EVALUATION OF HUMAN CORNEAL LENTICULE USING ELECTRON AND LASER SCANNING MICROSCOPY OBTAINED BY FEMTOSECOND LASER CORRECTION OF MYOPIA

Full Text

Фемтосекундная экстракция лентикулы через малый доступ является операцией выбора при коррекции близорукости и миопического астигматизма. Основными преимуществами данной технологии является высокий рефракционный результат и его стабильность, устойчивость и высокие характеристики опорных свойств роговицы [5, 7], что в целом зависит от состояния коллагеновых волокон, структуры кератоцитов, участвующих в синтезе и поддержании внеклеточного матрикса [6, 8, 9]. Для комфорта пациентов во время операции, для устранения дискомфорта используется местная анестезия, позволяющая эффективно справиться с поставленной задачей [4]. Исследования Nicolaus Luft лентикул, извлеченных в ходе проведения операции SMILE у человека, выявили снижение концентрации противовоспалительных цитокинов (IL-1 b, TNF а), наличие единичных измененных стромальных кератоцитов с TUNEL-положительным результатом, отражающих их апоптотическую гибель [1]. Однако полученные результаты не позволяют однозначно ответить на вопрос о механизмах послеоперационного заживления после операции SMILE и формирования предпосылок к регрессу рефракционного эффекта [2, 3]. В связи с этим выяснение особенностей альтерации стромы роговицы в ответ на фемтосекундную экстракцию роговичной лентикулы через малый разрез является весьма актуальным. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Оценить информативность ультраструктурных и иммуногистохимических исследований лентику-лы роговицы, полученной в ходе рефракционной операции SMILE. Исследования процессов заживления после SMILE, проведенные на модели кроликов, показали, что фемтосекундные операции сопровождаются умеренной экспрессией Ю-67 положительных клеток к фибронек-тину и антител к антигену СD11b, которые, с одной стороны, участвуют в создании временной матрицы для миграции эпителиальных клеток или кератоцитов в зону повреждения, а с другой - отражают степень воспалительной реакции и пролиферации [11, 10]. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Проведено исследование 6 лентикул роговицы, полученных в ходе плановых операций по коррекции зрения с помощью фемтосекундного лазера Visumax Carl Zeiss, Германия по технологии Смайл, основанной на формировании в строме роговицы линзы толщиной от 89 до 124 мкм, с роговичным клапаном от 100 до 130 мкм, диаметром оптической зоны 7 мм и размером роговичного доступа 2,38 мм. Лазерный этап операции проводился с использованием режима Fast (энергия 180 nJ, точечный интервал 4,5 цт), механическое разделение ткани проводилось с помощью шпателя Geuder AG, Германия, удаление лентикулы - с помощью одноразового зубчатого пинцета, 23 G DORC, Нидерланды. Степень исходной миопии варьировала от 4,0 до 6,0 дптр. Все операции выполнены одним хирургом. Для оценки микроструктуры и биохимических изменений тканей использовалась сканирующая, просвечивающаяся, лазерная конфокальная микроскопия с оценкой актина, нейтральных липидов и ядер клеток. Для просвечивающей микроскопии лентикулы из роговицы глаза фиксировали в 2,5%-м растворе глутаро-вого альдегида (Sigma-Aldrich, USA) на 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,4) (1 ч), промывали тем же буфером (3 раза по 10 мин), 12 часов дофиксировали 2%-м раствором четырехокиси осмия (Sigma-Aldrich, USA) и заливали в эпоксидную смолу. После полимеризации на ультрамикротоме Ultracut R (Leica) изготавливали ультратонкие срезы (70-80 нм), которые исследовали с помощью просвечивающего электронного микроскопа Leo 906 E (Zeiss, Германия). Для изучения поверхностных структур лентикулы фиксировали по вышеописанной методике и обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации (30, 50, 70, 96, 100 %). После обезвоживания материал исследовали в сканирующем электронном микроскопе Quanta 200 (FEI Company). Рис. 1. Лентикула, выделенная из роговицы по данным сканирующей электронной микроскопии Для лазерной конфокальной микроскопии лен-тикулы отмывали в среде 199 и фиксировали 15 мин в 4%-м параформальдегиде (Sigma-Aldrich, USA). Для визуализации актиновых микрофиламентов материал после фиксации пермеабилизовали 20 мин в 1%-м растворе Тритона Х100 (Sigma-Aldrich, USA) и обрабатывали фаллоидином-FITC (ex/em 490/525 nm) 40 мин. Для выявления ядер клеток материал окрашивали DAPI (Sigma-Aldrich, USA, ex/em 340/488 nm), 0,5 мкг/мл в течение 15 мин. Все изображения, полученные с помощью LSM 710 (Zeiss), обрабатывали с помощью двух программ: ZEN 2010 (Zeiss) и Imaris® Bitplane 7.2.3. Всю полученную по каждому из выделенных фрагментов информацию суммировали и обрабатывали методами непараметрической статистики, применяя пакет программ Statistica 10 и Microsoft Excel 2010. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Лентикула, выделенная из роговицы человека, имеет размеры 5 х 3,5 мм (рис. 1). По данным просвечивающей электронной микроскопии основная масса межклеточного матрикса стромы лентикулы представлена разнонаправленно ориентированными слоями волокон коллагена. В некоторых участках стромы такие нити формировали более плотные скопления, которые располагались в непосредственной близости с клеточными элементами либо в свободном межклеточном пространстве лентикулы (рис. 2). Характерно, что, по данным конфокальной микроскопии, окраска препаратов фаллоидином, меченным FITC, дает положительную реакцию на актино-вые микрофиламенты во внеклеточном пространстве. к к к Рис. 2. Участки плотно расположенных сетей (показаны стрелками) мелкоструктурированных филаментов внеклеточного матрикса в строме лентикулы Это говорит о том, что в матриксе стромы лентикулы могут присутствовать области, содержащие кластеры F-актина - биополимера, характерного преимущественно для внутриклеточной среды (рис. 3). 130 AV 120 110 100 -V 90 80 * 70 Y [urn] 60 50 40 30 V 20 10 02 fuml ОС ) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 X [urn] Рис. 3. Оптический срез стромы лентикулы с ядрами (DAPI, синий) кератоцитов и актиновыми микрофиламентами (фаллоидин-FITC, зеленый), которые отмечены стрелками. Лазерная конфокальная микроскопия В толще стромы среди пучков коллагена выявляются также отдельные, расположенные вдоль плоскости лентикулы кератоциты. Основную часть этих клеток занимает крупное, вытянутое вдоль клетки ядро с неровными краями. К внутренней стороне ядерной мембраны плотным слоем примыкает фибриллярная сеть ядерной ламины. В матриксе ядра среди глыбок хроматина выявляется хорошо выраженное ядрышко. Такая структура ядерного вещества обычно не свойственна для жизнеспособных кератоцитов в норме и может быть связана с коагуляцией белков, вызванной локальным воздействием лазера в процессе формирования лентикулы. В цитоплазме отчетливо выявляются компоненты цитоскелета, детальный состав которого возможно определить только с помощью подробного иммуно-цитохимического анализа (рис. 4). Селективная окраска клеток фаллоидином-FITC (см. рис. 3) показывает, что одним из распространенных компонентов цитоскелета кератоцитов являются актиновые микрофиламенты. Рис. 4. Нити цитоскелета в цитоплазме кератоцита отмечены стрелкой Судя по данным трансмиссионной микроскопии, среди нативных кератоцитов выявляются также клетки, которые по морфологическим признакам соответствуют клеткам в состоянии апоптоза, или аутофагии. Сканирующая электронная микроскопия вогнутых и выпуклых фрагментов лентикул показала, что их поверхность имеет выраженный рельеф в той или иной степени упорядоченной ребристой структуры (рис. 5). Возможно, что данный рельеф отражает направленность нитей коллагена в слоях матрикса, составляющих строму лентикулы, что согласуется с данными, полученными с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Рис. 5. Ультраструктура вогнутой поверхности лентикулы. Сканирующая электронная микроскопия Биологические механизмы, лежащие в основе повреждения и заживления ран роговицы, в том числе и после рефракционных операций, являются ключевым фактором, определяющим течение послеоперационного периода, рефракционный эффект и остроту зрения пациентов. Проведенные исследования позволили выявить на поверхности лентикулы многочисленные игольчатые структуры, которые, судя по их размерам и локализации, представляют собой механически разорванные коллагеновые микрофибриллы и волокна, которые осуществляли интрастромальные связи между параллельными коллагеновыми пластинами. Прямое локальное воздействие фемтосекундного лазера сопровождается патологическими изменениями некоторых кератоцитов, при исследовании которых установлены признаки обратимых и необратимых дегенеративных изменений. Кроме того, было показано, что в лентикуле присутствуют кератоциты, содержащие Ф-актин в цитоплазме. Этот факт имеет двойное значение. Прежде всего, он свидетельствует о способности кератоцитов продуцировать Ф-актин и, вероятно, секретировать его в межклеточное пространство, принимая участие в регуляции актин-опосредуемого апоптоза. Кроме того, накопление Ф-актина в цитоплазме кератоцитов указывает на дифференцировку этих клеток в миофибробласты. Известно, что керато-циты в разреженной среде начинают превращаться в так называемый «ремонтный фенотип» и в миофибробласты, активно секретирующие элементы внеклеточного матрикса. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, операция, проведенная по технологии SMILE, основанная на фемтосекундной фотоде-струкциии с последующим механическим разделением ткани роговицы, характеризуется минимальным повреждением коллагеновых волокон, активацией и дегенеративными изменениями кератоцитов. Все выявленные изменения клеток и внеклеточного матрикса наблюдаются только вдоль передней и задней поверхности лентикулы.

About the authors

O. V Pisarevskaya

Irkutsk Branch of S.N. Fyodorov Eye Microsurgery Federal State Institution, Ministry of health of the Russian Federation

Email: lesya_pisarevsk@mail.ru

N. P Sudakov

Limnological Institute, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences

A. P Lopatin

Limnological Institute, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences

References

Supplementary files