Influence of local administration of autologous platelet-rich plasma on the level of expression of matrix metalloproteinases in experimental tendinopathy

Dmitry A. Malanin; Маланин Дмитрий Александрович; Ilya G. Laskov; Ласков Илья Геннадьевич; Maria R. Ekova; Экова Мария Рафаэловна; Lyudmila N. Rogova; Рогова Людмила Николаевна; Natalia V. Grigorieva; Григорьева Наталья Владимировна; Victoria N. Povetkina; Поветкина Виктория Николаевна; Maxim V. Demeshchenko; Владимирович Демещенко Максим Владимирович; Anastasia V. Voronina; Воронина Анастасия Владимировна

doi:10.19163/1994-9480-2023-20-3-118-124

Influence of local administration of autologous platelet-rich plasma on the level of expression of matrix metalloproteinases in experimental tendinopathy

Authors: Malanin D.A.¹, Laskov I.G.¹, Ekova M.R.¹, Rogova L.N.¹, Grigorieva N.V.¹, Povetkina V.N.¹, Demeshchenko M.V.¹, Voronina A.V.¹
Affiliations:
1. Volgograd State Medical University
Issue: Vol 20, No 3 (2023)
Pages: 118-124
Section: Original Researches
URL: https://journals.eco-vector.com/1994-9480/article/view/611028
DOI: https://doi.org/10.19163/1994-9480-2023-20-3-118-124
ID: 611028

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Purpose: To evaluate the expression of matrix metalloproteinases in the calcaneal tendon tissue under conditions of experimental tendinopathy and under the influence of local administration of autologous platelet-rich plasma.

Material and methods: The study was conducted on 20 mature Wistar rats divided into 5 groups. In all groups, experimental modeling of tendinopathy of the calcaneal tendon was performed by intra- and near-tendon injection of 0.5 ml of a 10 % suspension of sterile talc. Further, autologous platelet-rich plasma (PRP), hyaluronic acid preparation Rusvisk (Russia) or their sequential combination was injected into the area of tendinopathy. The results of the study were evaluated after 10 weeks; autopsy preparations prepared for immunohistochemical analysis were studied using light microscopy and morphometry.

Results: Histological signs characteristic of tendinopathy were identified: disorganization of collagen structures, mucoid and lipoid degeneration, neovascularization, lymphoid-histiocytic infiltration. Injection of PRP into the area of simulated tendinopathy, hyaluronic acid, or their sequential combination led to changes in the immunohistochemical pattern of the tissue. As a result, there was a decrease in the expression of immunoreactive material in the cytoplasm of tenocytes and cells of the inflammatory infiltrate, compared with the picture observed in micropreparations in animals with tendinopathy, which were not subjected to any manipulations.

Conclusion: The introduction of PRP into the area of the calcaneal tendon under conditions of experimental tendinopathy reduces the level of expression of matrix metalloproteinases and, thereby, preserves the structure of the tendon tissue, demonstrating tendoprotective properties.

Keywords

tendinopathy, tendinitis, tendinosis, hyaluronic acid, platelet-rich plasma

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Термин «тендинопатия» описывает широкий спектр патологических изменений в сухожилиях, приводящих к боли и нарушению их функции. Этиология возникновения тендинопатии остается неясной, однако существует ряд факторов, вовлеченных в механизм развития данного заболевания. К ним относят гипоксию, гипертермию, апоптоз, воздействие медиаторов воспаления, молочной кислоты (окислительный стресс) и некоторые другие обстоятельства [1].

Гомеостаз сухожилий является результатом постоянного процесса ремоделирования, связанного с действием матричных металлопротеиназ (ММП) и тканевых ингибиторов металлопротеиназ (ТИМП), влияющих на образование нового внеклеточного матрикса и производство коллагена I типа [2].

Металлопротеиназы – это семейство из 24 цинк-зависимых эндопептидаз, способных разрушать внеклеточный матрикс. Описывают их участие в нормальных и патологических процессах организма, таких как заживление ран, восстановление мягких тканей после повреждений, эмбриональное развитие плода, пародонтит, метастазировании опухолей, дегенерация межпозвоночных дисков. Естественными эндогенными молекулами, способными обратимо блокировать действие ММП, являются тканевые ингибиторы металлопротеиназ [3].

В настоящее время дисбалансу ММП уделяется все большое значение в патогенезе тендинопатий [1].

Общепринятые методы лечения тендинопатий предполагают использование нестероидных противовоспалительных препаратов, которые оказывают патогенетическое действие только в начальной острой стадии заболевания, но в дальнейшем проблему изменения структуры и нарушения гомеостаза сухожилий не решают, а лишь маскируют их хронизацию и прогрессирование [4].

Локальное инъекционное введение аутологичной обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП) при отдельных нозологических формах тендинопатий показало обнадеживающие результаты в клинической практике [5, 6]. Ряд исследований свидетельствует о наличии у ОТП способности регулировать содержание внеклеточного матрикса и воздействовать на активность ММП в процессе заживления тканевых повреждений [7, 8]. Однако, на данный момент, не существует достаточного количества экспериментальных работ, способных продемонстрировать влияние ОТП на ММП при тендинопатии.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Оценить экспрессию матричных металлопротеиназ в ткани пяточного сухожилия в условиях экспериментальной тендинопатии и под влиянием локального введения аутологичной обогащенной тромбоцитами плазмы.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование носило экспериментальный характер и включало работу с лабораторными животными. Все требования, изложенные в Правилах лабораторной практики (GLP), «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985) и приказе Минздрава РФ от 19.06.2003 № 267 «Об утверждении правил лабораторной практики», были соблюдены.

В исследование вошли 20 половозрелых крыс линии Wistar массой 250–350 г, манипуляции с которыми выполняли под общим обезболиванием препаратом «Рометар» (Bioveta, Чешская Республика).

Лабораторные животные были разделены на 5 групп (Г1-Г5) по 4 крысы в каждой группе. Первая группа (Г1) являлась контрольной и оставалась интактной на протяжении всего исследования. Животным остальных групп (Г2-Г5) осуществляли моделирование тендинопатии пяточного сухожилия путем внутри- и околосухожильного введения 0,5 мл 10%-й суспензии стерильного талька в течение 6 недель кратностью по 2 инъекции в неделю.

После формирования модели тендинопатии животным экспериментальных групп выполняли инъекции 0,2 мл сравниваемых препаратов в область пораженного сухожилия. В Г2 вводили физиологический раствор NaCl, в Г3 – ОТП, в Г4 – препарат гиалуроновой кислоты (ГК) «Русвиск» (Россия) 1,6 % с молекулярным весом 3–3,5 × 10⁶ Да, в Г5 – комбинацию ОТП и ГК. В каждой группе было выполнено 3 инъекции с интервалом в 1 неделю, а в Г5 – 2 инъекции ОТП и 1 инъекция ГК. Все вышеуказанные препараты, а также суспензию стерильного талька на этапе моделирования тендинопатии вводили в область сухожилия на 0,5 см от места его прикрепления к пяточной кости (табл. 1).

Для получения ОТП забирали 1,2 мл цельной крови из бедренной вены животных в шприц с предварительно набранными 0,4 мл 5%-го раствора цитрата натрия и затем использовали методику двойного центрифугирования (рис. 1).

На протяжении всего периода экспериментального исследования, начиная с формирования модели тендинопатии и затем последующего лечения, осуществляли тщательное наблюдение за животными: отмечали изменения общего состояния, локальные изменения в области инъекций, степень участия вовлеченной конечности в нагрузке и движениях.

По прошествии недели с момента выполнения последней лечебной инъекции животным Г3–Г5, через 4 недели после завершения моделирования тендинопатии в Г2 и спустя 10 недель с момента начала эксперимента в Г1 животных выводили из исследования введением летальной дозы препарата «Рометар». Конечной точкой эксперимента во всех группах животных явились 10 недель.

Таблица 1

Характеристика животных и экспериментальных групп

Порода животных	Крысы линии Wistar
Возраст	Половозрелые
Масса, г	265,0 ± 2,2
Вводимый препарат	10%-я суспензия стерильного талька, 0,5 мл	0,9%-й раствор NaCl, 0,2 мл	ОТП, 0,2 мл	ГК, 0,2 мл	ОТП + ГК, 0,2 мл
Группа 1 (Г1)	–	–	–	–	–
Группа 2 (Г2)	+	+	–	–	–
Группа 3 (Г3)	+	–	+	–	–
Группа 4 (Г4)	+	–	–	+	–
Группа 5 (Г5)	+	–	–	–	+
Сроки выведения животных из эксперимента, недели	–	10	10	10	10

Примечание: NaCl – физиологический раствор, ГК – гиалуроновая кислота, ОТП – обогащенная тромбоцитами плазма, ОТП + ГК – обогащенная тромбоцитами плазма + гиалуроновая кислота

Рис. 1. Этапы получения ОТП и введение плазмы в область пяточного сухожилия

Для иммуногистохимического исследования изготавливали парафиновые срезы толщиной 4 мкм. Высокотемпературную демаскировку антигенных детерминант проводили в соответствии с рекомендациями фирм производителей антител. В качестве первичных антител использовали моноклональные и поликлональные антитела к ММП1, ММП9, ММП19 (Cloud-Clone Corp., Китай) и моноклональные антитела к ТИМП1 (Cloud-Clone Corp., Китай) в разведении 1 : 100. Инкубацию срезов с первичными антителами проводили во влажной камере в течение 1 часа. В качестве визуализирующей системы использовали полимерный комплекс N-Histofine Simple Stain MAX PO (Nichirei Biosciences, Inc., Япония). В качестве хромогена выступала субстратная система N-Histofine DAB-3S kit (Nichirei Biosciences, Inc., Япония). Затем препараты докрашивали гематоксилином Карацци (БиоВитрум, Россия) и заключали в монтирующую среду (Bio-Mount, Bio-Optica, Италия). Использовали позитивные и негативные контроли. Оценку изменений уровня экспрессии антител определяли путем оценки интенсивности окрашивания в баллах от 0 до 3 (0 – иммунонегативная реакция; 1 – слабо выраженное окрашивание; 2 – умеренно выраженное окрашивание; 3 – максимально выраженное окрашивание). Микропрепараты исследовали с помощью микроскопа Axio Lab. A1 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Германия), фотодокументирование осуществляли камерой AxioCam 105 color (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Германия).

Статистический анализ проводили с использованием программы StatTech v. 2.8.8 (ООО Статтех, Россия). Количественные данные описывались с помощью медианы (Me) и нижнего и верхнего квартилей (Q₁ – Q₃). Различия между группами оценивали по критерию Краскела – Уоллиса и считали статистически значимыми при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В микропрепаратах сухожилий лабораторных животных из Г1 с использованием антител против ММП1, ММП9, ММП19, ТИМП1 в цитоплазме фибробластов и фиброцитов отмечалась слабо выраженная экспрессия иммунореактивного материала (ИРМ) (1 балл). Клетки воспалительного инфильтрата отсутствовали. Данные результаты соответствовали картине нормального состояния сухожильной ткани (рис. 2).

Рис. 2. Гистологическое строение сухожилия крысы из группы: А – иммуногистохимическое исследование антитела против MMP1, докраска гематоксилином Карацци (ув. × 400), Б – иммуногистохимическое исследование антитела против MMP9, докраска гематоксилином (ув. × 400)

При анализе материала из Г2 в цитоплазме отдельных теноцитов отмечалась умеренно выраженная цитоплазматическая экспрессия ИРМ (2 балла). Также в тканях присутствовал воспалительной инфильтрат, который был представлен преимущественно лимфоцитами и гистиоцитами с небольшим количеством гигантских многоядерных клеток инородных тел. В данном инфильтрате наблюдалась выраженная (ММП1, ТИМП1) и умеренно выраженная (ММП9, ММП19) цитоплазматическая экспрессия ИРМ (3 балла и 2 балла соответственно). Увеличение степени экспрессии ИРМ, по сравнению Г1, за счет увеличения степени экспрессии в цитоплазме фибробластов и фиброцитов, а также наличия клеток воспалительного инфильтрата и цитоплазматической экспрессии ИРМ характеризовала состояние ткани сухожилия при экспериментальной тендинопатии, смоделированной путем введения 10%-й суспензии стерильного талька.

В исследовании тканей сухожилий из Г3 с использованием антител против ММП1, ММП9, ММП19, ТИМП1 экспрессия ИРМ носила мозаичный характер: в части фибробластов и фиброцитов наблюдалась в основном слабая цитоплазматическая экспрессия ИРМ (1 балл), а в части клеток – отсутствие ИРМ (0 баллов). В воспалительном инфильтрате присутствовала умерено выраженная (МПП1, ТИМП1) и слабо выраженная (МПП9, МПП19) экспрессия ИРМ (2 и 1 балл соответственно).

Схожая иммуногистохимическая картина отмечалась и в Г4, однако экспрессия ИРМ в воспалительном инфильтрате была несколько выше (2 балла).

В исследовании образцов тканей из Г5 с использованием антител против МПП1, МПП19 в цитоплазме фибробластов и фиброцитов наблюдалась слабо выраженная экспрессии ИРМ (1 балл). При использовании антител против МПП9 в цитоплазме фибробластов и фиброцитов иммунонегативной реакции не определяли (0 баллов). В единичных клетках воспалительного инфильтрата имела место умеренно выраженная цитоплазматическая экспрессия ИРМ (2 балла), но при использовании антител к ТИМП1 отмечалась слабо выраженная цитоплазматическая экспрессия ИРМ (1 балл) (рис. 3).

В целом, полученные результаты в Г3, Г4 и Г5 демонстрировали достоверное снижение экспрессии ИРМ в цитоплазме теноцитов и клетках воспалительного инфильтрата по сравнению с Г2 (табл. 2).

Выявленное в нашей экспериментальной модели повышение активности матричных металлопротеиназ, дезорганизация коллагеновых волокон и увеличение концентрации клеток в ткани сухожилия подтвердили ее достаточное приближение к известной форме заболевания сухожилия – тендинопатии с современной интерпретацией патогенеза и адекватность для решения поставленных в исследовании задач [2, 3].

Инъекционное введение ОТП в область смоделированной тендинопатии (Г3), гиалуроновой кислоты (Г4) или их последовательного сочетания (Г5) приводило к изменениям иммуногистохимической картины ткани. В результате происходило снижение экспрессии ИРМ в цитоплазме теноцитов и клетках воспалительного инфильтрата, по сравнению с картиной, наблюдавшейся в микропрепаратах у животных с тендинопатией из Г2, которым никаких манипуляций не проводили.

Рис. 3. Гистологическое строение сухожилия крысы из группы 1: А – иммуногистохимическое исследование антитела против MMP1, докраска гематоксилином Карацци (ув. × 400), Б – иммуногистохимическое исследование антитела против MMP9, докраска гематоксилином (ув. × 400)

Таблица 2

Показатели оценки интенсивности окрашивания микропрепаратов в исследуемых группах животных

Показатель	Категории	Суммарный балл оценки интенсивности окрашивания			p
Показатель	Категории	Me	Q₁–Q₃	n	p
Исследуемые группы	Г1	1	1–1	4	0,002* p_{Г٢ – Г1} = 0,001 p_{Г٥ – Г٢} = 0,045
	Г2	11	11–11	4
	Г٣	8	6–8	4
	Г4	8	8–8	4
	Г٥	5	5–5	4

* Различия показателей статистически значимы (p < 0,05).

Объяснение большинству полученным в нашем исследовании описательным и метрическим данным заключалось в ряде взаимосвязанных биологических эффектов, развивающихся в сухожилии и окружающих его тканях под влиянием ОТП – противовоспалительном, тендопротективном и репаративном [9, 10].

Противовоспалительные свойства ОТП, обусловленными, главным образом, факторами роста, содержащимися в α-гранулах тромбоцитов, оказали регулирующее воздействие на баланс матричных металлопротеиназ, снизив их активность в Г3 в сравнении Г2. Также отмечалось улучшение структуры сухожилий, проявившееся в снижении уровня дезорганизации коллагеновых волокон.

В качестве ортобиологического препарата для сравнительной оценки модифицирующих структуру ткани сухожилий свойств ОТП животным Г4 в область тендинопатии вводили ГК. Данный выбор связан с наличием известного противовоспалительного действия ГК и способности стимулировать синтез протеогликанов – одного из компонентов матрикса ткани сухожилия [9]. Результатом проявления этих свойств на клеточном уровне явился отмеченный в нашем исследовании тендопротективный эффект ГК. Уровень экспрессии иммунореактивного материала у животных Г4 после введения ГК был выражен в меньшей степени по сравнению с экспрессией в Г2 и соответствовал иммуногистохимической картине сухожилий после инъекций ОТП.

Дезорганизация матрикса у животных Г4 и Г5 была выражена несколько в большей степени, чем после инъекций ОТП в Г3. Однако, принимая во внимание наиболее низкий уровень экспрессии иммунореактивного материала в группе после последовательного введения ОТП и ГК, можно высказать предположение о продолжающемся ремоделировании ткани. Весьма вероятно, что дальнейшее упорядочение структуры сухожилия у животных Г5 наступает в более отдаленный период времени, чем обозначенные в нашем исследованием конечные сроки эксперимента.

Таким образом, на основании проведенного экспериментального исследования можно констатировать, что ОТП в качестве «монотерапии» или в сочетании с ГК, введенная в область пяточного сухожилия в условиях экспериментальной модели тендинопатии, обладает противовоспалительным эффектом, способствует сохранению и, возможно, восстановлению нарушенной структуры сухожильной ткани.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Экспериментальная модель, основанная на введении в область пяточного сухожилия крысы 0,5 мл 10%-й суспензии стерильного талька в течение 6 недель по 2 инъекции в неделю, характеризуется возникновением иммуногистохимических признаков тендинопатии – увеличении экспрессии матричных металлопротеиназ в цитоплазме фибробластов и фиброцитов, дезорганизации коллагеновых волокон, увеличении концентрации клеток в ткани сухожилия и образовании воспалительных инфильтратов.

Введение ОТП в область пяточного сухожилия в условиях экспериментальной тендинопатии снижает уровень экспрессии матричных металлопротеиназ и, тем самым, сохраняет структуру сухожильной ткани, демонстрируя тендопротективные свойства.