THE EFFECTS OF TIBIA FRACTU RE ON NANOSTRUCTURE OF BONE MINERAL OF THE HIPBONE IN DIABETIC JUVENILE RATS

Full Text

Глобальная распространенность сахарного диабета (СД) оценивалась в 2,8 % в 2000 г. и, по прогнозам, вырастет до 4,4 % в 2030 г. [1]. Заболеваемость и смертность, связанные с этим заболеванием, ложатся огромным бременем на сектор здравоохранения. СД I типа характеризуется аутоиммунным разрушением панкреатических р-клеток с наличием Т-клеточной реактивности к инсулярным антигенам [2]. При СД II типа основную причинную роль играют генетические факторы и факторы окружающей среды. Существует еще одна подгруппа взрослых пациентов, которые изначально были отнесены к фенотипу СД типа II, но имели положительные аутоантитела к р-клеткам [3]. Эти пациенты составляют 2-12 % всех случаев диабета, и для их описания был использован термин «латентный аутоиммунный диабет © Лузин В.И., Торба А.В., 2021 взрослых» (LADA) [4]. LADA обычно диагностируется после 35 лет и его часто ошибочно диагностируют как СД II типа, но в конечном итоге пациенты становятся инсулинозависимыми быстрее. При всех типах СД развиваются весьма серьезные осложнения, одним из которых является остеопороз, приводящий к значительному увеличению риска переломов [5]. Если при СД I и II типа состояние костной системы с позиций морфологии описано достаточно полно, то при LADA структурно-функциональное состояние скелета практически не изучено. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Установить динамику изменения наноструктуры биологического минерала тазовой кости (БМТК) у ювенильных крыс со стрептозотоцин-индуцированным диабетом (СИД) после хирургической перфорации большеберцовых костей (ХПБК). МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ В исследовании было задействовано 140 ювенильных белых крыс, массой при вступлении в эксперимент 135-150 г в возрасте 3 месяцев, находящихся на содержании в виварии «Луганского государственного медицинского университета имени Святителя Луки». Животных содержали в условиях 12-часового дневного освещения при температуре 20-22 °С и влажности 60-80 %, и обеспечивали свободный доступ к пище и воде в течение 7 дней перед экспериментом. Крыс случайным образом разделили на четыре группы. Сахарный диабет индуцировали однократным внутри-брюшинным введением стрептозотоцина (Sigma-Aidrich, США) в дозе 55 мг/кг, растворенного в 0,1 М цитратном буфере с рН = 4,5 перед манипуляцией, и дозировали из расчета 2 мл/кг (35 крыс, ЮСИД -группа). Через трое суток после инъекции диабети-ческий статус каждого животного подтверждался путем измерения уровней глюкозы в крови из хвостовой вены, взятой через шесть часов после приема пищи. Уровень глюкозы анализировали с помощью глюкозооксидазного метода [6], используя стандартные наборы реактивов CORMAY LDL DIRECT (Польша), и выражали в ммоль/л сыворотки крови. В исследование в дальнейшем были вклю-чены только крысы с уровнем глюкозы в крови £12 ммоль/л. ХПБК диаметром 2,0 мм при эфирной анестезии производили в проксимальном метадиа-физе большеберцовых костей (35 крыс, ЮХПБК-группа) [7]. JOURNAL ОГ VOLGOGRAD STATE MEDICAL UNIVERSITY Части животных (35 крыс, ЮСИД-ХПБК-группа) перфорацию большеберцовых костей производили после индуцирования сахарного диабета. Контролем служили интактные животные (35 крыс, ЮК-группа). Точкой отсчета начала эксперимента считали время введения стрептозотоцина, либо ему соответствующее. Все дифрактограммы были получены с помощью дифрактометра ДР0Н-2,0 и гониометрической приставки ГУР-5 с использованием Cu Ka излучения (Л = 0,1542 нМ), никелевого Kp-фильтра, с напряжением и силой тока на рентгеновской трубке 30 кВ и 10 мА. Образцы сканировали непрерывно при скорости 0,05°2©/60 секунд в диапазоне углов дифракции 3-37° [8]. С учетом межплоскостных расстояний рефлексов L002 и L202 вычисляли размеры элементарных ячеек биологического минерала тазовых костей, затем, используя уравнение Селякова - Шерера, вычисляли размеры кристаллитов, используя полуширину дифракционного пика, соответствующего рефлексу L112. Коэффициент микротекстурирования как параметр, характеризующий однородность ориентации кристаллитов в кристаллической решетке, вычисляли как отношение высоты дифракционных пиков L002/L202. Для каждой группы рассчитывались среднее значение и стандартные ошибки, для сравнения между группами использовался двусторонний Т-критерий Стьюдента при уровне значимости P < 0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В ЮК-группе в период с 7 по 90 сутки наблюдения размеры элементарных ячеек БМТК вдоль осей я и с увеличились с (9,378 ± 0,004) до (9,385 ± 0,002) 10-10 М и с (6,842 ± 0,003) до (6,849 ± 0,004) 10-10 М соответственно (табл.). Соотношение размеров элементарных ячеек с/а с увеличением сроков наблюдения практически не изменялось и колебалось в пределах 72,96-72,97 у.е., что свидетельствует о наличии равновесия между процессами кристаллизации и резорбции в БМТК. Рост размеров элементарных ячеек БМТК находил отражение в увеличении размеров кристаллитов - в период наблюдения они увеличились с (42,29 ± 0,37) до (44,33 ± 0,34) нМ, что свидетельствует об интенсивном их росте. При этом кристаллическая решетка БМТК у животных ЮК-группы в ходе наблюдения упорядочивалась, о чем свидетельствует увеличение коэффициента микротекстурирования с (0,3875 ± 0,0049) до (0,4091 ± 0,0046) у.е. ВЕСТНИК = ВОЛГОГРАДСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО МЕДИЦИНСКОГО УНИВЕРСИТЕТА Результаты рентгеноструктурного исследования биоминерала тазовой кости ювенильных белых крыс в зависимости от вида воздействия и длительности эксперимента (X + Sx) Группа Сроки, сут. Размер элемент. ячейки вдоль оси с, 10-10 М Размер элемент. ячейки вдоль оси а, 10-10 М Размер кристаллитов, нМ Коэффициент микротекстурирования, у.е. ЮК 7 9,378 ± 0,004 6,842 ± 0,003 42,29 ± 0,37 0,3875 ± 0,0049 15 9,381 ± 0,002 6,844 ± 0,003 42,84 ± 0,37 0,3910 ± 0,0035 30 9,380 ± 0,002 6,845 ± 0,002 43,19 ± 0,45 0,3973 ± 0,0032 60 9,384 ± 0,003 6,847 ± 0,002 44,00 ± 0,41 0,4052 ± 0,0051 90 9,385 ± 0,002 6,849 ± 0,004 44,33 ± 0,34 0,4091 ± 0,0046 ЮХПБК 7 9,388 ± 0,004 6,850 ± 0,003 44,71 ± 0,43“ 0,3731 ± 0,0035“ 15 9,394 ± 0,003“ 6,856 ± 0,003“ 46,17 ± 0,42“ 0,3416 ± 0,0042“ 30 9,402 ± 0,003“ 6,862 ± 0,002“ 46,86 ± 0,40“ 0,3405 ± 0,0037“ 60 9,392 ± 0,002“ 6,854 ± 0,003 46,51 ± 0,40“ 0,3741 ± 0,0042“ 90 9,390 ± 0,003 6,855 ± 0,003 46,52 ± 0,37“ 0,4027 ± 0,0043 ЮСИД 7 9,391 ± 0,003“ 6,848 ± 0,003 44,35 ± 0,42“ 0,3770 ± 0,0037 15 9,396 ± 0,003“ 6,854 ± 0,003“ 45,27 ± 0,43“ 0,3587 ± 0,0045“ 30 9,398 ± 0,003“ 6,859 ± 0,003* 46,27 ± 0,39 0,3547 ± 0,0040“ 60 9,401 ± 0,004“ 6,862 ± 0,003“ 46,90 ± 0,43“ 0,3670 ± 0,0049“ 90 9,405 ± 0,003“ 6,865 ± 0,003“ 47,79 ± 0,41“ 0,3750 ± 0,0033“ ЮСИД-ХПБК 7 9,391 ± 0,002“ 6,849 ± 0,004 44,83 ± 0,41“ 0,3729 ± 0,0043“ 15 9,383 ± 0,004л 6,859 ± 0,002“ 46,45 ± 0,39“ 0,3407 ± 0,0043“ 30 9,403 ± 0,003“ 6,864 ± 0,003“ 47,00 ± 0,42“ 0,3364 ± 0,0035“ 60 9,405 ± 0,004“л 6,865 ± 0,003“Л 47,07 ± 0,43“ 0,3530 ± 0,0046“л 90 9,406 ± 0,003“л 6,867 ± 0,003“л 48,27 ± 0,45“Л 0,3796 ± 0,0042“л “Статистически значимое отличие от ЮК-группы (р < 0,05); "статистически значимое отличие от ЮХПБК-группы (р < 0,05). В БМТК животных с ХПБК размеры элементарных ячеек вдоль оси а с 7-х по 30-е сутки превышали значения ЮК-группы на 0,14; 0,23 и 0,09 %, а размеры вдоль оси с к 7-м и 15-м суткам - на 0,18 и 0,25 %. В результате, размеры кристаллитов с 7-х по 90-е сутки превышали параметры ЮК-группы на 5,73; 7,77; 8,48; 5,72 и 4,95 %, что отражалось в снижении упорядоченности кристаллической решетки: коэффициент микротекстурирования с 7-х по 60-е сутки был понижен на 3,73; 12,64; 14,30 и 7,68 %. Из этого следует, что наноструктура БМТК у животных ЮХПБК-группы характеризуется дестабилизацией и снижением упорядоченности кристаллической решетки с наибольшими проявлениями к 30-м суткам после операции и постепенным последующим восстановлением. Это есть отражение реакции организма на ХПБК с задействованием иммунных и метаболических механизмов, направленной на обеспечение процессов остеорепарации. Одним из компонентов данной реакции является и развитие окислительного стресса, приводящего в итоге к увеличению активности резорб-тивных процессов и разрушению БМТК [9]. У животных ЮСИД-группы размеры элементарных ячеек БМТК вдоль оси а превосходили значения ЮК-группы с 7-х по 90-е сутки наблюдения на 0,14; 0,16; 0,20 и 0,21 %, а размеры элементарных ячеек вдоль оси с - с 15-х по 90-е сутки на 0,15; 0,21; 0,22; 0,24 %. Дестабилизация элементарных ячеек БМТК у крыс ЮСИД-группы находила отражение в нарушении процессов кристаллизации: размеры кристаллитов превышали значения ЮК-группы с 7-х по 90-е сутки эксперимента на 4,86; 5,68; 7,12; 6,59 и 7,80 % соответственно. В результате нарушалась и упорядоченность кристаллической решетки БМКТ - коэффициент микро-те кстурирования понижался и был меньше значений ЮК-группы с 15-х по 90-е сутки эксперимента на 8,26; 10,72; 9,42 и 8,34 %. При СИД наноструктура БМТК у животных ЮХПБК-группы также характеризуется дестабилизацией и снижением упорядоченности кристаллической решетки, нарастающими с увеличением длительности эксперимента. Доказано, что при СИД из-за гипергликемии и повышенного уровня окислительного стресса повышается уровень конечных продуктов гликирования (КПГл) [1]. КПГл ингибируют дифференцировку остеобластов, что отражается в снижении экспрессии щелочного фосфата и коллагена 1а1 и ингибировании образования минерализованного матрикса [3]. Кроме того, КПГл индуцируют апоптоз остеобластов, уменьшая количество остеобластов и нарушая костеобразование [5]. В результате нарушается образование минерального матрикса, что находит отражение в нарушении наноструктуры БМТК. При ХПБК у ювенильных крыс с СИД изменения наноструктуры БМТК прогрессировали и к 60-м и 90-м суткам после операции размеры элементарных ячеек вдоль осей а и с превышали значения группы с ХПБК на 0,14 и 0,17 % и на 0,17 и 0,18 % соответственно. Также, размеры кристаллитов к 90-м суткам были больше значений ХПБК-группы на 3,75 %, а коэффициент микротекстурирования к 60-м и 90-м суткам -меньше на 5,65 и 5,73 %. Перфорация большеберцовых костей у крыс со стрептозотоциновым диабетом приводит к усугублению нарушений наноструктуры биоминерала тазовых костей с 60-х суток после операции; к 90-м суткам размеры кристаллитов превышают показатели группы ХПБК на 3,75 %, а коэффициент микротекстурирования снижается на 5,73 %. Сочетание ХПБК и СИД приводило к усугублению нарушений наноструктуры БМТК с 60-х суток после операции, а к 90-м суткам эксперимента изменения нарастали. Следует полагать, что при сочетании ХПБК и СИД прогрессирует нарастание уровней КПГл и окислительного стресса, что приводит к более грубым повреждениям в скелете и дестабилизации кристаллической решетки БМТК. ЗАКЛЮЧЕНИЕ У ювенильных белых крыс ХПБК сопровождается дестабилизацией и снижением упорядоченности кристаллической решетки с наибольшими проявлениями к 30-м суткам после операции и постепенным последующим восстановлением. СИД у ювенильных белых крыс сопровождается дестабилизацией и снижением упорядоченности кристаллической решетки с 7-х суток, нарастающими с увеличением длительности эксперимента. Сочетание ХПБК и СИД у ювенильных животных приводит к усугублению нарушений наноструктуры БМТК с 60-х суток после операции, к 90-м суткам эксперимента изменения нарастают.

About the authors

V. I Luzin

Lugansk State Medical University named after St. Luke

Email: vladyslav_luzin@mail.ru

A. V Torba

Lugansk State Medical University named after St. Luke

Email: alexandr_v_torba@mail.ru

References

Supplementary files