VALIDATION OF THE ASCORBIC ACID AUTOXYDATION METOD (COPPER-INDUCED) AS A METOD FOR ESTIMATION OF EVALUATION OF ACTIVITY OF COMPOUNDS CONNECTING D-ELEMENTS

Full Text

Ascorbate, autoxydation, pure chelation, copper sulfate (II), validation. Поиск веществ, связывающих d-элементы, выступающие в роли коферментов, или имеющие иную биологическую активность (Cu, Zn, Fe и др), является новым актуальным подходом в разработке ангиопротектор-ных, нейропротекторных, противовоспалительных, противоатеросклеротических, противовирусных средств [1-5]. Процесс изменения электронной заселенности d-орбитали при образовании координационной связи сопровождается потерей элементом нежелательной ката-литичности и отрицательным модулированием кофер-ментных свойств даже при слабой степени связи (распространенный в литературе термин, описывающий подобную активность - poor chelator - слабохелатиру-ющий агент) [6]. Метод оценки способности веществ предотвращать металл-опосредованный катализ в реакции аутоокисления аскорбиновой кислоты чувствителен к изменению активности d-элементов. Метод способен выявлять изменение активности, вызванное экранированием элемента (хелация), образованием координационной связи, а также ковалентным связыванием. По этой причине данный метод наиболее приемлем на этапе предварительного скрининга. ЦЕЛЬ РАБОТЫ На примере пиоглитазона валидировать методику медь-зависимого аутоокисления аскорбиновой кислоты как способа оценки активности соединений, влияющих на биологическую активность d-элементов. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Объект определения: Пиоглитазон (Sigma-Aldrich). Реактивы: Аскорбиновая кислота (х.ч.), сульфат меди (II) пятиводный (х.ч.) деионизированная вода (деионизатор Prodeion 10 VS). Валидация метода: Активность пиоглитазона в пробах определялась спектрофотометрически. В настоящей работе описан анализ достоверности через определение: линейности, сходимости, прецизионости и предела количественного обнаружения (ПКО). Стандартная операционная процедура: Для стандартного теста готовили раствор индикатора -100 мкМ аскорбиновой кислоты в деионизированной воды. Для предотвращения окисления новую партию раствора подготавливали путем 1000-кратного разведения маточного (100 мМ до 100 мкМ), что связано с большей сохранностью высококонцентрированного раствора при хранении [7]. Перед проведением реакции в кварцевую кювету (V = 3 мл, l = 10 мм), установленную в спектрофотометре APEL PD 303 UV (Япония), вносили 2,5 мл 100 мкМ раствора аскорбиновой кислоты. Целевая оптическая плотность данного раствора, готового к инициации реакции аутоокисления, при рабочей длине волны X 265 нм составляла 1250 ± 50 (измерение против деионизированной воды, для удобства все значения оптической плотности множены на 1000). Пиоглитазон растворяли в 1 мл ДМСО 99 % в концентрации Выпуск 1 (65). 2018 115 ЩШґорСз [ЩсмеТКЩ 2,33 мМ (маточный раствор). При определении ПКО готовили серийные разведения, понижая концентрацию маточного раствора пиоглитазона на 33 %. Индуктор аутоокисления - сульфат меди (II) пятиводный - растворяли в деионизированной воде в концентрации 4,66 мМ, что эквивалентно 2,95 мМ раствору безводной соли. 20 мкл маточного раствора пиоглитазона инкубировали при 37 °С вместе с 40 мкл раствора индуктора аутоокисления. В контроле маточный раствор пиоглитазона заменяли на ДМСО 99 %. После проведения инкубации смесь вносили в кювету с аскорбиновой кислотой, фиксировали падение оптической плотности при длине волны X 265 нм через 60 секунд после начала реакции. Статистическая обработка: в оценке использовали стандартные формулы расчета среднего значения (М), стандартного отклонения (S), относительного стандартного отклонения (RSD%) и среднего доверительного интервала (CI). Корелляционный анализ данных проводили методами линейной и нелинейной регрессии. Статистическую обработку выполняли с применением ANOVA (пост-тест Туке, р < 0,05). Все операции выполняли в пакете программ GraphPad Prism 5.0 и Microsoft Excel 2007. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Валидация методики Сходимость методики доказали в ходе двух серий по пять измерений в каждой (три показания на измерение) для стандартных растворов с конечной концентрацией пиоглитазона 75 мкМ, сульфата меди (II) пятиводного 150 мкМ (эквивалентно 95 мкМ безводной соли) и 100 мкМ аскорбиновой кислоты. Для оценки сходимости методики высчитывали среднее значение, стандартное отклонение, относительное стандартное отклонение и средний доверительный интервал. Значения приводятся в табл. 1. Критерий сходимости методики: значение RSD% < 10 %. Таблица 1 Показатели в оценке сходимости при валидации методики медь-индуцированного аутоокисления аскорбиновой кислоты # Номер пробы Серия #1 Серия #2 1 700 720 2 700 828 3 800 853 4 860 732 5 776 775 М 767,20 781,60 SD 68,55 58,20 RSD (%) 8,96 7,45 CI (p = 0,95) для среднего значения 767,2 ± 85,1 781,6 ± 72,3 Методика считается сходимой, поскольку значение RSD%, полученное в каждой серии, не превышает 10 % для каждой серии проб. Прецизионность методики оценивали по результатам (20 определений), полученным двумя аналитиками в два разных дня работы с типичной серией растворов, описанной выше. Значения представлены в табл. 2. Таблица 2 Показатели в оценке прецизионности при валидации методики медь-индуцированного аутоокисления аскорбиновой кислоты Показатели # Номер пробы Светопоглощение 1 828 2 766 Аналитик 1 3 753 4 782 5 822 ДЕНЬ 1 6 743 1 730 2 739 Аналитик 2 3 744 4 748 5 769 6 837 1 755 2 776 Аналитик 1 3 846 4 730 5 753 ДЕНЬ 2 6 807 1 736 2 721 Аналитик 2 3 828 4 766 5 753 6 782 М 769,25 SD 38,59 RSD (%) 5,02 CI (p = 0,95) для среднего значения 769,25 ± 18,05 Методика считается прецизионной, если значение RSD% не более 20 %. Предел количественного определения (ПКО) определяется как минимальное количество вещества, которое по результатам шести проб (три повторности на пробу) может быть количественно определено с точностью около 20 % RSD. Предел количественного обнаружения пиоглитазона составил 14,8 мкМ (ANOVA, посттест Туке). Данный показатель зависит от активности вещества на модели. Результат оценки сходимости ПКО представлен в табл. 3. 116 Выпуск 1 (65). 2018 Таблица 3 Показатели в оценке сходимости предела количественного обнаружения пиоглитазона при валидации методики медь-индуцированного аутоокисления аскорбиновой кислоты # Номер пробы Светопоглощение 1 518 2 523 3 575 4 556 5 560 6 555 М 547,80 SD 22,41 RSD (%) 4,09 CI (p = 0,95) для среднего значения 547,85 ± 23,55 Методика считается сходимой по ПКО, поскольку вычисленное RSD% не более 20 %. Линейность определяли путем проведения стандартного теста (описан выше) с разными концентрациями пиоглитазона от ПКО до 75 мкМ (табл. 4). Таблица 4 Линейность от предела количественного определения до 75 мкМ Уровень Концентрация, мкМ Светопоглощение 1 14,8 883 14,8 828 14,8 853 2 22,2 812 22,2 724 22,2 825 3 33,3 660 33,3 706 33,3 680 4 50,0 695 50,0 599 50,0 537 5 75,0 535 75,0 557 75,0 555 Наклон -4,973 ± 0,873 Точка пересечения с осью Х 890,8 ± 38,9 Точка пересечения с осью Y 179,1 Квадратичный коэффициент 0,995 корреляции Методика считается линейной в диапазоне от ПКО до 75 мкМ, поскольку квадратичный коэффициент корреляции не менее 0,99. Таким образом, методику определения способности веществ связывать d-элементы на примере пиоглитазона и сульфата меди (II) можно считать сходимой, прецизионной и линейной в изученном диапазоне концентраций. Практические рекомендации (составлены по факту постановки валидируемой методики) 1. Отмечено, что анализ активности веществ с помощью с данной методики можно проводить по изменению оптической плотности раствора аскорбиновой кислоты при добавлении разных концентраций тестируемого вещества, а также по измерению скорости реакции от инициации до приобретения равновесного состояния в рекомендуемой, эмперически установленной концентрации 75 мкМ. 2. При концентрационном анализе рекомендуется снимать показания оптической плотности в 3 точках: исход (до добавления тестируемого вещества), инициация реакции (сразу после добавления) и 60 с после начала реакции (экспериментально установленная точка наибольшей разницы оптической плотности контроля с веществами разного уровня активности от слабо-до высокоактивных). 3. В оценке скорости реакции желательно опираться на расчет полускорости T1/2. Для этого необходимо фиксировать значения оптической плотности с коротким интервалом (1-10 с) до полной остановки реакции. Зависимость оптической плотности от времени необходимо проанализировать методом нелинейной регрессии. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

About the authors

D. D Shamshina

Federal State Educational Institution of Higher Education «The Volgograd State Medical University of Public Health Ministry of the Russian Federation»

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation,

R. A Litvinov

Federal State Educational Institution of Higher Education «The Volgograd State Medical University of Public Health Ministry of the Russian Federation»

Author for correspondence.
Email: litvinov.volggmu@mail.ru

к. м. н., ассистент кафедры фармакологии и биоинформатики

Russian Federation,

References

Supplementary files