INFLUENCE OF VERO CELL CULTURE SYNCHRONIZATION ON THE RESULTS OF CYTOTOXIC TESTS IN THE STUDY OF NEW MEDICINES

Full Text

Изучение биологической активности новых химических веществ, независимо от последующей цели их использования, на первом этапе предполагает оценку их токсичности, чаще всего с использованием культур клеток. При выборе культуры клеток для исследований, не последнюю роль играет возможность синхронизовать культуру в определенной фазе клеточного цикла, так как синхронизация клеточных популяций представляет возможность изучить молекулярные и функциональные изменения, происходящие как при перемещении клеток через клеточный цикл, так и в строго определенной его фазе. В растущей культуре можно обнаружить клетки во всех стадиях клеточного цикла, и ответ, полученный от такой гетерогенной системы, будет характеризоваться очень высокой вариабельностью. Поэтому процедура синхронизации может решить эту проблему. В настоящее время известно большое количество эффективных методов, позволяющих синхронизовать культуру в определенной фазе клеточного цикла, однако идеального метода синхронизации нет. Одни методы характеризуются низким выходом синхронизированных клеток, другие -нарушают физиологическую активность, третьи -токсичны для самих клеток или могут искажать результаты ответа клеток в цитологических тестах. Кроме того, для нормальных или опухолевых клеток методы синхронизации различны. В настоящем исследовании использовался метод сывороточного голодания, который синхронизирует клетки на границе фаз G0/G1 [3]. Удаление сыворотки из среды выращивания культуры клеток в течение 24 ч приводит к накоплению клеток в фазе G1. Этот блок легко снимается и, после добавления сыворотки, клетки могут вступить в S-фазу. С высокой степью эффективности этот метод можно применять для нетрансформированных клеток, поскольку в раковых клетках пролиферация слабо зависит от наличия в среде сыворотки и факторов роста. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Оценить влияние синхронизации клеточной линии Vero на результаты цитотоксических тестов. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Исследование выполнялось на монослойной клеточной культуре Vero. Культивирование клеток проводилось в среде DMEM (ПанЭко) с добавлением 10%-й фетальной бычьей сыворотки (ФБС) (ПанЭко), L-глутамина и смеси антибиотиков пенициллин-стрептомицин (ПанЭко). Культуральные флаконы с клетками инкубировали в С02-инкубаторе в условиях относительной влажности 90 % и выше, температуре 37 °С и концентрации С02 5 %. Пересев клеток осуществлялся при достижении ими конфлюэтного состояния (90-95 %). Снятие клеток со дна культурального флакона производили раствором трипсин (0,25 %) -версен (0,02 %) в соотношении 1:2 с последующим разведением в полной питательной среде DMEM при плотности посева 1,0-3,0*104. Для синхронизации клеточной культуры суспензию клеток рассевали на два культуральных флакона (75 см3), 96-луночные планшеты и на пластиковые чашки Петри для культивирования в полную среду с концентрацией ФБС 10 %. Клетки культивируются до достижения плотного монослоя, после чего в одном из флаконов производится замена культуральной среды на обедненную с концентрацией ФБС 0,1 %. Культивирование в обедненной среде проводится в течение 18-24 часов для достижения синхронизации клеток Vero на границе фаз G0/G1. Оценка эффективности синхронизации производилась с помощью проточного цитофлуориметра Guava Muse, Luminex с использованием стандартного набора для изучения клеточного цикла Muse Cell Cycle assay. Анализ основан на дифференциальном окрашивании клеток флуоресцентным интеркалирующим ядерным красителем пропидий йодит (PI) на основе содержания ДНК в клекте. Морфологическая оценка состояния синхронизированных и не синхронизированных клеток проводилась путем микроскопирования нативных образцов и образцов, окрашенных по Романовскому - Гимзе. Для оценки цитотоксичности фармацевтической субстанции РУ-185 использовали тест с поглощением нейтрального красного (НК-тест). Исследуемое соединение изучали в диапазоне доз от 1*10-3 до 1*10-5 M. В качестве отрицательного контроля использовался физиологический раствор в эквивалентных количествах. Инкубация с веществом проводилась на протяжении 2 часов в условиях культурального инкубатора. Затем среду с веществом отбирали, клетки промывали раствором Хэнкса и заливали в каждую лунку 96-луночного планшета по 250 мкл полной среды с добавлением красителя нейтральный красный (НК) в конечной концентрации 25 мкг/мл. Инкубировали с красителем в течение (3 ± 0,1) ч (t = 37 °C, СО2 = 5 %, влажность 95 %). На протяжении всего периода инкубации наблюдали кристаллообразование нейтрального красного в клетках. После инкубации среду с красителем отбирали и клетки промывали с 250 мкл раствора Хэнкса. Затем добавляли в каждую лунку по 100 мкл десорбирующего раствора (1%-я ледяная уксусная кислота и 50%-й этанол в дистиллированной воде). Планшет с десорбирующим раствором встряхивали на защищенном от света шейкере в течение 20-45 минут для полной экстракции нейтрального красного из клеток и образования гомогенного раствора. Адсорбция измерялась при Л = (540 ± 1) нм, используя в качестве референса лунки с десорбирующим раствором. Площадь проекции клеток на подложку (площадь клетки), коэффициент распластывания Rp/Ra, дисперсию, элонгацию и степень поляризации анализировали в цифровом виде с помощью программы Image J 1.51k [2]. Так как для анализа вышеописанных параметров клеток использовались относительные величины, то значения их оставляли в пикселях. Все эксперименты с культурами клеток проводились в трехкратных повторах. Статистическую обработку проводили с помощью следующих пакетов программ и программных продуктов: Excel из пакета Office XP («Microsoft», США), Statistica 6.0 (США), OriginPro 8.0 (OriginLab Corporation, США). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Анализируя полученные гистограммы после обработки клеток PI (рис. 1), наблюдали блок клеточного цикла на границе G0/G1 в образцах, растущих в обедненной клеточной среде (0,1 % ФБС) (рис. 1 в, г) по сравнению с клетками, растущими в стандартных условиях (10 % ФБС) (рис. 1 а, б). После проведенного гейтирования в пробе без синхронизации 53,7 % клеток находятся в стадии клеточного цикла на границе G0/G1, 6,6 % - в S-фазе и 39,7 % - на границе фаз G2/M. После синхронизации картина распределения выглядела следующим образом: 93,8 % - граница фаз G0/G1, 5,3 % - S-фаза и 0,9 % - граница фаз G2/M. Таким образом, применяя методику сывороточного голодания, можно добиться синхронизации клеточного цикла клеток линии Vero на границе G0/G1 с эффективностью 40 %. Рис. 1. Результаты синхронизации клеток Vero методом сывороточного голодания, полученные с прибора Guava Muse. Окраска стандартным набором Muse Cell Cycle assay. А, Б - без синхронизации; В, Г - после синхронизации При визуальном анализе нативных и окрашенных препаратов (рис. 2, 3) клеток, культивируемых как в полной среде, так и в условиях сывороточного голодания, изменения фибробластопо-добной формы не происходит. В образцах без синхронизации наблюдается активное деление, форма клеток стремится к мультиполярности, в отличие от синхронизированных образцов, где клетки имеют в большей степени биполярную морфологию (рис. 2, 3). Рис. 2. Клетки Vero: а - без синхронизации, б - после синхронизации, фазово-контрастная микроскопия, ув. *400 Рис. 3. Клетки Vero: а, в - без синхронизации, б, г - после синхронизации, окраска по Романовскому -Гимзе, (а, б - ув. *200, в, г - ув. *1000) Отношение средней площади клеток из образцов с содержанием 10 % ФБС в среде к средней площади синхронизированных клеток равно 1,122, что свидетельствует об уменьшении площади клеток. Коэффициент распластывания Rp/Ra для обоих образцов больше единицы (табл.), но для клеток, культивируемых в условиях сывороточного голодания, наблюдается тенденция к его увеличению, хотя статистически значимых различий между значениями обнаружено не было (р = 0,173). ln(Rp/Ra) также увеличивается недостоверно (р = 0,155). Коэффициент распластывания Rp/Ra был предложен в работе Кузьминых Е.В. и др. [1, 4]. Этот показатель равен отношению радиуса (Rp), рассчитанного из величины периметра клетки, взятого как длина окружности, и радиуса (Ra), рассчитанного из величины площади клетки, принятой за площадь круга [1, 4]. Чем выше величина этого коэффициента, тем сильнее клетка распластана на подложке. Кроме того, в работе оценивали величину натурального логарифма этого коэффициента - ln(Rp/Ra), поскольку шкала для оценивания после подобных математических преобразований становится более равномерной. Значение элонгации в образцах синхронизиро-ванн ых клеток увеличивается не достоверно (р = 0,08), но рост этого параметра свидетельствует об увеличении степени вытянутости клеток и стремлении их приобрести биполярную морфологию (табл.). Элонгация является величиной, характеризующей степень вытянутости клеток (биполярность), и равна нулю у радиально симметричных фигур. Данная величина определяется как log2 от отношения длинной оси эквимоментного эллипса фигуры к его короткой оси (Brown et al., 1989). Степень дисперсии уменьшается в 1,27 раз при синхронизации, но данное изменение также не н есет достоверного характера (р = 0,868) (табл.). Ди сп е рсия - это величина, отражающая степень «изрезанности» края клетки (мультиполярность), и равна нулю для любого эллипса. Она определяется как log2 от отношения площади равномоментного эллипса контура к площади этого контура. Полученные результаты вполне закономерны, поскольку с увеличением степени элонгации значение дисперсии неминуемо уменьшается. Поляризация клеток увеличивается недостоверно (р = 0,768) (табл.), но наблюдается стойкая тенденция к увеличению этого параметра, в большей степени за счет увеличения элонгации. Степень поляризации оценивается как сумма двух компонентов: дисперсии и элонгации. Таким образом, при синхронизации клеточной культуры Vero наблюдается основной пул клеток в стадии поляризации, что как раз характерно для фибробластоподобных культур. Морфометрические параметры клеток Vero Клетки Rp/Ra ln(Rp/ Ra) Элонга ция Диспер сия Поляри зация Несинхронизированные 1,189 ± 0,080 0,171 ± 0,071 0,879 ± 0,344 -0,388 ± 0,187 0,492 ± 0,897 Синхронизи рованные 1,399 ± 0,123 0,332 ± 0,860 1,657 ± 0,260 -0,493 ± 0,599 1,164 ± 1,519 Поскольку основная цель работы заключалась в оценке влияния синхронизации клеточной линии Vero на результаты цитотоксических тестов, нами было проведено исследование фармацевтической субстанции (ФС) РУ-185 в тесте с поглощением нейтрального красного. Обнаружено, что при воздействии ФС РУ-185 в концентрациях 0,25*10-3М и 1*10-3М наблюдается выраженный цитотоксический эффект. При этом, в результатах, полученных для данных экспериментальных точек, наблюдаются статистически значимые отличия между синхронизированными и не синхронизированными клетками (р < 0,05, критерий Манна -Уитни) (рис. 4). Для ФС РУ-185 в дозах, не входящих в цитотоксический диапазон, данный эффект не наблюдался. Log(C), М РУ-185 a ncoillI11 ®снпхр Bartlett Р Контроль 0,08 0,05 1,55 0,21 1*10 5М 0,16 0,09 2,23 0,14 0,5*1<ИМ 0,21 0,04 7.96 0.005 1*104М 0,20 0,07 3.91 0.048 0,25*10^ М 0,09 0,06 0,91 0,34 1*1<ИМ 0,008 0,07 14.59 0.0001 *р < 0,05 по критерию Манна - Уитни, р < 0,05 по критерию Бартлетта. ЛоглрСа (ЩойглТОЩ): Рис. 4. Выживаемость клеток линии Vero при воздействии фармацевтической субстанции РУ-185. Метод поглощения нейтрального красного. Статистически значимые различия между синхронизированными и несинхронизированными клетками Основной задачей, стоящей перед цитотокси-ческими тестами, является расчет Lc50 - полуле-тальной концентрации для клеточной популяции. Данный показатель необходим для выбора условий проведения последующих экспериментов по изучению токсических свойств новых химических соединений. После построения дозозависимых кривых при исследовании цитотоксичности ФС РУ-185 на синхронизированных и не синхронизированных клетках линии Vero, было выявлено, что для первых LC50 = 2,32*10-4 М ± 0,08, а для вторых LC50 = 1,90 *10-4 М ± 0,09 [х ± а]. Разница между этими значениями несет достоверный характер (p < 0,05, t-критерий Стьюдента). LC50 рассчитывался графически по дозозависимой кривой с помощью программного обеспечения OriginPro 8.0 (OriginLab Corporation). Значение функции вычисляли по формуле: A2 - A1 y = A1 + а значение LC50 по фор (logCx 0-x)p 1 +10 logx 0 муле: LC Крутизна наклона кривой (рис. 4) больше для синхронизированных клеток (-6468,14), что указывает на то, что большая часть клеточной популяции будет реагировать на действие повреждающего агента приблизительно одинаково в узком диапазоне доз. При этом пологий наклон графика (-9245,77), полученный для несинхронизированных клеток, свидетельствует о существенных различиях внутри клеточной популяции в чувствительности к ФС РУ-185. 50 В пользу данного факта свидетельствуют и результаты, полученные в тесте Бартлетта (рис. 4), при проверке равенства дисперсий для синхронизированных и не синхронизированных клеток. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, метод сывороточного голодания позволяет добиться синхронизации клеточного цикла клеток линии Vero на границе фаз G0/G1, при этом клетки приобретают удлиненную поляризованную форму (коэффициент элонгации равен 1,657±0,260) с коэффициентом распластывания 1,399 ± 0,123. Процедура синхронизации клеточной линии Vero позволяет получить популяцию клеток, реагирующих одинаково в узком диапазоне доз и более устойчивых к воздействию ФС РУ-185 (LC50 достоверно больше, чем для несинхронизированных клеток). Вариабельность данных при этом меньше, чем в популяции несинхронизированных клеток линии Vero.

About the authors

O. V. Verle

FSBEI HE «Volgograd State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

Email: Verle_olga@mail.ru

E. V. Zykova

FSBEI HE «Volgograd State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

O. V. Ostrovskii

FSBEI HE «Volgograd State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

V. E Verovvskii

FSBEI HE «Volgograd State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

References

Supplementary files