Effect of aminalon and picamilon on NLRP3 inflammasome activation in pancreatic cells during alloxan-induced diabetes mellitus

Full Text

Инфламмасома NLRP3 (NOD-, LRR- and pyrin domain-containing protein 3), или криопирин, – цитоплазматический мультибелковый комплекс, который расщепляет и активирует про-каспазу-1, что приводит к секреции ключевых провоспалительных цитокинов IL-1β и IL-18 [1, 2]. Выдвинуто предположение, что активация NLRP3 является критическим триггером функционального нарушения и повреждения β-клеток поджелудочной железы (ПЖ) при сахарном диабете (СД) 2-го типа. Устойчивая гипергликемия индуцирует образование активных форм кислорода в островках поджелудочной железы, что приводит к увеличению синтеза тиоредоксин-взаимодействующего белка (TXNIP), который, в свою очередь, активирует инфламмасомы NLRP3. Кроме того, высокое содержание глюкозы в крови может привести к повышению экспрессии островкового амилоидного пептида (IAPP)/амилина в макрофагах, который является вторым стимулом активации воспаления NLRP3 посредством инициирования взаимодействия NLRP3 с апоптоз-ассоциированным белком, содержащим домен для рекрутирования каспазы (ASC) [3].

Во многих отечественных и зарубежных работах показано, что ГАМК подавляет иммунные и воспалительные реакции, ингибирует пролиферацию Т-клеток [4], ингибирует активацию транскрипционного фактора NF-κB, который отвечает за продукции провоспалительных цитокинов [5] и инфламмасомы NLRP3 [4, 6]. Однако влияние ГАМК на активность инфламмасомы при сахарном диабете не изучалось.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Сравнительное изучение влияние коммерческих ГАМК-ергических препаратов (аминалон и пикамилон) на раннюю модуляцию активности инфламассомы NLRP3 при экспериментальном аллоксан-индуцированном сахарном диабете у лабораторных крыс.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Дизайн эксперимента. Исследование выполняли на 24 (4 группы по 6 животных в каждой) белых половозрелых крысах-самцах линии Вистар массой 250–300 г. Работа была одобрена локальным этическим комитетом ВолгГМУ, протокол № 2022/116 от 04.03.2022 г. При проведении эксперимента соблюдали международные рекомендации Европейской конвенции по защите позвоночных животных. Повреждение ПЖ у крыс моделировали путем однократного внутрибрюшинного введения аллоксана (Sigma) в дозе 130 мг/кг. Аллоксан (5,5-дигидроксил пиримидин-2,4,6-трион) является производным мочевины и аналогом глюкозы, который широко используется в качестве диабетогенного препарата в фармакологических исследованиях [7]. Были протестированы два препарата с ГАМК-ергическим действием: аминалон (гамма-аминомасляная кислота, «Органика») и пикамилон (никотиноил-гамма-аминомасляная кислота, «Фармстандарт-УфаВИТА»). Таблетки измельчали в дистиллированной воде и в виде взвеси перорально вводили животным в дозе 500 мг/кг (аминалон) и 250 мг/кг (пикамилон) на протяжении 5 суток до введения аллоксана и далее в течение 2 суток, после чего оценивали уровень гликемии после 4-часового голодания с использованием глюкометра Countur TS (Германия). Изучаемые препараты и дозы выбраны на основании данных литературы и по результатам собственных предварительных исследований. В качестве негативного контроля служили крысы, которым до (5 суток) и после (2 суток) введения аллоксана вводили физиологический раствор, а интактным контролем выступали крысы, которым проделывали все манипуляции с использованием изотонического раствора.

Иммуногистохимическое исследование. По окон- чании эксперимента (через 2 суток после введения аллоксана) крыс декапитировали под хлоралгидратным наркозом (800 мг/кг, в/бр.). Для иммуногистохимического (ИГХ) исследования образцы тканей поджелудочной железы фиксировали в 10%-м нейтральном формалине. Затем образцы обезвоживали в батарее спиртов восходящей крепости, просветляли в хлороформе и заключали в парафиновую среду Histomix (Биовитрум, Россия). Парафиновые блоки резали на ротационном микротоме HM340E (MICROM, Германия), получали срезы толщиной 4 мкм и монтировали их на предметные стекла, обработанные поли-L-лизином (Menzel, Германия). При выполнении ИГХ исследования парафиновые срезы после депарафинизации и регидратации инкубировали 20 мин в 3%-й перекиси водорода для блокирования эндогенной пероксидазы. Постановку иммуногистохимических реакций проводили с помощью пероксидаза-полимерной системы визуализации N-Histofine MAX PRO (Nichirei, Япония) согласно инструкции производителя. Демаскировку антител осуществляли путем кипячения срезов при 100 ºС в 0,01 М цитратном буфере с рН = 6,0 в течение 20 мин. Срезы поджелудочной железы инкубировали с первичными антителами к NLRP3 (кроличьи, поликлональные, Abcam, Великобритания) при комнатной температуре в течение 1 ч. Пероксидазу проявляли 3-3-диаминобензидином из набора протокола. На заключительном этапе реакции срезы докрашивали гематоксилином Майера.

Морфометрия. Микропрепараты изучали и фотографировали с помощью микроскопа AxioScope.A1 (ZEISS, Германия), оборудованного цифровой камерой AxioCam MRc5 A1 (ZEISS, Германия). Площадь, занимаемая иммунопозитивными экзокринными панкреатоцитами, оценивалась на 5 рандомизированных микрофотографиях образцов поджелудочной железы (ув. ×200) и рассчитывалась в % относительно общей оцениваемой площади среза с помощью программного обеспечения ZENpro 2012 (ZEISS, Германия).

Статистический анализ. Полученные данные обрабатывали с использованием пакетов программ Statistica 7.0 (StatSoft, США). Характер распределения полученных данных определяли по критерию Шапиро – Уилка. В связи с наличием нормального распределения данных межгрупповые различия выявляли с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Апостериорные попарные сравнения выполняли с использованием t-критерия Стьюдента для независимых выборок c поправкой Бонферрони (Bonferroni). Обобщенные данные представляли в виде среднего арифметического значения (М) и стандартного отклонения (SD). Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение экзокринной части ПЖ контрольных интактных животных с помощью ИГХ показало, что клетки, меченные антителами к NLRP3, составляли менее 5 % от их общего количества (табл. 1). В то же время в островках ПЖ положительная реакция на NLRP3 в виде нежной мелкодисперсной зернистости выявлялась в цитоплазме практически всех эндокринных клеток (рис. А).

В поджелудочной железе крыс из группы негативного контроля, которым до и после введения аллоксана вводили физиологический раствор, отмечали резкое увеличение площади панкреатоцитов (до 75 %), дающих положительную реакцию на инфламмасому NLRP3. При этом в части клеток, составляющих панкреатические ацинусы, иммунопозитивный материал выявлялся в виде крупных гранул, локализованных под мембранным пространством цитоплазмы. В единичных сохранившихся островках Лангерганса после аллоксан-индуцированного СД отмечали незначительное увеличение содержание NLRP3 по сравнению с контрольными животными (рис. Б).

 

Рис. Иммунолокализация NLRP3 в поджелудочной железе (Антитела к NLRP3. Пероксидазно-антипероксидазный-метод. Ядра окрашены гематоксилином Майера. Ув. ×400): А – интактной крысы; Б – опытной крысы с индуцированным СД; В – опытной крысы, получавшей аминалон до и после индуцированного СД; Г – опытной крысы, получавшей пикамилон до и после индуцированного СД

 

Профилактическое введение подопытным крысам аминалона в течение 5 суток до острого аллоксан-индуцированного СД с последующей пролонгацией еще 2 суток эффективно подавляло активность NLRP3, на что указывало значимое снижение общей площади иммунопозитивных панкреоцитов до 21 % по сравнению с показателем в группе животных, которым терапию не проводили (табл. 1, рис. В). В инсулоцитах сохранившихся островков экспрессия NLRP3, определяемая иммуногистохимическим методом, отсутствовала. Однако обращало на себя внимание присутствие в эндокринных островках клеток с положительной реакцией на NLRP3, фенотипические признаки которых соответствовали плазматическим клеткам (рис. В).

У животных, которым профилактически вводили пикамилон за 5 суток до введения панкреотоксина и в течение 2 суток после его инъекции, регистрировали значимое снижение активности NLRP3: площадь иммунопозитивных панкреатоцитов составляла не более 40 %. При этом большая часть NLRP3+ клеток имела очаговый характер пространственного распределения в экзокринной части ПЖ. В островках ПЖ иммунопозитивный материал обнаруживался не только в цитоплазме эндокриноцитов, но и в цитоплазме плазматических клеток (табл. 1, рис. Г).

Анализ гликемического статуса у экспериментальных крыс показал, что уровень глюкозы в группах животных, получавших аминалон и пикамилон, был незначительно ниже, чем в группе с аллоксан-индуцированным сахарном диабетом (табл. 2).

 

Таблица 1. Площадь NLRP3+ клеток в экзокринной части поджелудочной железы (М ± SD), %%

Группа животных
Контроль (n = 30)	СД + физраствор (n = 30)	СД + аминалон (n = 30)	СД + пикамилон (n = 30)
4,10 ± 0,79	75,19 ± 7,69*	21,30 ± 5,44*#	39,31 ± 5,24*#

 

Статистически значимые различия (p ≤ 0,05) по сравнению с *интактным контролем, #группой животных с аллоксан-индуцированным сахарным диабетом, получавших физиологический раствор.

Примечание: n – количество исследуемых полей зрения препаратов поджелудочной железы.

 

Таблица 2. Уровень глюкозы в крови подопытных животных (М ± SD), ммоль/л

Группа животных
Контроль (n = 6)	СД + физраствор (n = 6)	СД + аминалон (n = 6)	СД + пикамилон (n = 6)
4,4 ± 0,6	32,2 ± 1,9*	29,1 ± 3,4*	27,8 ± 4,5*

Статистически значимые различия (p ≤ 0,05) по сравнению с *интактным контролем.

 

Аллоксан как панкреотоксический фактор является клеточным стрессором, нарушающим гомеостаз, запускающим процессы гибели клеток. В эти патологические процессы вовлекаются инфламмасомы. Эти мультибелковые гетеромерные комплексы, вследствие активации каспазы 1, провоспалительных интерлейкинов в значительной степени влияют на развитие процессов, приводящих к апоптозу клеток [2].

Некоторые исследователи при изучении антидиабетического потенциала ГАМК отмечали дефицит аминокислоты в панкреатических островках на фоне уменьшения массы β-клеток [6], что обосновывает целесообразность применения производных ГАМК для профилактики гибели β-клеток вследствие подавления активности инфламассомы NLRP3 и продукции провоспалительных цитокинов. Наше исследование косвенным образом подтверждает эти данные, демонстрируя, с одной стороны, увеличение содержания иммунореактивного материала в экзокриноцитах ПЖ к антителам против NLRP3 при моделировании аллоксанового СД, а с другой – ингибирование воспалительной инфламассомы при применении ГАМК-ергических препаратов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что препараты с ГАМК-ергическим действием – аминалон и пикамилон, при введении в течение 5 суток до инъекции аллоксана и в течение 2 суток после его введения значительно подавляли активацию инфламассомы NLRP3 в панкреатоцитах, тем самым способствуя сохранению функций поджелудочной железы.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ № 21-15-00192 от 19.04.2021 г.

Funding. The work was carried out with the financial support of the RGNF grant No. 21-15-00192 dated 04/19/2021.

About the authors

Ivan N. Tyurenkov

Volgograd State Medical University

Email: fibfuv@mail.ru

Сorresponding member of the Russian Academy of Sciences, Doctor of Medical Sciences, Professor, Head of the Department of Pharmacology and Pharmacy of Institute of Continuing Medical and Pharmacological Education

Russian Federation, Volgograd

Yuliya I. Velikorodnaya

Volgograd State Medical University; Volgograd Medical Scientific Center

Author for correspondence.
Email: alta-u@mail.ru

Junior Researcher of Laboratory of Toxicology, Research Center for Innovative Medicines, Volgograd State Medical University; Researcher of Laboratory of Pathomorphology, Volgograd Medical Research Center, Postgraduate Student of Department of Pharmacology and Pharmacy, Institute of Continuing Medical and Pharmacological Education, Volgograd State Medical University

Russian Federation, Volgograd; Volgograd

Dmitry A. Bakulin

Volgograd State Medical University

Email: mbfdoc@gmail.com

Candidate of Medical Sciences, Associate Professor of the Department of Clinical Pharmacology and Intensive Care Medicine, Volgograd State Medical University; Senior Researcher of Laboratory of Pharmacology of Cardiovascular Drugs, Research Center for Innovative Medicines, Volgograd State Medical University

Russian Federation, Volgograd

Alexey V. Smirnov

Volgograd State Medical University; Volgograd Medical Scientific Center

Email: alexeysmirnov.volggmu@gmail.com

Doctor of Medical Sciences, Professor, Head of the Department of Pathological Anatomy, Volgograd State Medical University; Head of the Laboratory of Pathomorphology, Volgograd Medical Research Center

Russian Federation, Volgograd; Volgograd

References

Supplementary files