MORPHOFUNCTIONAL CHANGES OF THE DORSAL AND VENTRAL HIPPOCAMPUS OF RATS IN MODELING THE COMBINED STRESS WITH CASPASE-3 AND GFAP EXPRESSION

Full Text

Hippocampus, caspase-3, GFAP, stress, rat. Стресс является одним из факторов риска раз- денческие нарушения зависят от нейропластических личных нейропсихологических состояний, таких как деп- механизмов в гиппокампе [2]. рессия, тревожные расстройства и деменция [7, 9]. Несмотря на значительный интерес к проблеме, Изменения в когнитивных процессах, связанных со основная масса работ имеет функциональную направ-стрессом, таких как обучение и память, а также пове- ленность по изучению дорсального и вентрального 82 Выпуск 1 (65). 2018 отделов гиппокампа [6], при этом морфологические особенности данных отделов остаются малоизученными. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Изучение структурных изменений в СА1 и СА3 дорсального и вентрального отделов гиппокампа у 12-месячных крыс при моделировании комбинированного стресса с учетом экспрессии caspase-3 и глиального фибриллярного кислого белка (GFAP). МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Исследование проводилось на 20 нелинейных белых крысах-самцах в возрасте 12 месяцев (ФГПУ Питомник лабораторных животных «Рапполово») с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». 1 группа - контрольные крысы (n = 10), 2 группа - стрессированные крысы (n = 10). Моделирование стрессового воздействия проводилось путем комбинирования нескольких стрессор-ных раздражителей (пульсирующий свет, громкий звук, вибрация [3]. Головной мозг фиксировали в нейтральном забуференном 10%-м формалине. Окрашивание срезов осуществлялось тионином по методу Ниссля, определяли ряд морфометрических параметров (табл.), экспрессию caspase-3 (поликлональные кроличьи антитела GeneTex, Inc., 1:100) и GFAP (мышиные моноклональные антитела Thermo Scientific, NeoMarkers, Fremont, CA, USA, RTU). На срезах с применением иммуногистохимичес-кого метода оценивали интенсивность окрашивания в баллах от 0 до 3 (0 - иммунонегативная реакция; 1 -слабо выраженное окрашивание; 2 - умеренно выраженное окрашивание; 3 - максимально выраженное окрашивание), уровень экспрессии caspase-3 путем подсчета удельного количества иммунопозитивных нейронов; с использованием программы ZEN 1.1.2.0 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Germany) рассчитывали относительную площадь GFAP-иммунореактивного материала (ИРМ). Статистическую обработку данных проводили с использованием пакетов программ Statistica 6,0 (StatSoft, USA). Обобщенные данные представляли в виде медианы (Me) с указанием интерквар-тильного интервала (Q1-Q3), где Q1 - 25 процентиль, Q3 - 75 процентиль. Различия между группами оценивали по непараметрическому критерию Манна-Уитни (Mann-Whitney, U-test) и считали статистически значимыми при p < 0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ При нейрогистологическом исследовании СА1 ДОГ 12-месячных стрессированных крыс существенных различий в строении пирамидного слоя, по сравнению с крысами контрольной группы, обнаружено не было (табл.). Напротив, в пирамидном слое СА1 вентрального отдела гиппокампа (ВОГ) было выявлено достоверное увеличение удельного количества сморщенных нейронов с ги-перхроматозом цитоплазмы на 17 % (р < 0,05), по сравнению с контрольной группой животных (табл.). Наиболее выраженные изменения у 12-месячных крыс, подвергнутых стрессовому воздействию, отмечались в пирамидном слое СА3 ДОГ Удельное количество сморщенных гиперхромных нейронов в группе 12-месячных стрессированных крыс увеличивалось на 15,6 % (р < 0,05) (табл.). В СА1 ДОГ у животных, подвергнутых комбинированному стрессу, нейроны пирамидного слоя располагались в 2-3 слоя, в СА3 - в 2-6 слоев. По сравнению с крысами контрольной группы в СА1 у стрессированных животных отмечалось уменьшение ширины пирамидного слоя на 8,4 % (р < 0,05), в СА3 - на 13,1 % (р < 0,05) (табл.). В пирамидном слое СА1 и СА3 ВОГ нейроны располагались в 3-6 слоев. Морфометрическая оценка средней ППН в пирамидном слое СА1 и СА3 ДОГ продемонстрировала значимое уменьшение данного параметра у стрессированных крыс по сравнению с контрольными животными (р < 0,05) (табл.). Достоверные различия в снижении Изменение морфометрических параметров нейронов пирамидного слоя гиппокампа крыс, Ме (Q1-Q2) Морфометрические показатели Дорсальный отдел гиппокампа Вентральный отдел гиппокампа конт роль стресс конт роль стресс СА1 СА3 СА1 СА3 СА1 СА3 СА1 СА3 Удельное количество сморщенных нейронов с гиперхроматозом цитоплазмы, % 3,9 (1,710,9) 10 (6,814) 5,8 (1,1 14,9) 25,6* (14,6 46,4) 4,9 (3,1 15,1) 14,2 (4,8 34,9) 21,9* (12,3 54,7) 14,7 (6,6 43,3) Ширина пирамидного слоя, мкм 36,7 (31,2 42,8) 55 (43,8 70,7) 33,6* (28,4 36,3) 47,3* (36,7 59,7) 48,9 (44,6 61,2) 58,6 (50,4 73,8) 51,7 (44,4 62,4) 61,2 (54,4 68,9) Площадь перикарионов нейронов, мкм2 117,9 (101,7 136,2) 140,7 (107,1 172,8) 100* (83,9 119,1) 126,4* (85,7 164,1) 105,5 (84,9 132,1) 158,8 (130,4 190) 100,4 (83 118,9) 132,8* (89,8 166,7) Относительная площадь перикарионов нейро-нов,% 42,5 (37,2 45,6) 41,3 (36,1 46,9) 41,1 (31,3 48,9) 35,4* (30,5 44,8) 39,6 (35,1 44,9) 38,2 (33,3 43,6) 41,1 (30,2 46,8) 35,4 (31,3 42,5) *p < 0,05 - значимые различия при сравнении с группой контроль, критерий Манна-Уитни. Выпуск 1 (65). 2018 83 ІШторСз относительной ППН обнаруживались в пирамидном слое СА3 (р < 0,05) (табл.). В ВОГ у животных, подвергнутых действию комбинированного стресса, средняя площадь перикарионов снижалась только в СА3 (р < 0,05). При оценке результатов иммуногистохимического (ИГХ) исследования ДОГ крыс, находившихся в течение 7 суток под влиянием комбинированного стресса, с использованием антител против caspase-3, в отличие от крыс контрольной группы, в цитоплазме нейронов пирамидного слоя СА1 и СА3 преобладала умеренно выраженная экспрессия ИРМ (2 балла) (рис. 1). Caspase-3-ИРМ локализовался как в цитоплазме неизмененных перикарионов нейронов, так и сморщенных. В отдельных глиоцитах молекулярного, радиального и пирамидного слоев отмечалась выраженная экспрессия ИРМ. Удельное количество иммунопозитивных нейронов в пирамидном слое СА1 ДОГ у стрессирован-ных животных достоверно увеличивалось на 36,4 % (р < 0,05), по сравнению с контрольной группой, и составило 36,4 (25-47,6) %. В СА3 удельное количество иммунопозитивных нейронов увеличивалось на 13,8 % (р < 0,05) и у крыс, находившихся под влиянием комбинированного стресса, составило 13,8 (7,7-40) %. При оценке результатов ИГХ исследования ВОГ крыс с использование антител к caspase-3 в цитоплазме большинства перикарионов нейронов пирамидного слоя СА1 и СА3, как и в контрольной группе животных, отмечалась иммунонегативная реакция. В единичных полях зрения пирамидного слоя СА1 и СА3 встречались нейроны со слабовыраженной гранулярной цитоплазматической экспрессией в перикарионах. При этом достоверно значимых различий в изменении удельного количества иммунопозитивных нейронов пирамидного слоя СА1 и СА3 между контрольными и стресси-рованными животными обнаружено не было. При ИГХ исследовании ДОГ крыс, находившихся в течение 7 суток под влиянием комбинированного стресса, с использованием антител к GFAP наблюдалась выраженная цитоплазматическая экспрессия в астроцитах пирамидного, радиального и молекулярного слоев СА1 и СА3 (3 балла). Однако в отличие от животных контрольной группы GFAP-иммунопозитивные астроциты концентрировались преимущественно в прилегающих к пирамидному, краевом и радиальном слоях и GFAP-ИРМ в отростках астроцитов характеризовался умеренной и выраженной степенью экспрессии (рис. 2). Рис а б 1. Гистологическое строение СА3 дорсального отдела гиппокампа крысы в возрасте 12 месяцев (а) и крысы в возрасте 12 месяцев, находившейся в течение 7 суток под влиянием комбинированного стресса (б). Иммуногистохимическое исследование, антитела против caspase-3, докраска гематоксилином. Ув. Х 400 а б Рис. 2. Гистологическое строение СА1 дорсального отдела гиппокампа крысы в возрасте 12 месяцев (а) и крысы в возрасте 12 месяцев, находившейся в течение 7 суток под влиянием комбинированного стресса (б). Иммуногистохимическое исследование, антитела против GFAP, докраска гематоксилином. Ув. Х 400 84 Выпуск 1 (65). 2018 У 12-месячных стрессированных крыс в СА1 относительная площадь GFAP-ИРМ увеличилась на 5,2 % (р < 0,05) и составила 16,4 (15,3-19,1) %. В СА3 относительная площадь ИРМ составила 20,4 (17,8-27,7) % и увеличилась на 8,9 % (р < 0,05). При морфометрическом исследовании СА1 и СА3 было обнаружено достоверное повышение относительной площади ИРМ в ВОГ стрессированных крыс, по сравнению с контрольной группой животных. У стрессированных крыс в СА1 относительная площадь GFAP-ИРМ увеличилась на 5,1 % (р < 0,05) и составила 12,7 (10,3-14,6) %. В СА3 относительная площадь ИРМ составила 11,8 (10,9-15) % и увеличилась на 2,6 % (р < 0,05). Обнаруженное нами при моделировании комбинированного стресса у крыс в возрасте 12 месяцев в СА1 и СА3 дорсального и вентрального отделов гиппокампа прогрессивное увеличение астроцитарной глии,характеризующееся увеличением относительной площади GFAP-ИРМ в СА1 и в СА3, отражает адаптивный результат реактивного астроглиоза [10]. Выявленное в нашем эксперименте преимущественно в СА3 ДОГ и в СА1 ВОГ сочетание процессов повреждения нейронов пирамидного слоя с атрофическими изменениями у 12-месячных крыс, подвергнутых длительному воздействию комбинированного стресса, может быть связано с метаболическими и морфофункциональными особенностями нейронов различных отделов гиппокампа [1] и функциональными регион-специфическими ответами гиппокампа на стрессоры. В процессе развития необратимых изменений нейронов выделяют несколько механизмов клеточной гибели, в первую очередь - апоптоз. В нашем эксперименте в пирамидном слое ДОГ обнаружено увеличение удельного количества caspase-3 иммунопозитивных нейронов в СА1 и в СА3 у 12-месячных стрессированных животных, что свидетельствует о необратимых изменениях нейронов пирамидного слоя [8] и сопровождается развитием наиболее выраженных признаков повреждения с признаками аутофагии в ДОГ, повышением экспрессии NO-синтаз с развитием NO-зависимых механизмов повреждения, преобладающих в ВОГ у более молодых животных и в ДОГ - у более старых, повышение экспрессии нейротрофина BDNF в нейронах и астроцитах [4]. В ВОГ значимых различий в экспрессии caspase-3 обнаружено не было, что, по-видимому, связано с другими каспаза-независимыми механизмами клеточной гибели. Другим механизмом повреждения нейронов гиппокампа при хроническом стрессе и нейродегенеративных расстройствах является эксай-тотоксическое действие высоких концентраций глута-мата, что ведет к накоплению поли-(АДФ-рибоза)-по-лимеразы-1 (PARP-1) и ядерной транслокации АIF из митохондрий [5]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, при длительном комбинированном стрессовом воздействии у крыс в возрасте 12 ме сяцев, по сравнению с контролем, в СА3 ДОГ преобладают следующие признаки: выраженные повреждения нейронов пирамидного слоя, которые характеризуются увеличением удельного количества сморщенных нейронов с гиперхроматозом цитоплазмы на 15,6 % (р < 0,05), увеличением удельного количества caspase-3-иммунопозитивных нейронов на 13,8 % (р < 0,05); атрофические изменения, которые характеризуются уменьшением ширины пирамидного слоя на 13,1 % (р < 0,05), снижением средней ППН на 10,2 % (р < 0,05), снижением относительной ППН на 5,9 % (р < 0,05); реактивный астроглиоз в виде возрастания относительной площади GFAP-иммунореактивного материала на 8,9 % (р < 0,05). Напротив, в ВОГ данные признаки проявляются преимущественно в СА1, что может свидетельствовать о развитии функционального регион-спе-цифического ответа гиппокампа на стрессо

About the authors

A. V Smirnov

FSEI HE «The Volgograd State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

N. V Grigorieva

FSEI HE «The Volgograd State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

M. R Ekova

FSEI HE «The Volgograd State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

Email: maria.ekova@mail.ru

M. V Schmidt

FSEI HE «The Volgograd State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation; Volgograd Medical Research Center, laboratory of morphology, immunohistochemistry and carcinogenesis

D. S Mednikov

FSEI HE «The Volgograd State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

I. N Tyurenkov

FSEI HE «The Volgograd State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

D. V Kurkin

FSEI HE «The Volgograd State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

E. V Volotova

FSEI HE «The Volgograd State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

V. S Zamaraev

FSEI HE «The Volgograd State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

References

Supplementary files