THE EFFECT OF PLATELET-ENRICHED AUTOPLASM ON THE COURSE OF TISSUE IMPLANTATION REACTION WITH SUPER-LIGHT ABDOMINAL WALL ENDOPROSTHETICS

Full Text

Connective tissue capsule, cellular index, fibroblasts, fibroblasts, endoprostheses, platelet-rich plasma. Одной из проблем герниологии является профилактика послеоперационных вентральных грыж, которые развиваются в 5-15 % случаев, после выполнения лапаротомии [7]. В последние годы с внедрением лапароскопических методов лечения хирургических заболеваний органов брюшной полости, количество больных этим заболеванием перестало увеличиваться [3]. Однако общее количество больных остается очень высоким из-за недоступности многим хирургическим стационарам лапароскопического оборудования. Послеоперационные вентральные грыжи резко нарушают функцию, как брюшной стенки, так и внутренних органов, снижаю качество жизни больных [10, 11]. Проведенные ранее исследования показали, что для превентивного эндопротезирования лучше приме нять суперлегкие эндопротезы с толщиной нити 70 микрон [4, 6]. Однако при имплантации суперлегкого эндопротеза в брюшную стенку возникает гипопластичес-кая реакция, что затрудняет образование зрелой соединительной капсулы, приводит к недостаточному укреплению мышечно-апоневротических структур и не позволяет восстановить функцию брюшного пресса [1, 8]. Поэтому ряд авторов считает необходимым поиск новых средств и способов регуляции образования коллагена и стимуляции регенерации при эндопротезировании суперлегким протезом [5, 9]. Одним из эффективных средств стимуляции репаративных процессов является введение в ткани аутоплазмы, обогащенной тромбоцитами [2]. Изучение влияния этого метода стимуляции регенерации при имплантации суперлегкого синтетического = 74 эндопротеза в брюшную стенку до настоящего времени не проводилось. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Изучить морфологические изменения соединительной ткани, окружающей сверхлегкий полипропилен-поливинилиденфторидный эндопротез, на разных сроках имплантации, при использовании обогащенной тромбоцитами аутоплазмы. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Эксперименты выполнены на 50 кроликах порода «Шиншилла», одного пола (самцы), массой 2500 г, в возрасте от 1 по 1,5 лет. Животных отбирали в эксперимент без внешних признаков заболевания после двухнедельного карантина в условиях вивария Курского государственного медицинского университета. Все манипуляции с лабораторными животными осуществляли в соответствии с принципами биоэтики, правилами лабораторной практики (GLP) и соответствовали международным рекомендациям (этическому кодексу) по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (1985 г.), с соблюдением принципов, изложенных в законе «О защите животных от жестокого обращения» гл. V, ст. 104679 - ГД от 01.12.1999 г., и согласно приказу Минздрава России от 19.06.2003г. № 267 «Об утверждении правил лабораторной практики». Экспериментальные животные были разделены на две группы по 25 животных в каждой. Животным 1-й группы надапоневротически имплантировали сверхлегкий полипропилен-поливинилиденфторидный сетчатый эндопротез с диаметром нити 70 микрон, без введения в рану обогащенной тромбоцитами аутоплазмы, во 2-й группе имплантировали аналогичный протез с введением в рану обогащенной тромбоцитами аутоплазмы. Все эксперименты были выполнены с соблюдением правил асептики и антисептики. Животным 1 -й группы под общим наркозом (внутривенно вводили препарат «Золетил 50» в дозе 5 мг/кг массы) в асептических условиях выполняли средний разрез кожи, подкожной клетчатки длиной 7 см по белой линии живота отступив от мечевидного отростка 1-2 см в направлении к лобковому симфизу. Тупым и острым путем освобождали апоневроз прямых мышц живота от подкожной жировой клетчатки на 2 см в каждую сторону от срединного разреза. На апоневроз укладывали сетчатый полипропиленовый эндопротез размерами 3 х 2 см. Фиксацию эндопротеза выполняли непрерывным швом полипропиленовой мононитью 3/0. Гемостаз проводили по ходу операции. После завершения оперативного вмешательства, отдельными узловыми швами ушивали подкожную жировую клетчатку и кожу. Рану не дренировали. Животным во 2-й группе перед операцией готовили аутоплазму, обогащенную тромбоцитами, по разработанной нами методике и вводили ее под эндопротез в места, где наиболее часто возникает разрыв и отторже ние трансплантата, сразу после оперативного вмешательства и повторно на третьи сутки эксперимента. На протяжении всего эксперимента проводили динамическое наблюдение за общим состоянием животных и заживлением послеоперационных ран. Выведение животных из эксперимента и забор материала для морфологических исследований проводили на 3-и, 7-е, 10-е, 14-е и 21-е сутки после операции, путем передозировки средств для наркоза. Для гистологического изучения реактивных изменений тканей, окружающих имплантированный эндопротез, иссекали единым блоком участок передней брюшной стенки кролика размерами 2 х 2 см, включая материал эндопротеза. Извлеченные фрагменты биологического материала растягивали на пластинах плотного картона для предупреждения их деформации во время фиксации, а затем полностью погружали в 10%-й раствор забуференного нейтрального формалина на 2 недели с обязательной заменой раствора на 2-е сутки фиксации. После фиксации, из взятого блока иссекали кусочки размерами 1 х 1 см, включающие обязательно материал эндопротеза и заливали в парафин по стандартной методике. Далее изготовляли гистологические срезы толщиной 5-7 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином, по Маллори и по методу Ван Гизона. Микрокопирование и микрофотосъемку осуществляли с помощью оптической системы, состоящей из светового микроскопа Leica CME, цифровой окуляр-камеры DCM - 510 на увеличениях х 200 и х400 крат. При микроскопии на малом увеличении оценивали наличие и строение соединительнотканной капсулы, выраженность ее слоев, степень взаимной интеграции волокон капсулы и окружающих соединительнотканных структур (апоневроз и фасции мышц передней брюшной стенки). При микроскопии на большом увеличении (х400) оценивали клеточный и волокнистый компонент, окружающий эндопротез соединительной ткани. По кариологическим признакам дифференцировали: фибробласты и фиброциты, макрофаги, плазматические клетки, лимфоциты, моноциты, нейтрофилы, эозинофи-лы и тучные клетки. Процентное соотношение указанных представителей клеточной популяции рассчитывали после подсчета 100 клеток в нескольких непересекаю-щихся полях зрения. Для объективизации формирования заключения о морфологических изменениях вокруг нитей протеза мы использовали метод подсчета клеточного индекса (КИ) по следующей формуле: КИ = Кр/Кнр, где Кр - клетки резиденты - общее количество макрофагов, фибробластов и фиброцитов. Кнр - клетки нерезиденты - общее количество грану-лоцитов (все три вида), моноцитов, лимфоцитов, тучных клеток и плазмоцитов, рекрутированных в очаг воспаления. При значении клеточного индекса <1 делали вывод о преобладании воспалительных изменений, характерных для I фазы течения раневого процесса, при значении >1 делали вывод о преобладании репаратив-ных тенденций, характерных для II фазы. Выпуск 2 (66). 2018 75 ЩШгорСз [ЩсмеТКЩ Выбор методов статистического анализа проводили в соответствии с ГОСТ Р. 50779.11-2000 (ИСО 35342-93). После определения типа распределения данных был выбран метод оценки достоверности отличий по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни. Учитывая низкую чувствительность непараметрических методик к типу распределения, а также допустимый для экспериментальных медико-биологических исследований уровень p < 0,05, для подтверждения статистической гипотезы был выбран именно такой уровень значимости. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Результаты морфометрического исследования клеточного состава окружающих эндопротез тканей и клеточного индекса на разных сроках эксперимента представлены в табл. 1. У животных второй группы после введения аутоплазмы воспалительная реакция по динамике нейтрофилов на имплантированный протез была на 7-е сутки эксперимента ниже в 1,5, на 14-е - в 1,2 раза, чем у животных в первой группе. На последующих сутках она была слабо выражена в обеих группах. Фибробластическая реакция, наоборот, после введения аутоплазмы увеличивалась на 3-и сутки в 1,2, на 7-е сутки - в 1,1, на 14-е сутки - в 1,3 раза. В обеих группах на протяжении всего эксперимента динамика макрофагов была одинакова. Статистически достоверные отличия были выявлены на 14-е сутки эксперимента между клетками макрофагального ряда, так, в контрольной группе количество макрофагов снизилось в 1,3 раза, а в опытной - в 1,8 раза по сравнению с 3-ми сутками. Рассматривая изменения клеточного индекса как изменение клеточного состава окружающих эндопротез нитей, в обеих группа отмечали его увеличение. Уже к 7-м суткам значение клеточного индекса превышало 1, что свидетельствовало о преобладании репаративных Таблица 1 Результаты морфометрического исследования клеточного состава и клеточного индекса на разных сроках эксперимента (Мє (p 0,25 / p 0,75)) Показатели Серия эксперимента Сроки имплантации 3 сут., n = 10 7 сут., n = 10 10 сут., n = 10 14 сут., n = 10 21 сут., n = 10 Нейтрофилы 1-я контрольная 11,4 (10/12) 12,5 (10,5/14,7) 4,7 (3,25/6) 4,7 (3/5) 5,1 (3,5/6,7) 2-я опытная 13,9 (13/15) 8,4 (8/9) 4,8 (4/5) 3,9 (3/4,75) 4,2 (3,25/5) Лимфоциты 1-я контрольная 16,1 (15,2/17) 14 (13/15) 3,6 (3/4) 6,1 (5,25/7) 7,3 (6/8,75) 2-я опытная 12,1 (11/12,7) 11,9 (9,2/ 13,7) 3,5 (2,25/4,7) 4,6 (4/5) 6,3 (5,25/8) Плазмоциты 1-я контрольная 9,8 (9/10,75) 6,3 (5,25/7) 6,2 (6/7,75) 6,4 (5/7,75) 5,5 (3/8,5) 2-я опытная 6,7 (6/7,75) 4,3 (3/6,25) 6,1 (5,2/7,75) 5,2 (4,25/6) 4,0 (3/4,75) Макрофаги 1-я контрольная 21,4 (20/22) 21,2 (19/23) 22,8 (22/24) 16,8 (14/18,7) 16,5 (16/18) 2-я опытная 23,2 (22,2/24) 21,8 (18/25,7) 22,8 (21,5/24) 13,1 (12/13,7) 12,8 (11,2/14) Тучные клетки 1-я контрольная 19,1 (18/20,7) 6,8 (5/8) 12,1 (10/13,7) 8,6 (8/10) 6,6 (6/7) 2-я опытная 18,1 (15,25/19,75) 11,1 (10,25/12) 10,1 (9/11 ) 10,6 (10/11,75) 5,7 (4/6,75) Фибробласты 1-я контрольная 13,7 (12/15) 20,9 (19,2/22) 27,2 (27/28,7) 23,4 (22,2/24) 25 (23/26) 2-я опытная 16,2 (15,2/18) 22,1 (21,2/23) 25,6 (24,2/27) 29,9 (29,2/30) 23,5 (21,2/25,7) Фиброциты 1-я контрольная 8,5 (7/9,75) 18,3 (17/19) 23,5 (22,2/24,7) 28,1 (27,2/29,7) 34 (32,2/36,5) 2-я опытная 9,8 (9/10,7) 20,3 (19/20,7) 23,6 (22,2/26,7) 32,7 (32/33) 43,5 (42,2/44,5) Клеточный индекс 1-я контрольная 0,8 (0,75/0,8) 1,5 (1,5/1,6) 2,8 (2,7/2,9) 2,6 (2,4/2,9) 3,1 (2,6/3,8) 2-я опытная 0,9 (0,8/1,2) 2,1 (1,9/2,2) 2,9 (2,7/3,3) 3,1 (2,7/3,4) 3,9 (3,4/4,8) 76 Выпуск 2 (66). 2018 процессов, характерных для II фазы раневого процесса. В процессе эксперимента показатель продолжал увеличиваться в контрольной в 3,9 раза и в опытной в 4,3 раза. Клеточный индекс во второй группе был выше, чем в первой на всех сроках эксперимента, на 7-е - в 1,4 раза, на 10-е - в 1,04, а на 14-е - в 1,2, на 21-е сутки - в 1,3 раза. На 3-и сутки эксперимента элементы капсулы не определялись в обеих группа. Результаты морфометрического исследования толщины капсулы эндопротеза представлены в табл. 2. Таблица2 Результаты морфометрического исследования толщины капсулы эндопротеза (мкм) (Мє (p 0,25 / p 0,75)) Сроки наблю дения n Контрольная серия n Опытная серия Р Толщина капсулы 7-е сутки 5 9,59 (9,49/10,63) 5 12,05 (9,32/13,39) < 0,05 10-е сутки 5 17,13 (13,62/20,2) 5 58,51 (52,06/65,25) < 0,05 14-е сутки 5 37,65 (30,38/46,3) 5 97,79 (83/115,35) < 0,05 21-е сутки 5 52,28 (47,39/58,99) 5 146,44 (127,85/163,86) < 0,05 С 7 по 21-е сутки, как в контрольной, так и в опытной группах, отмечали увеличение толщины соединительнотканной капсулы в 5,5 и 12,2 раза соответственно. Толщина капсулы после введения аутоплазмы на 7-е сутки была статистически достоверно больше в 1,3, на 10-е - в 3,4, 14-е - в 2,6 и на 21 -е сутки - в 2,8 раз, чем у животных первой группы. Микроскопическое изучение гистологических срезов участка передней брюшной стенки с имплантированным сверхлегким эндопротезом на 3-и сутки показало, что в окружающих перипротезных тканях наблюдает интерстициальный отек. Клеточный компонент преобладает над волокнистым. В поле зрения визуализируются преимущественно клетки воспалительного ряда. На 7-е сутки эксперимента у животных первой группы нити эндопротеза окружены слоем фиброблас-тов, крупных размеров. Их форма варьирует от кубической до призматической, При этом, в большинстве случаев, фибробласты располагаются в два ряда. Необходимо отметить, что вокруг нитей эндопротеза визуализируются тонкие, новообразованные коллагеновые волокна, окрашивающиеся слабо оксифильно по Ван Гизону. Между нитей эндопротеза новообразованная соединительная ткань не зрелая. Она образована хаотично переплетающимися тонкими волокнами, не дающих яркую оксифилию при окраске по Ван Гизону. У животных второй группы наблюдалось дальнейшее построение соединительнотканного каркаса вокруг нитей эндопротеза, с внутренней стороны эндоп ротеза наблюдается широкая зона, содержащая зрелые коллагеновые волокна, расположенные, пока еще, не плотно и хаотично. С наружной стороны эндопротеза, также, происходит упорядочивание и структуризация волокон соединительной ткани. Однако степень зрелости этих волокон несколько ниже (при окраске по Ван Гизону не дают оксифилию), чем с внутренней стороны эндопротеза. Плотность клеток высокая, в поле зрения преобладают клетки фиб-робластического ряда и лимфоциты, встречаются единичные эозинофилы, моноциты, нейтрофилы и гигантские многоядерные клетки. На 10-е сутки эксперимента у животных первой группы над апоневрозом визуализируются поперечно срезанные полипропиленовые эндопротезы, окруженные зрелой соединительнотканной капсулой, с хорошо визуализируемым разделением на внутренний и наружные слои. Во внутреннем, клеточном слое капсулы находятся единичные фибробласты мелких размеров и большое количество вытянутых, уплощенной формы фиброцитов. Наружный, волокнистый слой образован толстыми, зрелыми, ярко оксифильными (при окраске по Ван Гизону) волокнами, расположенными плотно, компактно и параллельно друг другу. При этом между нитей сверхлегкого эндопротеза продолжается созревание соединительной ткани. Волокна, находящиеся в пучках между нитей эндопротеза, расположены разнонаправленно, хаотично, что придает ткани, находящейся здесь, пенисто-пористый вид на срезе. В поле зрения вокруг нитей сверхлегкого эндопротеза с латеральных сторон в клеточном составе преобладают клетки фибробластического ряда и визуализируются единичные лимфоциты (рис. 1А). В условиях введения аутоплазмы, обогащенной тромбоцитами, наблюдается толстая, хорошо сформированная пе-рипротезная капсула, зрелые (при окраске по Ван Гизону ярко оксифильного цвета) соединительнотканные волокна которой располагаются плотно, компактно и параллельно друг другу. Межволоконные промежутки слабо выражены, угол анастомоза между волокнами маленький. В перипротезной капсуле хорошо визуализируется подразделение на слои: внутренний клеточный и наружный волокнистый. Во внутреннем клеточном слое плотность клеток выше, чем в группе наблюдений без применения аутоплазмы, обогащенной тромбоцитами. В поле зрения, в наружном слое капсулы на фоне преобладания волокнистого компонента визуализируются фиброциты. Во внутреннем слое капсулы преобладают клетки фибробластического ряда, встречаются лимфоциты, плазмациты, макрофаги, ГМК и тучные клетки в стадии накопления секрета. Между нитей эндопротеза также определяются зрелые коллагеновые волокна (при окраске по Ван Гизону имеют оксифильный цвет). При этом располагаются эти волокна рыхло и хаотично (рис. 1Б). Выпуск 2 (66). 2018 77 ІШторСз А Б Рис. 1. Микрофотография тканей, окружающих сверхлегкий полипропилен-поливинилидентофторидный эндопротез на 10-е сутки эксперимента: А - без введения в рану аутоплазмы, обогащенной тромбоцитами. Б - с введением в рану обогащенной тромбоцитами аутоплазмы. Окрашено по методу Ван Гизона. Ув. х 400 На 14-е сутки у животных первой группы вокруг нитей формируется достаточно зрелая соединительнотканная капсула с хорошо выраженным разделением на слои. В прилегающей к нитям протеза территории плотность клеток низкая, волокнистый компонент преобладает над клеточным. В поле зрения встречаются преимущественно клетки фибробластического ряда, с преобладанием фиброцитов, единичные макрофаги и лимфоциты. В клеточном внутреннем слое капсулы, непосредственно на нитях протеза фиброциты уплощенной формы. В наружном, волокнистом слое капсулы ярко окси-фильные (при окраске по Ван Гизону) коллагеновые волокна расположены упорядоченно и параллельно друг другу. Между нитей эндопротеза и между пучками визуализируется рыхлая соединительная ткань, образованная зрелыми коллагеновыми волокнами (рис. 2А). У животных второй группы на этом сроке происходило образование не только зрелой и достаточно мощной со единительнотканной перипротезной капсулы, но и появление качественных отличий в ее строении. Так, с наружной стороны визуализируется чередование волокнистого и клеточных слоев. Причем, в клеточном слое кроме клеток фибробластического ряда встречаются лимфоциты и плазмациты. С внутренней стороны перипротезная капсула содержит плотно и компактно расположенные зрелые коллагеновые волокна. Межво-локонные промежутки шире на наружной стороне перипротезной капсулы (рис. 2Б). На 21-е сутки у животных первой группы была выявлена большая плотность клеток на единицу площади в сравнении с предыдущими сутками. Во внутреннем слое капсулы преимущественно встречаются клетки фибробластического ряда, единичные макрофаги, плазмациты и лимфоциты. Учитывая такой клеточный состав, можно предположить о начале процесса ремоделирования соединительнотканного каркаса, сформированного вокруг сетчатого эндопротеза. А Б Рис. 2. Микрофотография тканей, окружающих сверхлегкий полипропилен-поливинилидентофторидный эндопротез на 14-е сутки эксперимента: А - без введения в рану аутоплазмы, обогащенной тромбоцитами. Б - с введением в рану обогащенной тромбоцитами аутоплазмы. Окрашено по методу Ван Гизона. Ув. х 200 78 Выпуск 2 (66). 2018 Перипротезная капсула хорошо визуализируется, достигает максимальной своей толщины к указанному сроку, наблюдается послойность в ее строении. Следует отметить, что между пучками нитей плотность клеток значительно выше, чем во внутреннем слое капсулы. В поле зрения преобладают лимфоциты, фиброциты и встречаются фибробласты (рис. 3А). У животных второй группы на этом сроке новообразованная соединительнотканная капсула имеет максимальную толщину. Качественным отличием от предыдущего срока эксперимента в строении капсулы можно отметить отсутствие в нем наличия чередования слоев как на 14 сутки, значительное утолщение наружного волокнистого слоя. Соединительнотканные волокна в данном слое перипротезной капсулы расположены упорядоченно, плотно, компактно и параллельно друг другу. Межволоконные промежутки тонкие, не всегда визуализируются. При окраске по Ван Гизону волокна окрашены ок-сифильно, что свидетельствует об их высокой степени зрелости. Во внутреннем клеточном слое, на фоне преобладания волокнистого компонента, визуализируются клетки фибробластического ряда. Следует отметить наличие жировой прослойки, расположенной между фасцией подлежащей мышечной ткани и внутренней поверхностью перипротезной капсулы. Что, в свою очередь, косвенно может свидетельствовать о наличии высокого энергетического резерва для «строительства» (образования) мощного и прочного соединительнотканного каркаса, а также поддержания на высоком уровне своей непосредственной функции - укрепление передней брюшной стенки при герниопластике (рис. 3Б). А Б Рис. 3. Микрофотография тканей, окружающих сверхлегкий полипропилен-поливинилидентофторидный эндопротез на 21-е сутки эксперимента: А - без введения в рану аутоплазмы, обогащенной тромбоцитами. Б - с введением в рану обогащенной тромбоцитами аутоплазмы. Окрашено по методу Ван Гизона. Ув. х 200 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Введение аутоплазмы, обогащенной тромбоцитами, позволяет ускорить формирование зрелой соеди-нительно-тканной капсулы при сверхлегком эндопротезировании брюшной стенки. ЛИТЕРАТУРА

About the authors

T. V. Mutova

FSBEI HE «Kursk State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

M. A Zatolokina

FSBEI HE «Kursk State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

Email: marika1212@mail.ru

B. S Sukovatukh

FSBEI HE «Kursk State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

V. M Pashkov

FSBEI HE «Kursk State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

V. V Tsymbalyuk

FSBEI HE «Kursk State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

A. A Bulgakova

FSBEI HE «Kursk State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

E. S Zatolokina

FSBEI HE «Kursk State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

References

Supplementary files