анатомические особенности и специфичность органа. Микроархитектура включает в себя структуру ткани, например, размер пор, их форму, проницаемость, пространственное распределение клеток и соединение между порами, тогда как наноархитектура органа учитывает поверхностные модификации на клетках, бимолекулярное взаимодействие для клеточной адгезии, пролиферации и дифференци-ровки [27]. Процессинг. Ключевыми компонентами создания биоимплантата являются скаффолд, аутологичные стволовые клетки и биоактивные вещества [28]. Источником аутологичных стволовых клеток (СК) могут являться различные виды тканей (эмбриональная, жировая ткань, костный мозг, слизистая ротовой полости и др.). Наиболее часто используют в настоящее время для получения СК костный мозг. Однако процедура выделения клеток из него представляет собой инвазивную болезненную операцию, которая ведет к образованию нового дефекта в донорском участке. В отличие от этого жировая ткань может быть получена минимально-инвазивным способом - липэктомией или липосакцией [29-31]. Биоактивные вещества должны обеспечивать индукцию клеточной дифференцировки, способствовать адгезии стволовых клеток носителя, а также стимулировать ангиогенез. В группу данных веществ входят в основном различные ростовые факторы (TGF-ß, в том числе и BMP, IGF, FGF, PDGF, VEGF и др.) [32, 33]. Скаффолды представляют собой трехмерные пористые или волокнистые матрицы, основная функция которых состоит в обеспечении механического каркаса для клеток [34]. Проводимые за рубежом и в России разработки матриксов (скаффолдов) как носителей клеток при трансплантации можно разбить на две большие группы: создание матриксов из биостабильных материалов (биостабильные синтетические полимеры, сплавы, керамика) и из биодеградируемых материалов искусственного или природного происхождения [35] Наиболее часто в биопечати в качестве скаффол-дов используют гидрогели, в состав которых могут входить следующие вещества: альгиновая кислота или альгинат [36, 37], хитозан [38], желатин [39], гиалуроно-вая кислота [40, 41], агароза [42], коллаген [43, 44], плю-роник [45], матригель [46], метилцеллюлоза [47, 48], метилцеллюлоза [49], фибрин [50]. Выделяют следующие основные технологии биопечати: Laser assisted bio-printers, Laser free bio-printers, экструзионная. В технологии биопечати «Laser assisted bio-printers (LaBP)» используется лазер, система фокусировки и подложка с нанесенным биоматериалом. Размер капли регулируется энергией и длительностью импульса. Однако использование лазера приводит к низкой выживаемости клеток. Пространственное разрешение системы составляет 30-100 мкм. Отсутствие жидкости- 4 Выпуск 3 (63). 2017 носителя в конструкции решает проблему засорения сопла. Данная технология характеризуется низкой скоростью печати (102 капли/с), рис. 1 [51]. В технологии биопечати «Laser free bio-printers (LFBP)» биоматериал подается из резервуара за счет пьезоэлектрического, электростатического или механического привода. При применении пьезоэлектрической печатающей головки пьезоэлемент изменяет диаметр трубки, по которой подается биоматериал. Технологии LFBP имеют более высокую скорость печати (10-50 мкм/с), но при этом жизнеспособность клеток составляет 40-80 %, рис. 2 [42-51]. В экструзионных биопринтерах биоматериал формируется при изменении давления в резервуаре (например, при движении поршня), табл. Постпроцессинг. После завершения биопечати созданный органный конструктор помещается в биореактор или инкубатор. Данное оборудование поддерживает необходимые условия для жизнедеятельности клеток [52]. Примеры практической реализации технологии. В 2002 г. Накамура одним из первых создал трехмерную структуру из живых клеток при помощи 3D принтера. Чтобы клетки не высыхали и сохраняли форму, Рис. 1. Схематическое изображение различных методов: А - Laser-Guided Direct Write (LGDW) - лазерный луч фокусируется в суспензии частиц, которые оседают на поверхности мишени; B - MAPLE DW - лазерный импульс фокусируется на верхней поверхности и «выбивает» биологический материал с нижней стороны подложки; С - Inkjet technology - биоматериал наносится за счет пьезоэлектрического, электростатического или механического привода thermal piezoelectric pneumatic piston screw heater vapor bubble piezoelectric actuator 4 II inlet Рис. 2. Примеры реализации печатающих головок («Laser free bio-printers») Сравнение технологий биопечати [42-46] Тип печати Скорость печати Выживаемость клеток, % Плотность клеток Laser-based biofabrication Laser-Guided Direct Writing (LG DW) Непрерывная (9 x 10 8мл/с) - 108 клеток/мл Modified LIFT (Laser Induced Forward Transfer) 102 капель/с 95-100 108 клеток/мл Laser free bio-printers Thermal 5 x 103 капель/с 75-90 < 106 клеток/мл Piezoelectric 1 x 104 капель/с > 85 < 106 клеток/мл Solenoid valve 6500 капель/с 85-99 5 x 105 c клеток/мл Robotic dispensing 50 нм/с 40-80 Клеточные сфероиды Выпуск 3 (63). 2017 5 ЩШгорСз [ЩсмеТКЩ печать ими осуществлялась в специальном растворе альгината натрия и хлорида кальция. В 2008 г была создана рабочая модель биопринтера, которая осуществляет печать биотрубочек, похожих на кровеносные сосуды [53]. Один из первых серийных биопринтеров «NovoGen MMX» создан инженерами компании Invetech и медицинскими специалистами Organovo. В него загружаются биочернильные сфероиды, наполненные десятками тысяч клеток. При печати он создает первый слой на «биобумаге», изготовленной из коллагена, желатина или других гидрогелей. Затем в него вводятся (впрыскиваются) сфероиды. Слой добавляется за слоем до создания конечного объекта. Клетки формируются в маленькие капельки диаметром от 100 до 500 микрон, которые хорошо держат форму. Биочернильные сфероиды медленно сливаются. После этого «биобумага» растворяется или удаляется. Для создания трубчатых структур, таких как кровеносные сосуды, вначале наносится гидрогель (внутри и снаружи будущей структуры), затем добавляются клетки. Как только сформируется орган, гидрогель снимается с наружной части (как кожура апельсина) и вытягивается из внутренней части [54]. В декабре 2010 г. компания Organovo создала при помощи биопринтера первые кровеносные сосуды и нервные волокна с использованием клеток, полученных от одного донора. В 2006 г. Anthony Atala вместе со своими коллегами из Wake Forest Institute for Regenerative Medicine в Северной Каролине, США напечатали мочевой пузырь. В 2015 г. - конструктор скелетной мышцы (рис. 3), размерами 15 мм x 5 мм x 1 мм из миобластных клеток мыши, костный (3,6 см * 3,0 см * 1,6 см) и хрящевой (3,2 см * 1,6 см * 0,9 см) трансплантаты [55]. Рис. 3. Напечатанный на биопринтере конструктор скелетной мышцы Американские специалисты из Массачусетской больницы общего профиля (Massachusetts General Hospital) под руководством Коркута Югуна успешно пересадили нескольким крысам печень, выращенную в лаборатории из аутологичных клеток [56]. Первый российский биопринтер Fabion, печатающий сфероидами, был создан компанией Bioprinting Solutions. В 2015 г. на данном биопринтере был напечатан конструктор щитовидной железы, который имплантировали лабораторным мышам. В ходе исследования была доказана его жизнеспособность [57]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Несмотря на достижения в биофабрикации, создаваемые с помощью биопринтеров, тканевые и органные конструкторы являются небольшими по размеру и слишком хрупкими для имплантации человеку. Кроме того, они лишены кровеносных сосудов, отчего их размер диктуется пределом диффузии кислорода и питательных веществ (200 микрон). Существуют различные материалы и их комбинации для биопечати. Однако несмотря на их разнообразие, универсального и оптимального скаффолда для создания тех или иных тканей до сих пор не разработано. Жизнеспособность клеток в имеющихся матриксах в большинстве случаев не превышает 30 дней. Наиболее часто используют различные гидрогели. Наиболее перспективной технологией биопечати, по мнению авторов, является экструзионная с применением в качестве «биочернил» клеточных сфероидов. ЛИТЕРАТУРА

About the authors

R. O. Gorbatov

Privolzhsky Federal Medical Research Center

Email: gorbatov.ro@yandex.ru

A. D. Romanov

Nizhny Novgorod State Technical University. RE Alekseeva

References

Supplementary files