EFFECT OF ADJUVANT PREPARATIONS ON THE EXPRESSION OF ANALGETIC ACTIVITY OF MORPHIN IN SOMATOGENIC PAIN

Full Text

В настоящее время в клинической практике опиоиды используются в качестве основных анальгетиков для лечения умеренной и сильной боли. Применение адъювантных анальгетиков (препараты, которые не предназначены для купирования боли, но могут использоваться для этой цели) наиболее эффективно при лечении невропатической боли, фибромиалгии, в комплексном лечении боли при онкологическом процессе. В качестве адъювантных препаратов чаще всего используются анксиолитики, антиконвуль-санты, спазмолитики, агонисты альфа-адрено-рецепторов. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Изучить анальгетическую активность адъювантных препаратов при совместном введении с морфином на модели соматогенной боли у мышей-самцов при внутрибрюшинном введении. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Эксперименты выполнены на 105 белых беспородных мышах-самцах массой 20-25 г, содержащихся в условиях вивария (температура 22-24 °С, относительная влажность воздуха 40-50 %) с естественным световым режимом на стандартной диете (ГОСТ Р 50258-92) при соблюдении правил лабораторной практики проведения доклинических ис-сл едова ний в РФ (ГОСТ З 51000.3-96 и 1000.4-96), а также правил и Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997). Эксперименты были одобрены региональным исследовательским этическим комитетом Волгоградской области (протокол № 2077-2018 от 30 октября 2018 г.) Лицензия на деятельность по обороту наркотических средств, психотропных веществ и их пре-ку рсоров (№ ФС-34-03-000004-16 от 25 октября 2016 г.). Изучение анальгетической активности препаратов проводилось на модели отдергивания хвоста от теплового изучения (tail flick) в соответствии с методикой, описанной в руководстве (Т.А. Воронина, Л.С. Гузееватых, 2012) [1]. Животные помещались в фиксатор, затем на дистальную часть хвоста наносилось локальное термическое раздражение источником инфракрасного света (Т = 55 °С) с автоматической регистрацией реакции отдергивания хвоста (Ugo Basile, Италия) (латентный период избавления от болевого раздражителя - ЛП, с). Во избежание повреждения тканей максимальное время температурного воздействия ограничивалось 15 с. Изучаемые препараты растворялись в дистиллированной воде и вводились внутрибрюшинно в объеме 100 мкл на 10 г веса животного. Регистрация ЛП проводилась трехкратно на 30, 60 и 90 минутах после введения адъювантного препарата. При совместном введении морфин вводился за 15 минут до адъювантного препарата. Животные случайным образом были распределены на следующие группы: группа контроля (дистиллированная вода); морфин (1 мг/кг) (Московский эндокринный завод, Россия); морфин (1 мг/кг) + галоперидол (0,45 мг/кг) (ООО «Озон», Россия); морфин (1 мг/кг) + мидазолам (0,3 мг/кг) (Cenexi SAS, Швейцария); морфин (1 мг/кг) + диазепам (1 мг/кг) (Московский эндокринный завод, Россия); морфин (1 мг/кг) + метоклопрамид (5 мг/кг) (Новосибхимфарм АО, Россия); морфин (1 мг/кг) + атропина сульфат (2,7 мг/кг) (Дальхимфарм, Россия); морфин (1 мг/кг) + клони-дин (1 мг/кг) (Органика АО, Россия); морфин (1 мг/кг) + габапентин (90 мг/кг) (ПИК-ФАРМА, Россия) по 5 особей в группе. Дозы препаратов выбраны в соответствии с литературными данными и ранее проведенными исследованиями [2]. Статистическая обработка проводилась в программе GraphPad Prism7.0 (среднее значение латентного периода и стандартная ошибка среднего) непарный t-тест и one-way ANOVA с поправкой Даннета. Для оценки влияния адъювантных препаратов рассчитывались показатели активности относительно значений группы контроля (%) и максимально возможного эффекта (МВЭ, %): МВЭ = ДПм-ДПкмтр * 100% , МАХВРЕМЯ “ЛПКОНР где ЛПоп - латентный период реакции после введения вещества, ЛПконтр - латентный период реакции до введения вещества, МАХвремя - максимальное время нанесения раздражителя (15 с). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В ходе исследования влияния адъювантных препаратов на анальгетическую активность морфина была показана неоднородность их эффектов (табл. 1-7). Средние значения латентного периода отдергивания хвоста в контрольной группе животных составили (3,59 ± 0,50) с (ЛПКОнтр), что согласуется с данными литературы и результатами предыдущих исследований [3]. Средние показатели активности в группе морфина для 30, 60 и 90 мин - 60,6, 76,9 и 66,2 %, при этом величина МВЭ - 19,1; 24,7 и 21,6 % соответственно. На первом этапе исследования изучалось взаимодействие морфина с антагонистами D2 рецепторов - галоперидолом и метоклопрамидом (табл. 1, 2). Таблица 1 Влияние морфина при совместном введении с галоперидолом на анальгетическую активность в тесте отдергивания хвоста у мышей-самцов при внутрибрюшинном введении, с Время экспозиции, мин Контроль Морфин 1 мг/кг Морфин 1 мг/кг + галоперидол 0,45 мг/кг 30 3,95 ± 0,49 5,48 ± 0,35* 8,86 ± 0,60*# 60 4,07 ± 0,55 7,08 ± 0,65* 8,63 ± 0,46*# 90 4,10 ± 0,53 6,54 ± 0,42* 10,48 ± 0,69*# Здесь и далее: •достоверные отличия от группы контроля ANOVA, пост-тест Даннета, р < 0,05; # достоверные отличия от группы препарата сравнения -морфина. Непарный t-тест, р < 0,05. При комбинировании традиционного опиоида с галоперидолом показатель ЛП достоверно увеличивался во всех временных точках относительно как группы контроля, так и группы морфина. Величина МВЭ в группе совместного введения составила 46,2; 44,2 и 60,4 %, что в среднем в 2,3 больше, чем показатель МВЭ для группы морфина (см. табл. 1). Совместное введение морфина и метокло-прамида статистически значимо изменяло показатели ЛП относительно данных группы контроля на протяжении всего эксперимента и относительно группы препарата сравнения на 60-й и 90-й минут ах (табл. 2). При этом показатели активности при одновременном введении составили 82,7; 101,8 и 93,9 соответственно, что в среднем на 25 % превышает усредненные показатели активности морфина в каждой из временных точек. Таблица 2 Влияние морфина при совместном введении с метоклопрамидом на анальгетическую активность в тесте отдергивания хвоста у мышей-самцов при внутрибрюшинном введении, с Время экспозиции, мин Контроль Морфин 5 мг/кг Морфин 1 мг/кг + метоклопрамид 5мг/кг 30 3,13 ± 0,69 6,75 ± 0,55* 6,56 ± 0,65* 60 3,27 ± 0,36 6,32 ± 0,50* 7,23 ± 0,82*# 90 3,45 ± 0,46 5,67 ± 0,45* 6,93 ± 0,63*# На втором этапе изучалось влияние противо-эпилептического средства на выраженность мор-финовой анальгезии (табл. 3). Таблица 3 Влияние морфина при совместном введении с габапентином на анальгетическую активность в тесте отдергивания хвоста у мышей-самцов при внутрибрюшинном введении, с Время экспозиции, мин Контроль Морфин 1 мг/кг Морфин 1 мг/кг + габапентин 90 мг/кг 30 4,06 ± 0,62 5,48 ± 0,77* 7,05 ± 0,57*# 60 3,95 ± 0,49 6,04 ± 0,42* 7,92 ± 0,76*# 90 4,10 ± 0,56 7,08 ± 0,65* 7,07 ± 0,81* Одновременное применение морфина и габа-пентина статистически значимо увеличило показатели латентного периода отдергивания хвоста по сравнению с данными группы контроля и группой опиоида (за исключением временной точки 90 мин). Величина МВЭ при этом в 1,5 раза превышала показатели группы морфина (30,3; 38,0 и 30,5% соответственно). Третьим этапом являлось изучение влияния производных бензодиазепина на выраженность анальгетического эффекта морфина (табл. 4, 5) Таблица 4 Влияние морфина при совместном введении с диазепамом на анальгетическую активность в тесте отдергивания хвоста у мышей-самцов при внутрибрюшинном введении, с Время экспозиции, мин Контроль Морфин 4 мг/кг Морфин 4 мг/кг + диазепам 1 мг/кг 30 3,13 ± 0,69 5,29 ± 0,33* 4,17 ± 0,38*# 60 3,27 ± 0,36 6,46 ± 0,34* 3,88 ± 0,61# 90 3,10 ± 0,20 5,20 ± 0,38* 3,78 ± 0,37# При совместном введении диазепама и морф и на отличия ЛП от контрольной группы были выявлены только через 30 минут после введения (табл. 4). При этом во всех временных точках наблюдалось статистически значимое отличие от группы морфина, а показатели МВЭ прогре-диентно снижались в несколько раз (3,8; 9,7 и 12,9 раз соответственно). Таблица 5 Влияние морфина при совместном введении с мидазоламом на анальгетическую активность в тесте отдергивания хвоста у мышей-самцов при внутрибрюшинном введении, с Время экспозиции, мин Контроль Морфин 1 мг/кг Морфин 1 мг/кг + мидазолам 0,3 мг/кг 30 3,61 ± 0,21 5,80 ± 0,55* 5,46 ± 0,99* 60 3,64 ± 0,27 6,10 ± 0,80* 6,35 ± 0,75* 90 3,58 ± 0,34 5,65 ± 0,83* 6,23 ± 0,55* Комбинирование морфина и мидазолама привело к значительному увеличению показателей латентного периода отдергивания хвоста относительно данных группы контроля, при этом различий в ЛП с группой морфина выявлено не было (табл. 5). На четвертом этапе исследовалось взаимодействие морфина с агонистом а-адренорецеп-торов (табл. 6). Таблица 6 Влияние морфина при совместном введении с клонидином на анальгетическую активность в тесте tail flick у мышей-самцов при внутрибрюшинном введении, с Время экспозиции, мин Контроль Морфин 1 мг/кг Морфин 1 мг/кг + клонидин 1 мг/кг 30 3,95 ± 0,35 5,48 ± 0,77 10,98 ± 1,55*# 60 3,84 ± 0,32 6,04 ± 0,42* 9,50 ± 1,23*# 90 3,97 ± 0,42 7,08 ± 0,65* 11,14 ± 1,56*# Сочетание морфина и клонидина способствовало статистически достоверному увеличению показателей ЛП во всех временных точках относительно групп контроля и морфина. Активность этой группы в среднем на 125 % превосходила показатели группы морфина (205,85; 164,62; 210,31 % соответственно). На заключительном этапе оценивалось взаимодействие морфина и М-холиноблокатора (табл. 7). Таблица 7 Влияние морфина при совместном введении с атропином на анальгетическую активность в тесте отдергивания хвоста у мышей-самцов при внутрибрюшинном введении, с Время экспозиции, мин Кон троль Морфин 1 мг/кг Морфин 1 мг/кг + атропин 2,7 мг/кг 30 3,46 ± 0,31 6,16 ± 0,84* 5,50 ± 0,55* 60 3,68 ± 0,54 6,42 ± 0,58* 5,46 ± 0,97* 90 3,52 ± 0,36 6,16 ± 0,88* 5,80 ± 0,51* Совместное введение морфина и атропина значительно увеличивало показатели ЛП относительно группы контроля, при этом различий с группой морфина выявлено не было. Влияние адъювантных препаратов на выраженность анальгетического эффекта морфина может быть обусловлено фармакодинамическим и фармакокинетическим взаимодействиями. Дофаминовые рецепторы расположены пост-синаптически и являются G-белок сопряженными, ингибируют аденилатциклазу, запуская при этом разветвленный пострецепторный каскад. Усиление анальгетического эффекта морфина галоперидолом может быть реализовано через ингибирование Ca2+/кальмодулин-зависимой протеинкина-зы II а (CaMKII а). Предполагается, что CaMKIIa вызывает десенсибилизацию щопиоидных рецепторов (щОР) в клетках, в нейронах ганглиев дорсальных корешков и в поверхностных пластинках дорсального рога спинного мозга [4], тем самым увеличивая показатели ЛП при моделировании соматогенной боли (тест отдергивания хвоста tail flick основан на спинальном флексорном рефлексе в ответ на воздействие теплового излучения). Метоклопрамид, как и галоперидол, является антагонистом D2 рецепторов и в низких дозах используется в качестве антиэметика. Место его действия ограничено триггерной зоной area postrema, поэтому в выраженности влияния на анальгетическую активность морфина мето-клопромид уступает галоперидолу. Морфин оказывает влияние на многие участки нервной системы, в том числе и на спинной мозг, где щОР расположены как пре-, так и пост-синаптически и участвуют в ноцицептивной передаче. Связь морфина с щОР вызывает опосредованное уменьшение открытия потенциалзависимых кальциевых каналов, гиперполяризацию и снижение возбудимости нейронов. Взаимодействие с адъювантными препаратами может быть реализовано не только на уровне пострецептор-ных каскадов (галоперидол, метоклопрамид и др.), но и связано с уровнем Са2+. Габапентин не свя-зы в ается ни с одним из известных рецепторов нейротрансмиттеров, но взаимодействует с а2-б-субъединицей потенциал-зависимых кальциевых каналов и снижает поток Ca2+, играющего важную роль в возникновении боли. Можно предположить, что увеличение анальгетической активности морфина при взаимодействии с габапенти-ном обусловлено сонаправленным влиянием на уровень внутриклеточного Ca2+ [5]. щОР относятся к семейству GPCR. Присутствие морфина во внеклеточном пространстве вблизи щОР может искажать структуру рецептора, создавая «карман», в который может проникнуть потенциально активная молекула [6]. Этим объясняется усиление анальгетического эффекта морфина при комбинировании его с некоторыми производными бензодиазепина. С другой стороны, в клинической практике зачастую наблюдается обратный эффект. Исследования K.V.S. Nemmani и J.S. Mogil (2003) [7] впервые предполагают, что диазепам ослабляет у- и к-опиоидную анальгезию посредством серотонинергических механизмов, в то время как антисеротонинергические агенты ослабляют у- и к-опиоидную анальгезию через (косвенные) ГАМКергические механизмы в ядре дорсального шва. Известно, что метаболизм морфина и мидазолама протекает с участием ферментов, относящихся к семейству глюкуронозил-трансфераз (UGT). Вероятнее всего, при их одновременном введении происходит увеличение периода полувыведения и, как следствие, уменьшение анальгетической активности морфина на фоне приема мидазолама протекает в меньшей степени, чем на фоне введения диазепама, который метаболизируется при участии системы цитохро-мов (CYP3A и CYP2C19). Альфа-2-адренорецепторы и щОР экспрессируются в одной популяции нейронов, также подтверждено наличие физической связи между ними. Их взаимодействие приводит к образованию гетеромерных комплексов с измененными функциональными и лигандсвязывающими свойствами. Это может объяснять анальгетический синергизм между морфином и полным агонистом а2-адренорецепторов клонидином [8]. Механизм морфиновой анальгезии на уровне спинного мозга (СМ) можно представить в виде цепи событий [9]: введение морфина ^ активация М2-, М4-холинергических рецепторов СМ ^ образование оксида азота в дорсальном роге СМ ^ анальгезия. Следовательно, в высоких дозах неселективный М-холиноблокатор атропин может значительно снижать анальгетический эффект морфина. В результате проведенного исследования атропин при совместном введении с морфином не оказывал влияния на показатели ЛП отдергивания хвоста, что может быть связано с выбранной низкой дозой холиноблокатора. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В результате исследования влияния адъювантных препаратов на анальгетические свойства морфина в субанальгетической дозе (1 мг/кг) выявлена неоднородность их эффектов. Блокаторы D2 рецепторов галоперидол (0,45 мг/кг) и метоклопрамид (5 мг/кг) проявляют синергизм с антиноцицептивным эффектом морфина. Противоэпилептический препарат габапен-тин (90 мг/кг) усиливает анальгетический эффект морфина. Агонист бензодиазепиновых рецепторов диазепам (1 мг/кг) блокирует обезболивающие свойства морфина, в то время как мидазолам (0,3 мг/кг) не влияет на его антиноцицептивный эффект. Агонист а2-адренорецепторов клонидин (1 мг/кг) потенцирует анальгетические свойства опиоида. М-холиноблокатор атропин в выбранной дозе 2,7 мг/кг не влияет на анальгетические свойства морфина.

About the authors

Yu. V Semenova

FSBEI HE «Volgograd State Medical University» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Email: j_semenova_pharm@mail.ru

N. V Eliseeva

FSBEI HE «Volgograd State Medical University» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation

A. A Spasov

FSBEI HE «Volgograd State Medical University» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation

References

Supplementary files