DEVELOPMENT AND VALIDATION OF METHODS FOR DETERMINATION OF CAPILLIN IN ESSENTIAL OIL OF ARTEMISIA SCOPARIA

Full Text

Полынь метельчатая Artemisia scoparia Waldst. заболеваниях дыхательных путей, нарушении еt Kit., сем. Asteraceae - однолетнее, реже дву- менструального цикла, ревматизме, как мочегон-летнее, травянистое растение. В народной ме- ное и противоглистное средство [9]. В настоящее дицине полынь метельчатая используется при время из этого вида полыни выделены химические вещества, обладающие высокой биологической активностью [9, 2]. Главной группой действующих веществ надземной части этого растения являются полиацети-леновые соединения, проявляющие выраженные антибактериальные и противогрибковые свойства в отношении различных видов патогенной микрофлоры животных и человека. Наиболее сильным противогрибковым действием обладает капиллин [1, 5]. Широкий фармакологический скрининг ароматических полиацетиленов выявил возможность разработки на их основе препаратов с цитостатичес-ким, противотуберкулезным и противовоспалительным действием [3, 6]. Объектом исследования явилась трава полыни метельчатой, собранная в фазу стеблевания на территории коллекционного питомника Никитского ботанического сада [7]. Предварительное изучение динамики накопления основной группы действующих веществ (полиацетиленов) надземной части полыни метельчатой показало, что максимальное содержание главного компонента из этой группы -капиллина - происходит в фазу стеблевания. Поэтому в настоящее время нами рассматривается вопрос о том, что заготовка надземной части этого растения может происходить именно в эту фазу. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Разработка валидированной методики определения капиллина в эфирном масле из травы полыни метельчатой. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Эфирное масло получали перегонкой из сухого сырья с водяным паром при использовании прибора Клевенджера в модификации Лошкарева [5]. Выход составляет (1,2 ± 0,3) % в пересчете на воздушно-сухое сырье. Точную навеску сырья (около 400 г), измельченного до размера 7 мм, помещали в колбу вместимостью 4000 мл, приливали 3 л воды очищенной и доводили до кипения. Эфирное масло отгоняли при скорости стекания дистиллята 60-65 капель в минуту в течение 5 часов. Предварительное исследование динамики выхода эфирного масла из сырья полыни метельчатой показало, что его максимальное значение приходится на пятый час отгонки эфирного масла данным методом. Через 5 минут после окончания перегонки измеряли объем эфирного масла в приемнике. Выделенное эфирное масло пропускали через слой силикагеля (2-3 см) для удаления воды. Идентификацию и количественное определение капиллина в полученном эфирном масле проводили методом планарной хроматографии. Условия хроматографирования: пластинки «Sorbfil» ПТСХ-П-А-УФ 10 х 15 см, система растворителей -гексан-этилацетат (9:1). Точные объемы (1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 мкл) раствора СО капиллина с концентрацией 11,3 мг/мл точечно наносили на линию старта хроматографической пластинки. Кроме того, на этой же пластинке обозначали две линии контрольных треков с нанесенными гексановыми растворами эфирного масла полыни метельчатой (1:2) объемом 1,0 мкл. Хроматографирование осуществляли в камере (объемом 2000 см3), предварительно насыщенной парами растворителей. После прохождения фронтом растворителя на хроматографической пластинке расстояния 8-9 см пластинку извлекали из камеры. В вытяжном шкафу пластинку высушивали до удаления паров растворителя при комнатной температуре. При дневном освещении на пластинке появляются пятна желтого цвета. Окраска усиливается в УФ-свете. Сканирование пластинки с разрешением 100 dpi проводили на планшетном сканере «HPS canjet 3670». Цифровую обработку результатов осуществляли с использованием программного обеспечения «Видеоденситометр Sorbfil» (г. Краснодар). По градуировочному графику зависимости «масса вещества - площадь пика» (линейная аппроксимация) с использованием метода абсолютной калибровки (внешнего стандарта) определяли содержание капиллина в исследуемых образцах эфирного масла. При статистической обработке результатов определений руководствовались требованиями ОФС «Статистическая обработка результатов химического эксперимента и биологических испытаний» [9]. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ На треках контрольного образца в условиях эксперимента обнаруживали четыре зоны сканирования желтого цвета, а на оцифрованной хроматограмме - четыре пика: с Rf 0,6 (не идентифицирован); Rf 0,29 (капиллол); Rf 0,61 (капиллин); Rf 0,8 (капиллен). Идентификацию проводили с помощью свидетелей (СО). Капиллину соответствует пик с Rf 0,61 (рис. 1). Рис. 1. Хроматограмма эфирного масла полыни метельчатой (2) и СО капиллина (1) В соответствии с требованиями действующей Государственной фармакопеи и международных стандартов для любой разрабатываемой аналитической методики должна экспериментально подтверждаться ее пригодность к практическому использованию и получению достоверной информации об объекте анализа. В качестве основных характеристик, оценивающих валидность методики, определяли ее чувствительность, специфичность, линейность, предел количественного определения, правильность и прецизионность. Чувствительность, то есть предел обнаружения (ПО), рассчитывали по формуле: ПО = 3,3 х s/b, где: S - стандартное отклонение сигнала; b - угловой коэффициент градуировочного графика. ПО = 13,7 мкг. Специфичность характеризовали значением Rf пятен зоны сканирования контрольного трека и его соответствием Rf зон сканирования стандартного образца (0,61 ± 0,02). Эффективность пластинки (N) составила около 600 теоретических тарелок. Предел количественного определения (ПКО) рассчитывали по формуле: ПКО = 10 х s/b, ПКО = 41,6 мкг. Измерение аналитических сигналов для 5 проб с разными концентрациями СО капиллина позволили установить линейность методики. Уравнение регрессии и коэффициент корреляции рассчитывали с использованием электронных таблиц Microsoft Excel. Значимость свободного члена линейной зависимости (а) и углового коэффициента (b) определяли методом наименьших квадратов. Зависимость площадей пиков от содержания капиллина в аналитической области методики (от 10 до 60 мкг в пробе) оказалась линейной. з Уравнение регрессии имеет вид: S = 1,21 х 10 m (рис. 2). Свободный член «а» значимо не отличается от нуля. Коэффициент корреляции r - 0,993. 80000 60000 40000 20000 о 20 40 т. мкг 60 0 Рис. 2. Градуировочный график СО капиллина Линейная зависимость также установлена между различными объемами эфирного масла (0,5-2,0 мкл), наносимого на пластинку (аналита), и величиной аналитического сигнала. Уравнение регрессии имеет вид: S = 1,03 х 104V. Коэффициент корреляции r - 0,997. Правильность методики определяли методом «введено-найдено». Содержание капиллина на 5 уровнях концентраций СО рассчитывали по уравнению градуировочного графика и определяли метрологические характеристики (Хср = 103,7 %; ЛХ = 9,1 %; RSD % = 9,9 %; Е = 8,8 %). С использованием данной методики определили количественное содержание капиллина в эфирном масле из травы полыни метельчатой. Результаты представлены в табл. 1. Таблица 1 Результаты количественного определения капиллина в эфирном масле из травы полыни метельчатой Содержание, г/100 г эфирного масла Метрологические характеристики 9,5 Хср = 9,65 9,5 RSD % = 9,93 % 9,3 ЛХ = 1,00 10,1 Е - 10,43 % 8,3 11,2 Определение содержания компонентов эфирного масла. Методом внутренней нормализации определена массовая доля основных компонентов эфирного масла полыни метельчатой, выявленных в условиях эксперимента (см. рис. 1). Наибольшую долю составляет капиллин (табл. 2). Таблица 2 Содержание компонентов эфирного масла полыни метельчатой Пик Rf Вещество S % S 1 0,06 Не идентиф. 10637 5,5 2 0,29 капиллол 39424 20,6 3 0,61 капиллин 91644 47,8 4 0,80 капиллен 50058 26,1 Сумма - - 191763 - ЗАКЛЮЧЕНИЕ Предложена эффективная, высокочувствительная методика идентификации и количественного определения полиацетиленового вещества капиллина в эфирном масле полыни метельчатой. Разработанная методика валидна по показателям линейность, правильность и сходимость. Не требует использования сложного дорогостоящего оборудования. Содержание капиллина в эфирном масле составляет (9,65 ± 1,00) %. Определена массовая доля основных компонентов эфирного масла. На долю капиллина приходится 47,8 %. Разработанную методику планируется использовать для изучения изменчивости содержания капиллина в образцах эфирного масла из травы полыни метельчатой различного географического происхождения и оценки качества этого сырья.

About the authors

E. E Airapetyan

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - affiliate of the FSBEI HE «The Volgograd State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

T. D Mezenova

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - affiliate of the FSBEI HE «The Volgograd State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

O. M Shevchuk

FSBIS «Order of the red banner of labor Nikitsky Botanical Garden - National scientific centre of RAS»

L. A Logvinenko

FSBIS «Order of the red banner of labor Nikitsky Botanical Garden - National scientific centre of RAS»

D. A Konovalov

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - affiliate of the FSBEI HE «The Volgograd State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

Email: konovalov_da@pochta.ru

References

Supplementary files