ASSAY TECHNIQUE VALIDATION OF THEADAMANTANE DERIVATIVE DRUG IN INJECTION DOSAGE FORM BY GLC

Full Text

Gimantan, validation, assay, gas-liquid chromatography. Гимантан - оригинальный противопаркинсоничес-кий препарат из ряда производных адамантана, созданный и фармакологически изученный в ФГБНУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова [1, 3]. По химической структуре препарат представляет собой N-^-ада-мантил)-гексаметиленимина гидрохлорид (рис. 1) [4]. Рис. 1. ^(2-адамантил)-гексаметиленимина гидрохлорид В результате поиска оптимальных лекарственных форм гимантана, проведенного в НИИ фармакологии имени В.В. Закусова, рекомендована к разработке инъекционная лекарственная форма. Внедрение нового лекарственного средства в медицинскую практику невозможно без его стандартизации. Основополагающим этапом стандартизации ле карственного препарата является разработка методик его фармацевтического анализа и их последующая валидация с целью оценки их соответствия поставленным целям. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Валидация разработанной ранее методики количественного определения гимантана в инъекционной лекарственной форме методом ГЖХ. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ В качестве объектов исследования использовались серийные образцы субстанции гимантана гидрохлорида, исходные продукты синтеза субстанции - гексаметиле-нимин и адамантан-2-он, основание гимантана и серийные образцы раствора гимантана для инъекций c концентрацией действующего вещества 25 мг/мл. Изучение хроматографической подвижности основания гимантана с помощью метода ГЖХ было выполнено на газовом хроматографе с пламенно-ионизационным детектором (Chrom 5, Чешская Республика). Хроматографирование проводили в следующих условиях: стеклянная колонка 1,2 м х 3 мм, сорбент Хромосрб WAW (80/100 меш) с нанесенной неподвижной фазой 10 % Apiezon L, 2 % КОН, температура Выпуск 4 (68). 2018 91 ©SSTOpßS ©ôffiïff испарителя - 210 °С, температура термостата - 190 °С, температура детектора - 210 °С, газ-носитель - азот, скорость подачи газа-носителя - 50 мл/мин, скорость водорода - 40 мл/мин, скорость воздуха - 400 мл/мин, объем пробы 1 мкл. Рабочая концентрация испытуемого раствора гимантана 0,1 мг/мл Для расчета содержания гимантана в пробах применен метод внутреннего стандарта, в качестве которого был использован N-(1-адамантил)ацетамид [6]. Типичная хроматограмма основания гимантана и ^(1-адамантил)ацетамида представлена на рис. 2. Рис. 2. Типичная хроматограмма основания гимантана и его внутреннего стандарта в концентрации 0,1 мг/мл Пробоподготовка образцов инъекционного раствора представляла собой двукратную экстракцию основания гимантана эфиром диэтиловым при подщелачи-вании водной фазы 1М раствором натрия гидроксида. 10 мл объединенного содержимого не менее чем 20 ампул раствора гимантана для инъекций помещали в делительную воронку вместимостью 50 мл, добавляли 10 мл раствора 1М натрия гидроксида, тщательно взбалтывали и оставляли на несколько минут. Экстракцию эфиром диэтиловым проводили следующим образом: добавляли 10 мл экстрагента, тщательно перемешивали и оставляли на 10 минут до расслаивания, добавляли еще 10 мл эфира диэтилового и процедуру повторяли. Затем отбирали 2 мл эфирного экстракта и помещали в мерную колбу на 25 мл, доводили объем раствора до метки спиртом этиловым и перемешивали. Отбирали 10 мл полученного раствора, помещали в мерную колбу на 100 мл, добавляли 10 мл раствора внутреннего стандарта, доводили объем раствора спиртом этиловым до метки и перемешивали (испытуемый раствор с концентрацией гимантана и его внутреннего стандарта по 0,1 мг/мл). Учитывая, что полнота экстракции основания гимантана в выбранных условиях составляет около 90 %, для устранения ошибки определения, связанной с неполным экстрагированием исследуемого вещества, содержание гимантана в инъекционном растворе оценивали относительно раствора рабочего стандартного образца (РСО) гимантана, пробоподготовку которого проводили аналогичным образом. Валидацию разработанной методики количественного определения гимантана в лекарственной форме проводили по следующим параметрам: специфичность, предел обнаружения, предел количественного определения, линейность, правильность, прецизионность и диапазон применения. Характеристики правильности, прецизионности, линейности и диапазона применения методики исследовались на пяти модельных растворах гимантана с концентрациями 80, 90, 100, 110, 120 % от содержания гимантана по отношению к номинальному значению (X факт%). Для каждого из пяти модельных растворов проводили экстракцию, описанным выше способом, далее отбирали по три аликвоты экстракта, получая по три испытуемых раствора на каждую точку диапазона концентраций. Оценку содержания гимантана проводили относительно раствора РСО гимантана. Хроматографировали испытуемые растворы и раствор РСО гимантана, получая не менее 5 хроматограмм каждого из растворов. Рассчитывали средние значения содержания ги-мантана в процентах к концентрации раствора сравнения (У) и величину Z;, представляющую собой найденную концентрацию в процентах к введенной. Оценку отдельных валидационных характеристик проводили по ряду расчетных критериев согласно требованиям «Руководства по валидации методик анализа лекарственных средств» и рекомендациям авторов статьи «Стандартизованная процедура валидации методик количественного анализа лекарственных средств методом стандарта» [2, 5]. Расчеты параметров линейной зависимости b, Sb, a, Sa и RSD0 (относительное остаточное стандартное отклонение) проводили методом наименьших квадратов. Прямую (у = bx + a) строили в нормализованных координатах (X и Y). Для оценки линейности методики использовали следующие критерии: 1) требования статистической и практической не-значимости к свободному члену прямой (а). Так, величина свободного члена должна быть меньше доверительного интервала своей неопределенности (т.е. статистически неотличима от нуля): а <ЛA = t(95%,n - 2) • sa = 1.895-sa, где Sa - стандартное отклонение свободного члена на прямой, найденное методом наименьших квадратов. Вклад свободного члена в неопределенность результата анализа должен быть незначимым в сравнении с максимально допустимой неопределенностью (практическая незначимость): a < 0.32 -Л as (%) 1 - (80/100) a < 3.8 2) требование к остаточному стандартному отклонению (RSD0). Доверительный интервал разброса точек вокруг прямой равный произведению остаточного стандартного отклонения (RSD0) на коэффициент Стьюдента (число степеней свободы точек прямой равняется 92 Выпуск 4 (68). 2018 f = 5 - 2 = 3) не должен превышать максимально допустимую неопределенность методики анализа: RSD0 / b < - А, 2.4 = 0.754%, t(95%,3) 3.182 где b - угол наклона для рассчитанной регрессионной прямой. 3) требование к коэффициенту корреляции (r). Диапазон исследуемых концентраций характеризуется стандартным отклонением (RSDrange), рассчитанным по формуле: RSD I (с,- - ^ )2 С2 •100%, • ( g -1) где G - концентрация i-го раствора; Сср - средняя концентрация растворов; g - число выборок (число точек прямой). Величина RSDrange для 5 исследуемых точек составляла 15,81. Коэффициент корреляции рассчитывали по формуле: r = 1 - RSD 0 RSD у range J Рассчитанный коэффициент корреляции не должен быть менее следующего критического (минимального) значения: r > 1 - Ґ Л 2 AAs /1(95%,g - 2' RSD~„ = 0,9988 Прогноз полной неопределенности методики включал в себя неопределенность пробоподготовки (AgP) и неопределенность конечной аналитической операции (AFAO). Неопределенность конечной аналитической операции рассчитывали по следующей формуле: _ vT X (RSD A х 1.645 ) A_ = •J5 Asp = $ А 1 • где AV,i - составляющая неопределенности, связанная с конкретной операцией пробоподготовки (взятие навески, аликвоты и др.) и рассчитанная с применением предельных неопределенностей взвешивания и мерной посуды, приведенных в «Руководстве по валидации методик анализа лекарственных средств» [5]. Максимально допустимую полную неопределенность результатов анализа (maxAAs), рассчитывали исходя из допуска содержания действующего вещества в препарате (B, %), что, согласно ГФ XI, составляет ±7,5 %, соответственно A. = 0,32 х В = 0,32 х 7,5 = 2,4. max As ’ ’ ’ ’ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В выбранных условиях анализа время удерживания технологической примеси адамантан-2-она составляет около 1 мин, время удерживания внутреннего стандарта ^(1-адамантил)ацетамида - около 5 мин, пика технологической примеси гексаметиленимина на хроматограмме при выбранной температуре колонки не наблюдается в течение 45 мин анализа, что может быть объяснено выходом вещества вместе с растворителем. Таким образом, учитывая, что время выхода основного действующего вещества составляет в выбранных условиях 12 мин, методику можно охарактеризовать как специфичную. Пределы обнаружения и количественного определения были установлены экспериментально по соотношению сигнал/шум и составляли 0,001 мкг и 0,002 мкг для ^(1-адамантил)ацетамида, и 0,0005 мкг и 0,001 мкг для основания гимантана соответственно. Требования к параметрам линейной зависимости выполняются в диапазоне концентраций от 80 до 120 % от номинального содержания гимантана в препарате (табл. 1). График линейной зависимости в нормализованных координатах представлен на рис. 3. где RSDa = 1,36 % - предельное относительное стандартное отклонение соотношения площадей пиков основания гимантана к внутреннему стандарту для пяти параллельных измерений; 1,645 - коэффициент Гаусса для односторонней вероятности 95 %; V2 - коэффициент, обусловленный получением данных путем сравнения площадей пиков, полученных при хроматографировании испытуемого раствора и раствора РСО гимантана; V5 - коэффициент, обусловленный проведением пяти параллельных хроматографирований пробы. Неопределенность пробоподготовки рассчитывали по формуле: 130 -| т ф а к а « 7 0 8 0 9 Н 0 1 ормапизован 0 1 ая величина 0 1 < 0 130 Рис. 3. Линейная зависимость площади пика от концентрации модельных растворов гимантана в нормализованных координатах Результаты определения правильности и прецизионности методики количественного определения гимантана на модельных смесях представлены в табл. 2. 2 Выпуск 4 (68). 2018 93 iïïtegirmtufe П^оМгГІМІ^ Таблица 1 Метрологические характеристики линейной зависимости y = 0,9766 х +2,2385 Параметр Значение Критерии (В ±7,5 %, диапазон 80 -120 %, n = 5) Вывод b 0,9766 - - Sb 0,0243 - a 2,2385 1) < 7,7 (статистическая незначимость) 2) < 3,8 (практическая незначимость) выполняется по обоим критериям Sa 2,4136 - - RSD0 0,754 - - RSDü/b 0,751 < 0,754 соответствует r 0,9988 > 0,9988 соответствует Таблица 2 Результаты анализа модельных растворов гимантана и их статистическая обработка Навески гимантана, г Введено гимантана в % от номинального (Х факт, %) Найдено гимантана в % к концентрации раствора сравнения (Yi, %) Относительная ошибка определения,% Найдено гимантана в % к введенному Zi = 100 x (Yi/Xi), % 0,5013 80,2 81,0 80,4 1,0 101,00 80,4 0,25 100,25 79,9 0,37 99,63 0,5621 89,9 91,3 90,8 1,56 101,56 90,2 0,33 100,33 90,8 1,00 101,00 0,6262 100,2 99,3 99,1 0,90 99,10 98,9 1,30 98,70 91,1 1,11 98,89 0,6874 109,9 110,5 109,9 0,55 100,55 110,1 0,18 100,18 109,2 0,64 99,36 0,7507 120,1 120,3 119,6 0,17 100,17 118,9 1,00 99,00 119,7 0,33 99,67 Среднее Zср, % 99,96 Относительное стандартное отклонение Sz, % 0,86 Доверительный интервал Az = t(95%,14) x Sz = 2,145 x 0,86 1,84 Критическое значение для сходимости результатов Aas,% 2,4 Критерий прецизионности Az = t(95%,14) x Sz, % < Aas Выполняется Систематическая погрешность 5% = |Z-100| 0,04 Критерий незначимости систематической погрешности: 5% < Az / Vn = 1,84/ 3,87 = 0,48 2) 5% < 0,75 (0,1 * В) 0,04 < 0,48 (выполняется) Выполняется мости систематической погрешности (5 %) разработанной методики. Прогнозируемая полная неопределенность методики, вычисленная как сумма неопределенности подготовки проб и неопределенности конечной аналитической операции, не превышает критического значения 2,4 % (табл. 3), то есть будет давать корректные результаты и в других лабораториях. Из данных, приведенных в таблице, следует, что методика характеризуется достаточной правильностью и прецизионностью во всем диапазоне концентраций (от 80 % до 120 %): доверительный интервал (Az) не превышает максимально допустимую неопределенность результатов анализа (maxAAs), выполняются критерии статистической и практической незначи- 94 Выпуск 4 (68). 2018 Таблица З Расчет полной неопределенности методики количественного определения гимантана в инъекционном растворе методом ГЖХ, % Расчет неопределенности пробоподготовки операция пробоподготовки неопределенность Раствор РСО гимантана 1. Взятие навески РСО гимантана (0,625 г) 0,2/625 X 100% = 0,032 (0,2 мг погрешность взвешивания) 2. Доведение до объема в мерной колбе вместимостью 25 мл 0,23 3. Отбор аликвоты пипеткой 10 мл 0,5 4. Двукратное добавление экстрагента пипеткой 10 мл 0,5 и 0,5 5. Отбор аликвоты экстракта пипеткой 2 мл 0,5 6. Доведение до объема в мерной колбе вместимостью 25 мл 0,23 7. Отбор аликвоты пипеткой 10 мл 0,5 8. Отбор аликвоты раствора внутреннего стандарта 10 мл 0,5 9. Доведение до объема в мерной колбе вместимостью 100 мл 0,12 Испытуемый раствор гимантана 1. Отбор аликвоты пипеткой 10 мл 0,5 2. Двукратное добавление экстрагента пипеткой 10 мл 0,5 и 0,5 3. Отбор аликвоты экстракта пипеткой 2 мл 0,5 4. Доведение до объема в мерной колбе вместимостью 25 мл 0,23 5. Отбор аликвоты пипеткой 10 мл 0,5 6. Отбор аликвоты раствора внутреннего стандарта 10 мл 0,5 7. Доведение до объема в мерной колбе вместимостью 100 мл 0,12 Раствор внутреннего стандарта 1. Взятие навески внутреннего стандарта (0,1 г) 0,2/100 X 100% = 0,2 2. Доведение до объема в мерной колбе вместимостью 100 мл 0,12 Asp = V (0,0322 + 0,232 + 0,52 + 0,52+ 0,52 + 0,52+ 0,232 + 0,52+ 0,52 + 0,122+ 0,52 + 0,52+ 0,52 + 0,52+ 0,232 + 0,52 + 0,52 + 0,122+ 0,22 + 0,122) = V3,2 = 1,79 Расчет неопределенности конечной аналитической операции ЛFA0 = V2 х (RSDa х 1,645 /V5) = V2 х (1,36 х 1,645 /V5) = 1,41 Расчет полной неопределенности методики ЛAs = V (Asp 2 + Лрао 2) = V (1,412 + 1,792) = 2,28 Ла < max ЛAs 2,28 < 2,4 ЛИТЕРАТУРА

About the authors

M. S Sergeeva

FSBSI «Research Institute of Pharmacology named after V. V. Zakusov» RAMS

Email: otopharm@mail.ru

L. N Grushevskaya

FSBSI «Research Institute of Pharmacology named after V. V. Zakusov» RAMS

L. M Gaevaya

FSBSI «Research Institute of Pharmacology named after V. V. Zakusov» RAMS

N. I Avdyunina

FSBSI «Research Institute of Pharmacology named after V. V. Zakusov» RAMS

M. E Dudenkova

FSBSI «Research Institute of Pharmacology named after V. V. Zakusov» RAMS

E. D Denisenko

FSBSI «Research Institute of Pharmacology named after V. V. Zakusov» RAMS

S. V Minaev

FSBSI «Research Institute of Pharmacology named after V. V. Zakusov» RAMS

References

Supplementary files