MYOCARDIUM STRUCTURE AND CYTOCHEMICAL INDICES OF RAT BLOOD IN CONDITIONS OF HYSTOTOXIC HYPOXIA

Full Text

Hypoxia, myocardium, rats, cobalt chloride, mitochondria, dehydrogenase. Сохранение и поддержание энергетической функции сердца является одной из центральных задач современной кардиологии. Образование высокоэнергетических соединений, необходимых для всех видов деятельности миокардиальной клетки происходит, в основном, за счет процессов аэробного окисления. Многие патологические процессы в сердце сопровождаются нарушениями в обеспечении миокарда кислородом [1]. Понимание механизмов развития таких нарушений, а также выбор путей и средств защиты миокарда от гипоксии невозможны без углубленного и всестороннего изучения соотношения физиологической функции органа и его энергетики. Поэтому исследования данной проблемы представляют не только значительный теоретический интерес, но и являются чрезвычайно актуальными для практической медицины. Сердце чрезвычайно чувствительно к кислородной недостаточности. Воздействие гипоксии на сердце снижает его сократительную функцию. Известно, что контрактильная активность - энергозависимый процесс, тесно связанный с окислительным метаболизмом сердца, поэтому нарушение сократительной способности миокарда при гипоксии является, прежде всего, результатом нарушения последнего. Показано, что потеря способности сердца при кислородной недостаточности поддерживать нормальную силу сокращений и восстанавливать ее в процессе реоксигенации связана с истощением энергетических субстратов и уменьшением скорости их утилизации [2]. Однако при ряде форм кар-диомиопатий в результате гипоксических воздействий также происходит нарушение синтеза и экспрессии некоторых белков, как в саркоплазме кардиомиоцита, так и в интерстиции, что приводит к функциональной несостоятельности миокарда [1, 2]. Одна из частых форм гипоксии - тканевая (гисто-токсическая) гипоксия, которая развивается при неспособности клеток утилизировать кислород в результате поражения ферментов тканевого дыхания или мембран клеток [3]. В патогенезе данного вида гипоксии ведущую роль играют повышенная проницаемость клеточных 86 Выпуск 2 (66). 2018 мембран и инактивация дыхательных ферментов, что может наблюдаться при отравлении химическими веществами, такими как соли тяжелых металлов [4]. Широко распространенный промышленный экзотоксикант хлорид кобальта (CoCl2) в токсических дозах способен более прочно связываться с гемом, чем железо, и оказывать действие, аналогичное гистоток-сической гипоксии, что позволяет применять его для моделирования гипоксических состояний в эксперименте [4]. Обладая высокой сенсибилизирующей активностью, кобальт при его хроническом поступлении в организм производит полиморфное поражение сердечно-сосудистой, дыхательной и кроветворной систем, что позволило отнести кобальт к веществам I класса опасности [5]. Кардиотоксическое действие кобальта обусловлено его способностью приводить к развитию дила-тационной кардиомиопатии, нарушению сократительной функции миокарда [4, 5]. Накапливаясь в миокарде, кобальт блокирует ферментную систему дегидрогеназ. Нарушение этих процессов, являющихся основными поставщиками энергии для миокарда, способствует развитию нарушений метаболических процессов в сердечной мышце [6]. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Изучить морфологические особенности структуры миокарда и цитохимические показатели крови половозрелых крыс в условиях гистотоксической гипоксии. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Исследование проводилось на 25 половозрелых самцах крыс линии Wistar массой 220-310 г. Контрольная группа была представлена 5 интактными животными. Для получения токсического раствора хлорид кобальта растворяли в стерильной дистиллированной воде таким образом, что на единицу раствора, равную 0,2 мл, приходилось 0,8 мг кобальта (в пересчете на металл) [7]. На каждые 100 г веса крысы вводили 0,1 мл токсического раствора. Раствор хлорида кобальта вводили через атравматичный зонд в желудок в дозировке 4 мг/кг, ежедневно 1 раз в сутки в течение 30 дней. Животные содержались в виварии, уход за ними осуществлялся в соответствии с нормами и правилами обращения с лабораторными животными (Западнюк И.П., 1983). Крысы выводились из эксперимента путем декапитации под наркозом (эфир с хлороформом) в соответствии с «Международными рекомендациями (этический кодекс) по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985) и правилами лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗ РФ от 19.06.2003 № 267). После проведения торако- и перикардиотомии под эфирным наркозом сердце извлекалось и сразу же после взвешивания помещалось в кардиоплегический раствор (0,9%-й КСІ при температуре 0 оС), чем достигалась остановка сердца в диастолу. Для гистологического исследования были отобраны образцы миокарда левого и правого желудочков. Кусочки миокарда фиксировали в 10%-м забуферен-ном формалине в течение 5 суток, затем промывали в проточной воде, проводили через спирты, возрастающей концентрации и заливали в воск-парафин. Гистологические срезы толщиной 5-6 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином, а также по Маллори для выявления маркеров фиброгенеза [8]. Микропрепараты срезов миокарда, окрашенные гематоксилином-эозином, изучали с использованием микроскопа Olympus CX-3 (Япония). Для гистохимического исследования липидов материал фиксировали в 10%-м растворе забуфе-ренного формалина с последующим приготовлением парафиновых блоков. С каждого блока после заморозки криоспреем были сделаны серийные срезы толщиной 5-10 мкм, которые окрашивали суданом III [8]. В настоящей работе был использован метод электронно-микроскопического исследования. Образцы миокарда левого желудочка фиксировали в 2,5%-м растворе глутарового альдегида на 0,2 М какодилатном буфере с pH = 7,2 при температуре +4 оС и постфиксиро-вали в 1 %-м растворе OsO4 на холоде в течение 4 ч [9]. В дальнейшем дегидратировали биоптаты в этаноле восходящей концентрации, заливали в смесь epon-araldit. Ультратонкие срезы (50-80 нм) монтировали на сетки и контрастировали уранилацетатом (5%-й раствор в метиловом спирте) и цитратом свинца (Reynolds E.S., 1963). Полутонкие и ультратонкие срезы готовили на ультратоме УМТП-7 (Украина). Препараты изучали на электронном микроскопе Selmi-125 при ускоряющем напряжении 125 kV. Для определения цитохимических индикаторов гипоксического повреждения проводилось изучение активности дегидрогеназ лимфоцитов - ферментов цикла Кребса: сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и лак-татдегидрогеназы (ЛДГ), значения которых рассматривались как неспецифический показатель повреждения клеток [10], а также для оценки баланса гликолиза и дыхания в митохондриях лимфоцитов, что может отражать их взаимосвязь с энергетическим обменом в кардиомиоцитах. Активность ферментов определяли цитобиохими-ческим (ЦБХ) методом определения активности ферментов в лимфоцитах на мазке крови по методике [10]. Свежеприготовленные мазки крови фиксировали в течение 30 с 60%-м ацетоном, забуференным 10 мМ HEPES, при комнатной температуре, pH 5,2-5,4. Активность ферментов измеряли по восстановлению нитросинего тетразолия в свежеприготовленном мазке крови, инкубированной в среде, содержащей 125 мМ КСІ (Sigma, США), 10 мМ HEPES (Sigma, США), 1,22 мМ нитросинего тетразолия хлорида (Dudley Chemiœl Corporation) с добавками 5 мМ янтарной кислоты для выявления СДГ или смеси лактат (5 мМ) + Выпуск 2 (66). 2018 87 ІШторСз малонат (5 мМ) + НАД (0,5 мМ) для выявления ЛДГ в течение 1 ч пpи 37 °C, pН 7,20 [9]. Для оценки активности ферментов в клетках крови вычисляли средний цитохимический показатель (СЦП) по формуле Kaplow: СЦП = N, + ^х2 + N^3 + N4x4 , 100 где N - количество клеток из 100 просмотренных нейтрофилов в одном мазке с определенной степенью активности фермента; 1, 2, 3, 4 - степень активности; 100 - число просмотренных нейтрофилов в одном мазке. При этом выделяли четыре степени активности (4-я ст. - нейтрофил полностью покрыт гранулами фор-мазана; 3-я ст. - 3/4 активности; 2-я ст. - 1/2 активности и 1-я ст. - 1/4 активности). Все измерения и исследования производили с использованием средств измерительной техники, прошедших метрологическую поверку, и вспомогательного оборудования, прошедшего аттестацию на базе отдела морфологии с электронной микроскопией Центральной научно-исследовательской лаборатории Медицинской академии имени С.И. Георгиевского Крымского федерального университета имени В.И. Вернадского. Статистическую обработку данных осуществляли с помощью лицензионного программного обеспечения Microsoft Office Exœl-2007 и Statistica 10.0. Данные представляли как M ± m. Отличия между группами оценивали по t-критерию Стьюдента, различия между величинами считали достоверными при p < 0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В ходе проведенных исследований выявлено, что в обеих опытных группах происходит достоверное снижение массы тела животных по сравнению с контролем на (25,61 ± 1,3) % (p < 0,05), а абсолютной массы сердца - на (18,73 ± 1,5) % (p < 0,05). При этом данные показатели значимо не отличались друг от друга у животных разных опытных групп. Само снижение массы сердца связано, по-видимому, с тем, что при гипоксии в миокарде происходит уменьшение поглощения кислорода, следовательно, имеет место снижение окислительных процессов; уменьшение фосфорилирования, т.е. снижается активность синтеза макроэргических продуктов; нет систематического распада АТФ и креа-тинфосфата, и это приводит к уменьшению стимуляции генетического аппарата и, как следствие, к угнетению синтеза белка. Гистологический анализ светооптических препаратов выявил, что в строме миокарда подопытных животных развивается отек, который распространяется почти на весь миокард. В цитоплазме кардиомиоцитов наблюдаются дистрофические изменения, в интерсти-ции появляются очаги миоцитолиза и наблюдается лимфоцитарная инфильтрация (рис. 1). Рис. 1. Морфологические изменения миокарда самцов крыс в условиях гистотоксической гипоксии: признаки дистрофии и отека миокарда, исчезновение поперечной исчерченности миофибрилл, их волнообразная структура. Окрашивание гематоксилином-эозином. Ув. х 400 Окрашивание по Маллори выявило избыточное количество коллагеновых волокон в интерстиции, а также в периваскулярном пространстве, что, по-видимому, дополнительно затрудняло транспорт субстратов и кислорода из кровеносного русла к рабочим клеткам в условиях гипоксии (рис. 2). Помимо этого, повсеместно выявлялись признаки нарушения гемодинамики, неравномерного капиллярного и венозного полнокровия, запустевания и спазма ряда сосудов гемомикро-циркуляторного русла за счет развития периваскуляр-ного отека. Рис. 2. Фибриллогенез в периваскулярном пространстве, местами разволокненные саркомеры миокарда. Окрашивание по Маллори. Ув. х 400 По данным гистохимического исследования в ряде кардиомицитов отмечалась жировая дистрофия, которая, очевидно, развивалась за счет декомпозиции жиро-белковых комплексов мембран внутриклеточных структур, а также в результате инфильтрации кардиомиоцитов липидами. В большинстве кардиомиоцитов 88 Выпуск 2 (66). 2018 выявлялись мелкие включения жира (пылевидное ожирение), которые сливались в капли (мелкокапельное ожирение), заполняющие у некоторых клеток всю саркоплазму (рис. 3). Рис. 3. Жировая дистрофия миокарда. Кардиомиоциты с пылевидными и каплевидными диффузными жировыми включениями. Окрашивание Суданом III. Ув. х 400 В ответ на гипоксическое воздействие у животных развивались характерные морфологические изменения в миокарде. Сарколемма отдельных кардиомиоцитов выглядела размытой, неоднородной по электронной плотности. Отмечался более электронноплотный матрикс орга-нелл, в частности митохондрий и эндоплазматической сети. Часто встречались кардиомиоциты с крупными, вытянутыми ядрами, в некоторых случаях ядерные оболочки образовывали складки, инвагинации, выпячивания. Количество гетерохроматина существенно увеличивалось, и его скопления концентрировались по периферии ядра. В ряде кардиомиоцитов обнаруживался довольно выраженный внутриклеточный отек, чаще наблюдавшийся в субсарколеммальном пространстве (рис. 4). Рис. 4. Фрагмент кардиомиоцита. Инвагинаты ядра (Я). В митохондриях (М) - деструкция крист и диффузная гомогенизация матрикса, разрушение саколеммы (стрелки). Дезорганизованные коллагеновые волокна в интерстиции (стрелки). (ТЭМ, х 15000) Заметные изменения претерпевал и энергетический аппарат клеток. Форма органелл обычно не изменялась. Митохондрии выглядели круглыми, овальными или вытянутыми, но их матрикс был конденсированным. Во многих митохондриях кристы были лизированы, что свидетельствует о значительном угнетении энергетических процессов в клетках. В зоне деструкции крист обнаруживались точечные зоны просветления (рис. 4). Иногда встречались гигантские митохондрии с разрушенными кристами и просветленным матриксом. Миофибриллярный аппарат кардиомиоцитов также характеризовался большой гетерогенностью. В большей части клеток он имел нормальную структуру. В некоторых кардиомиоцитах миофибриллы находились в состоянии расслабления. Однако наиболее характерной особенностью миокарда крыс, подвергнутых гис-тотоксической гипоксии, было наличие участков «пере-сокращения» мышечных волокон (рис. 5), т.е. такое сокращение саркомеров, при котором практически исчезает Н-полоса, а ширина I-дисков сильно уменьшена. В разных кардиомиоцитах эти участки имели различную величину. Так, в одних клетках «пересокращен-ными» выглядели только отдельные пучки миофибрилл, а в других почти все миофибриллы. Выявлялся значительный интерстициальный отек, наблюдалось увеличенное содержание коллагеновых волокон и соединительнотканных клеток, что может свидетельствовать о ремоделировании интерстициальной ткани миокарда, обусловленном, возможно, замещением некротизиро-ванных кардиомиоцитов. Рис. 5. Некроз сократительного кардиомиоцита. Миофибриллы в состоянии контрактуры II степени. Конденсация матрикса митохондрий. (ТЭМ, х 16000) Таким образом, к характерным изменениям структуры миокарда, вызванных хлоридом кобальта, можно отнести комплекс реактивно-дистрофических изменений в миокарде, проявляющийся в нарушении ультраструктуры ядер, деструкции сарколеммы по типу некроза и мембран органелл, в частности митохондрий, лизиса миофибриллярного аппарата, усиления фиброгенеза, главным образом, в периваскулярных зонах. Выпуск 2 (66). 2018 89 ЩШгорСз [ЩсмеТКЩ Анализ цитохимических показателей в нейтрофи-лах периферической крови у крыс без коррекции показал, что на момент исследования наблюдались их существенные отклонения от нормы. На момент обследования наблюдалось статистически значимое (р < 0,05) снижение аэробного окисления и рост анаэробного гликолиза, так, активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) снижалась по сравнению с контролем на 33,5 %, а активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) возрастала на 19,9% (р < 0,05) соответственно (рис. 6). Это свидетельствову-ет о компенсаторном преобладании анаэробного гликолиза на фоне резкого угнетения работы митохондрий. Общеизвестно, что сукцинатдегидрогеназа и лак-татдегидрогеназа относятся к числу важнейших клеточных ферментов, участвующих в процессе гликолиза [11]. Сукцинатдегидрогеназа прочно связана с внутренней митохондриальной мембраной клеток и катализирует реакцию, при которой янтарная кислота (сукцинат) дегидратируется в фумаровую кислоту (фумарат). Лактат-дегидрогеназа находится в цитозоле клетки и в анаэробных условиях катализирует обратимую реакцию восстановления пировиноградной кислоты (пируват) в молочную (лактат), являющейся конечным продуктом гликолиза. Рис. 6. Выявление гранул диформазана в лимфоцитах периферической крови с докрашиванием ядер нейтральным красным: A - ингибирование активность СДГ в лимфоците. Ув. х 1000; В - высокая активность ЛДГ Ув. х 1000 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Проведенное исследование показало, что в миокарде подопытных крыс развивались изменения, которые по морфофункциональным проявлениям можно было отнести к разновидностям токсической кардиоми-опатии. Типичные изменения миокарда после введения хлорида кобальта проявлялись в следующем: а) прогрессивное уменьшение доли неповрежденных кардиомиоцитов; б) лизирование митохондриальных крист и кон-трактурные изменения сократительного аппарата; в) нарастание стромальной пролиферации и лимфоцитарной инфильтрации, затрагивающей мышечные волокна с последующим коллагеногенезом. Комплексное исследование цитохимической активности нейтрофилов периферической крови у самцов крыс на фоне введения хлорида кобальта позволило прийти к заключению, что кобальт-индуцированная гипоксия сопровождается резким снижением аэробного окисления и ростом анаэробного гликолиза. ЛИТЕРАТУРА

About the authors

T. P Sataieva

Medical Academy named after S.I. Georgievsky of FSAEI HE «Crimean Federal University named after V.I. Vernadsky»

I. V Zadnipryany

Medical Academy named after S.I. Georgievsky of FSAEI HE «Crimean Federal University named after V.I. Vernadsky»

Email: zadnipryany@gmail.com

O. S Tretiakova

Medical Academy named after S.I. Georgievsky of FSAEI HE «Crimean Federal University named after V.I. Vernadsky»

References

Supplementary files